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Neuroscience

神经元共培养与单细胞精度的制备

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

协议的单神经元微排列和水掩蔽生物材料涂层在芯片血浆图形描述。高度互联共培养可以使用最小的单元格输入做好准备。

Abstract

该Campenot室的微流控实施方案已经从神经科学界引起了极大的兴趣。这些互连的共培养平台,可用于调查的各种问题,跨越发育和功能性神经生物学感染和疾病传播。然而,传统的系统需要显著蜂窝输入(几千每隔室),不足用于研究低丰度细胞,如初级多巴胺能黑质,螺旋神经节,和果蝇黑腹果蝇的神经元,以及不切实际的高通量实验。密集的文化也备受本地纠缠,很少有副产物(<10%)互连的两种文化。在本文中简单的微流体和图案化的协议,描述了解决这些问题:(ⅰ)一种微流体的单神经元排列方法,以及(ii)水掩蔽方法为等离子体图案形成生物材料涂层来REGISTER神经元,促进车厢之间的产物。简约神经元共培养物制备了高水平(> 85%)intercompartment连接和可用于高通量神经生物学实验用单细胞精度。

Introduction

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神经元组织是高度复杂的;即在空间中定义的图层和车厢,并用塑料连接通过细胞接触,特别是通过轴突和树突的副产物有序异质细胞的混合物。新技术必须赋予更大的自由度实验获得更深刻的见解和中央疾病,发展,健康功能绎机制。在Campenot室1,2和最近微细加工的实施例3,4可用于体外制备网络的神经元共培养物中以有选择地扰乱不同体细胞种群以及它们的轴突的副产物的能力。这些微流体装置已经例如被用于研究轴突变性和再生下述化学5,6或激光干切断6-8,τ病变9,病毒传播10,11,和mRNA定位于轴突4。

耳鼻喉科“>

为了延长神经生物学家的覆盖范围,技术的发展需要编制简约神经元共培养。这使得神经网络的系统的单细胞​​和亚细胞精确调查的解缠结。为最小的细胞数目的要求打开来分析罕见的细胞类型,包括相关的帕金森氏病,从耳螺旋神经节,外周神经元的多巴胺能黑质细胞和干细胞的可能性。除此之外,蜂窝经济是相关的3R的主动权。使用这些微流体平台,大规模毒性帘或其他高吞吐量,数据丰富实验系列需要的动物的神经元现在可以考虑。

在本文中用于微流体装置的制作和使用的协议中说明。在原位 biomateri与微流控组合排列人的图案形成方法可用于使用最小细胞数目高度互连的神经元共培养物的登记。微流排列是基于差分流量的方法12-15,由此微陷阱被定位在流体回路(沿着与图1中的SEM图像示出)。路径0→1具有较低的流体阻力(R 2> R 1)运送到神经元的微结构化孔的线性阵列-入口到神经突向外生长频道。由一个单细胞的陷阱占用本地阻碍了流动转移的流线对邻国陷阱诱捕随后的细胞。在阵列中的陷阱完全占用切换流体比(R 1> R 2)的流线转移到蜿蜒路径(0→2),以产生动作的旁路模式以除去过量的神经元。


图1微流控电路。 A)差分电阻流体回路单神经元排列,与侧翼由轴突生长的渠道互联文化室,B,双层隔离的神经元共培养阵列与半月板钉扎micropillars权证的SEM图像。有了这个设计,三叉形神经元诱捕结构被用于促进神经突起的副产物的颤动。图与传奇再现英国皇家化学学会(RSC)的许可12。 点击这里查看大图。

微图案神经网络对平面衬底的制备可以很容易地实现(对于为例从我们的ES组,见Frimat 16海克 17)。然而,在PDMS装置和与这些微米级的对准到微流体通道的要求包封生物活性材料图案构成了一个很大的技术挑战。在第3.1节中的协议为在芯片上,或原位制备的生物材料型态呈现。这些模式在漫长的文化时间表使神经元的登记和促进车厢之间的副产物。弯液面钉扎的微观结构是用来校准一个所谓水掩模与神经元的排列位点和神经突长出频道。水掩模保护粘附分子涂层中的等离子体处理,而暴露的表面被分解,以确定该生物材料的图案。此外,提供了用于细胞培养和对所需的不同共培养室的选择性治疗流体隔离协议。

ve_content“>该协议旨在利用软光刻技术的人性化原则聚的复制二甲基硅氧烷(PDMS)微流控装置18。同样, 在原位生物材料的图案很简单,利用蒸发和表面张力的现象,只有需要一种廉价的手持式等离子体源的微流体回路有效方案小区负载和隔室进行这些操作的特定处理简单地分配材料到正确的底部端口和从上述吸移的问题。以这种方式,它的目的是提供对神经生物学家自由地在自己的实验室准备和使用微流体装置。

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Protocol

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该协议适用于神经科学家,并总结在图2。因此,它是推荐使用的PDMS复制的SU-8的主人是微细加工外包给商业或公共机构设施。这两个图层蒙版的设计是可自由查看的是对化学网站12皇家学会补充资料(邮政编码)。重要的是,第一SU-8层应该被制造为2.5-3.0微米的深度,并且第二至25-30微米的深度。这些都是必要的有效的神经元排列关键维度。在3微米的高度限制也是必要的,以防止神经元被输送或迁移的两个隔室12之间。

在PDMS 1。微流控设备复制

  1. 与固化剂(184)充分混合的PDMS预聚物以10:1的比率,并在真空干燥器中通常20分钟脱气混合物。另外,把混合TURE在50毫升Falcon管中,并使用低克 离心脱气。
  2. 将2层的微结构的SU-8的晶片在80℃下加热板和对准聚合物帧到晶片上的每个设备。倾PDMS入帧≥5毫米的深度,并允许> 1小时以确保完全热固化。
  3. 一旦固化,从电炉取出晶片,并使其冷却在一个平面上。
  4. 与刚性手术刀轻轻撬开框架和PDMS从硅片佩戴防护眼镜和工作从一个角(离SU-8微结构)。
  5. 从框架中取出硅橡胶模具,并使用剪刀来修剪多余的PDMS的设备。这个所谓的闪烁通常时产生的PDMS薄膜的聚合物框架和晶片表面之间传播。
  6. 其余的PDMS可以应用到整个晶片和固化存储期间保护晶片。之前,后续的设备成型取出这一点,并在这样做去除任意p从表面上表达的污染物。

2,设备组装和互连

  1. 使用3毫米直径的活检穿孔准备6接口端口。在一个漆黑的表面工作,在良好的光线条件和朝上,以帮助端口对准与微流体通道的微结构化特征。
  2. 检查装置,用于微粒。使用可逆胶带移除。
  3. 微流体回路是使用安装在玻璃盖玻片上的薄的PDMS层包封的:这些是​​由浇注PDMS的固化剂混合物(10:1,601)的一小体积(约0.5毫升)上的柔性基底制备细菌学级培养皿。轻轻按压盖玻片上的PDMS层,放在烤盘和热固化几分钟。快速冷却后,用手术刀切出和奖金盖玻片-PDMS双层从培养皿中。如有必要,用剪刀修剪。
  4. 等离子债券的PDMS设备和支撑层,以产生良好的密封:最佳条件是特定的仪器。例如,等离子炉中在70瓦和40千赫在0.2毫巴的氧气氛中进行40秒的操作产生优秀的PDMS-PDMS键。一旦等离子体处理,可以同时按下两个部分组合在一起,留下了一分钟,充分结合。
  5. 使用硅胶管(1.6 mm内径;3.2毫米OD)与泵和注射器接口。

3,生物材料和图案化微流控操作

原位生物材料图案化,神经元培养和流体处理的协议为示于图2。

图2
图2。画报微流体协议。 A)PL 和PLL-G-PEG图案 ;此外,细胞的粘附层( 例如 ,PL,绿色),与蒸发产生对准水面膜二)暴露PL的大气等离子体处理;两个天线引脚使用,用图示用粉红色的明星。C)的PBS(蓝色)由抽吸冲洗是用来避免污染等离子体处理过的区域用PL D)交货PLL-G-聚乙二醇(红色的等离子导入天线)由愿望外套等离子体处理过的区域E) 小区负荷 ;神经元的同步微排列到两个侧翼舱吸,采用了静压驱动流G) 流体隔离治疗 女性)媒体(粉红色)灌注;测试剂(黑色)的外周治疗误吸和H)由吸入底部的中央进气送到中央处理从底部旁侧入口交付。图与传奇再现英国皇家化学学会的许可(RSC)12。 点击这里查看大图。

紧随等离子体结合的PDMS微流体通道具有高度的亲水性(接触角≤5°)。这样的表面是适合的细胞系,例如分化的人SH-SY5Y神经元样细胞的粘附和培养。为原代神经元和神经元前体细胞系,如隆德人类脑细胞系(LUHMES)多胺涂层,无论是聚赖氨酸(PL)或聚鸟氨酸(PO)的培养物的离体培养,需要作为静电锚。除了粘附蛋白如层粘连蛋白或纤连蛋白通常需要作为整联接口涂层。然而,PL和PO涂料容易结合神经,阻碍了微流体输送到数组的网站,也不必要施加剪切应力。为了解决这个问题,在芯片上的生物材料图案是需要材料的粘附在陷阱站点和生长微本地化。这也促进了室间连接的发展,降低当地的纠缠。该协议还包括添加的PEG材料以相邻区域,以确保蛋白质和神经元长的培养过程中被限制到所需的位置。下面的协议是记录在图3:

图3
图3。水等离子体镂花掩蔽的生物材料的图案。 A)插图水掩模工艺与PDMS micropillars钉扎水半月板到位等离子镂花的。在垂直平面内的弯液面的曲率已被忽略不计。 乙)水掩模由弯月p可视化用红色染料和定位一局。 三)图案PL-FITC涂层等离子制版。经过D成像增加蛋白质的排斥和细胞驱蚊PLL-G-PEG-TRITC到等离子图案PL-FITC涂层。这是用于SH-SY5Y细胞的登记和也用于图案化的附加层粘连蛋白为LUHMES细胞。图与传奇再现英国皇家化学学会(RSC)的许可12。 点击这里查看大图。

  1. 水屏蔽原位生物材料图案等离子喷码机
    1. 0.5μL体积的PL或PO(100微克/毫升的1X PBS)的进入底部中心港口后不久等离子体结合吸管。在几秒钟内物质在整个微流体回路通过毛细管作用填充。离开了几分钟,充分外套亲水性的PDMS表面的多聚腺苷酸地雷。
    2. 通过抽吸驱动的洗涤用1×PBS去除未结合的聚胺分子(参见图2C),持续1分钟。
    3. 从端口卸下所有的PBS和照明用显微镜加热装置。这从快速补水面膜形成的端口增加了蒸发。水掩模( 如图3A所示,并记录在图3B)被内〜5分钟建立。
    4. 通过显微镜检查设备,以确保水的屏蔽是完整的。请注意储器结构阵列位点的上游包括在掩模设计来延长水掩模(〜15分钟)的稳定性。
    5. 插入不锈钢针插入口( 图2B)。这些被用来偶联通过常压手持式电晕放电或特斯拉发生器产生的等离子体( 例如 ,运行在2兆赫,30千伏信号)19,20到空微流体通道。点T的前端他等离子体源接近1针和血浆的前端处理微通道为≤1秒。使用低光照条件下,观察血浆图案。
    6. 用洗涤步骤去除水中的面具。从上面3个端口使用并行愿望。使用硅胶管由4路转接器抽吸泵连接4相同长度,实现并行愿望。开始抽吸和分配的PBS进入底部3个端口通过微流体电路绘制的PBS。以这种方式PDMS-聚胺材料的对比度产生(参见图3C)。从微流体电路撤离的PBS,离开几个小时,以恢复原生,疏水状态。这使得该PDMS完全非允许细胞粘附。
    7. 应该附加的粘附材料,如层粘连蛋白或纤连蛋白,需要除去水掩模之后立即需要执行以下的步骤和要做到:移液器的接枝共聚物聚-L的10微升体积-赖氨酸-聚(乙二醇)(PLL-G-PEG,100微克/毫升,溶于PBS中)到两个底部侧翼通道,接着从2分钟的上侧翼通道抽吸。
    8. 在不中断的流动,通过用PBS缓冲液交换除去过量的PLL-G-PEG。这个选择性地涂覆在非聚胺涂覆的区域用PEG部分作用,以防止蛋白质吸附和细胞粘附17,21。
    9. 粘附蛋白如层粘连蛋白或纤连蛋白可以被共同定位与聚胺涂层:这些ECM蛋白(通常为10微克/毫升)的移液管加入10μl体积为所有三种底部端口。吸出物从顶部的三个端口,直到该设备填充有蛋白溶液孵育1小时,以产生良好的品质的涂层。
    10. 通过从底部3口吸的PBS中取出多余的蛋白质。
  2. 微流控单神经元组阵
    1. 总理与批设备吃了媒体。加入20微升体积的底部的3个端口,并通过从上三个端口并行抽吸迅速填满微流电路与媒体。通过等长的硅胶管采用4路油管接头耦合的3上端口的愿望泵。
    2. 加入20微升的分类细胞悬液(1×10 6个细胞/ ml)以每一个侧翼吸入口(0,在图1中)。
    3. 装备一个愿望泵流量调节器或使用注射器从上3个端口温柔的愿望。完整的神经元排列通常需要1分钟。
    4. 收获残留在用移液管,用于排放在随后的微流体装置的4口侧翼过量的神经元。
    5. 拆下油管。填写所有端口,媒体和设备放置在孵化器。在几个小时的细胞变得完全附着在生物材料上的图案。
  3. 神经元培养,选择性射流治疗和免疫nostaining
    1. 通过定期灌注用流体静力进(2毫米柱的高度差是适当慢)交换媒体。
    2. 可替换地,浸没在介质中的微流体装置中,定期地交换介质(2-3天),与标准的细胞培养物。
    3. 选择性的流体处理,以任一神经元培养室或中央神经突向外生长隔室被实现如下:取20微升的测试物质的进入所关心的信道的底部端口,并从该端口的正上方抽吸。为冗长的治疗减少使用流量调节器的流量,并根据需要补充试验物质。
    4. 免疫组化协议各有不同,每个分子靶点和相关试剂。为了反击的剪切诱导损伤缓慢流速使用的神经细胞的潜在风险。这会导致增加的应用时代,充分灌注系统,延长正常的协议倍。 HY使用的端口具有不同柱高度( 例如 ,2毫米)drostatic灌注用于传递试剂。更快速试剂的添加和删除用泵可以用来减少实验的时间尺度。连接一个愿望泵上部3口从底部3个端口吸取试剂。

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Representative Results

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水屏蔽攻击表面张力。在空气 - 液体界面的压力耐受性成反比带的曲率[半径 ,生产高度稳定的接口在微尺寸。该micropillars有效锚定水面膜到位。补水面膜的形成是从微端口驱动的蒸发,随着速度提高加热。从低倍(4X - 10X)使用热显微镜照明,水面膜通常是建立在≤5分钟。蒸发也导致了水掩模的最终倒塌。增加水面膜的一辈子〜15分钟(实际为等离子制版),18 NL水库结构已被定位在培养室的上游。水面膜的形成和崩溃的速度可以变化,和间歇性的观察,建议确定一个合适的时期外周血Treatment。然而,多个设备可同时制备。

等离子镂花需要大约1秒。使用冗长的处理汽化的水掩模,导致多胺涂层的过度等离子体崩解。有时不足等离子体处理的结果,留下完好的多胺涂层在相邻微通道壁(参见图3D),可以支持神经元的粘附12。然而,摆着小鼠皮层神经元有89.5%12 6天以下的文化构图效率。这效率相当于PL / PEG在平面基板图案。生物材料的图案具有促进副产物进入轴突微通道的进一步优点。与生物材料图案化的副产物中〜90%的微通道的扩展,而用连续聚胺涂料产物水平降低至〜70%。使用皮质神经元,是必需的长大了7天,芯片文化部份效果跨越两个隔室(500微米的距离)。分化的人类的SH-SY5Y神经细胞有较高的生长速率,在4-6天建立连接。皮质,LUHMES和SH-SY5Y神经元已经培养了长达2周。这是足够长为自发的电生理功能来实现,并且可以通过Ca 2 +的成像来间接测量。这将验证该生物材料和图案排列的微流体方法,建立功能性神经元网络的广泛适用性。

弯月面钉扎结构做,但是,促进神经突起的纠缠( 见图4C)。边缘发现是在轴突微面22培养的一个共同特征。为了防止这种纠缠,进一步促进室间连接的形成,弯月面钉扎柱子可以合并与微通道壁( 不再是自由站立)。此外,副产物在中央微流体通道可以杂乱无章。对于需要线性连接的实验中,中央通道可以被删除(见亭 12,补充资料的光罩设计)。此电路需要在第一隔室的串行排列,接着对细胞粘附或所谓的蜂窝式阀门14来呈现该电路在容许在第二隔室排列的细胞一段时间( 例如 ,4小时)。

微流体电路提供预编程的流体操作。不同的功能可通过端口选择确定以加载试剂或接口管或提示。这避免了需要复杂的,昂贵的和空间要求的反馈控制仪表,使该技术的神经生物学家非常方便。电路设计是关键取决于尺寸相对最优实现微流体排列12-14。微小的变化能防止CIR从运作CUIT,因此,我们建议的初步协议采用,使之可自由查看的设计12使用。一个最佳的电路,微流控单个神经元的排列是快速,具有〜100个神经元排列在每个培养室,在不到1分钟。尽管神经元的数量有限,局部密度仍相当于标准培养物,以提供足够的生命支持信令水平。由于记录在图4B这种方法有效地产生每陷阱1神经元(1.14±0.09)12。然而,并非所有的神经元的排列。微流体电路产生平行的流线,这样,在到达层流的外部区域的神经元持续蛇形通道。尽管如此,提出了系统的10-100倍,比现有的条块分割系统更经济与细胞。被开除学籍的细胞可以从港口和油管有所收获。在未来的设计中,上游确定性的侧向位移结构体23可以用于偏转所有细胞分化成的排列简化为绝对蜂窝经济。

图4
图4。微流控神经元排列。 A)用注射器手动抽吸用于温和神经元排列。一个4路油管接头用于连接与上3个端口同时进行神经元排列在两个车厢注射器B)分化的神经元样人的SH-SY5Y细胞和其他神经元的排列与单细胞的精度(每陷阱一个神经元),c)在培养5天后,轴突延伸互连两种文化。细胞核用DAPI染色和肌动蛋白免疫染色用于可视化的副产物。修饰身材和传奇再现英国皇家化学学会(RSC)的许可点击这里查看大图。

条块分割系统的一个关键特性是有选择地把个别的细胞群,调查材料贩运和远距离信号的能力。但是,在文献中可用的方法有两种不足以流体隔离或描述很差。我们已经开发了流体分离方法可以快速交付(<测试物质和长期流体隔离1分钟)(> 1小时)12。结果记录在图5中 ,这个功能是可能的电路设计的组合,并通过使用抽吸以提供测试物质。这是相对于流体喷射用的由流体静力进给任一注射泵。尽管突起生长通道中高流体阻力,这些方法产生的对流路径吨帽子迅速分散试验物质和污染整个设备。从上端口的愿望也与流体相互作用,整个电路(一个功能中央对微分电阻排列原则)。然而,在这种操作模式下,介质被从电路中的其他地方的绘制来稀释测试物质,而不是分散的。给出的极端流体阻力的神经突长出的通道(相对),稀释的程度不大。对于实验将会导致建立扩散梯度,抽吸方法可以用来选择性地把一个隔室,以用于启动化学梯度的随时间变化的演化流停止。

图5
图5。选择性流体处理。 A)吸气驱动的选择性吨治疗他中央和B)侧翼车厢。箭头表示用于抽吸单端口。处理建立在1分钟(红色线)和被保持为实验的持续时间; 60分钟(蓝线)。修饰身材和传奇再现英国皇家化学学会(RSC)的许可12。 点击这里查看大图。

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Discussion

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微流体组阵技术的先河,使精密单神经元的处理,建立简约的文化。再加上原位生物材料的构图方法,一种强大的方法,以使细胞形态与微结构,这些简约的文化有很高intercompartment连接水平与减少当地的纠缠。这些特征可以被用于室间传输的效率的研究,并且具有简单的设计修改必须分离单个轴突用于可视化和定量分析的潜力。例如,在下一代设计三叉戟结构可以与每个神经元长出1通道所取代,以减少多个轴突形成束的概率。这些功能可以大大有利于多种神经科学应用,包括;纳米颗粒的毒性24和 ​​锰传播25,活动同步chronization在癫痫症,传染性病原体如朊病毒26日 ,在阿尔茨海默病淀粉样蛋白(抗体)的传输,并且在帕金森病27的α突触核蛋白的传播。

微流体排列方法的另一个明显的好处是开展研究与低丰度的神经元亚群,而不是复杂的异质文化的能力。例如,适合于帕金森氏研究或外周神经元只能被隔离在小数字多巴胺能黑质神经元仍然足够用于使用微流体平台复制的研究。其他罕见的细胞应用的例子包括利用毛细胞共培养螺旋神经节神经元的实验装置听力损失的基础上的调查,或利用诱导多能干细胞来自人类的研究。同样,该系统的低电池需求使其随时可以从微型果蝇果蝇大脑的神经元28进行实验,从而利用这个强大的遗传模型的好处。

另一个角度是移动经济和小的设备尺寸,使高吞吐量研究管理的实用主义。每个条件和重复需要极少的神经元,也可用于大幅降低与持续3R的举措兽行号的功能。例如,可以使用一个单一的动物进行化合物的大面板的剂量响应分析。屏幕类型包括毒性测试和siRNA或药物制剂为他们的远距离贩运和信号转导作用的图书馆的调查。综上所述,所描述的协议延长实验河段的神经科学家,提供了潜在的能够提供高吞吐量,定量和统计盟友强大的数据单和亚细胞分辨率。这一点,在神经科学领域的其他许多伟大的事态发展将导致新的见解的机制基本神经元的发育和功能,以及引起疾病的病理过程。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

作者感谢乌尔里希Marggraf(ISAS)的SU-8制作和玛丽亚·贝克尔(ISAS)的扫描电镜成像。这项研究是由财政德意志研究联合会(DFG WE3737/3-1),一个Bundesministerium献给教化UND Forschung补助(BMBF 0101-31P6541)及的ministerium献给创新,Wissenschaft UND Forschung des Landes酒店北莱茵 - 威斯特法伦支持。海克Hardelauf感谢国际莱布尼茨研究生院“系统生物学实验室在一个芯片”的金融支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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神经元共培养与单细胞精度的制备
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Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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