Summary
פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.
Abstract
התגלמויות microfluidic של חדר Campenot משכו עניין רב מהקהילה מדעי המוח. פלטפורמות שיתוף התרבות מחוברות אלה יכולים לשמש כדי לחקור מגוון של שאלות, המשתרע נוירוביולוגיה התפתחותית והתפקודית לזיהום והתפשטות מחלה. עם זאת, מערכות קונבנציונליות דורשות תשומות משמעותיות סלולריות (אלפים רבים לתא), מספיקות לחקר תאי שפע נמוכים, כגון nigra substantia העיקרי דופאמין, גרעיני ספירלה, ונוירונים melanogaster Drosophilia, ולא מעשיות לניסויי תפוקה גבוהה. התרבויות צפופות גם הם הסתבכו מאוד באופן מקומי, עם כמה צמחים (<10%) מקשרות שתי תרבויות. במאמר זה פרוטוקולי microfluidic ודפוסים פשוטים מתוארים בו לטפל באתגרים אלה: (i) נוירון יחיד microfluidic עריכת שיטה, וכן (ii) שיטת מיסוך מים לציפוי בחומר ביולוגי דפוסים פלזמה register נוירונים ולקדם תולדה בין תאים. שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי הוכנו עם קישוריות intercompartment (> 85%) ברמה גבוהה ויכולות לשמש לניסויי נוירוביולוגיה תפוקה גבוהה עם דיוק תא בודד.
Introduction
רקמה עצבית היא מורכבת ביותר; תערובת סלולרית הטרוגנית שמסודרת מרחבית בתוך שכבות ותאים מוגדרים ועם קישוריות פלסטיק באמצעות אנשי קשר סלולריים ובמיוחד באמצעות צמחי האקסון ודנדריט. טכניקות חדשות נדרשות להעניק חופש ניסיוני יותר כדי לקבל תובנות ומנגנונים לפענח מרכזיים למחלות, פיתוח, ותפקוד בריא יותר עמוקים. קאמרי Campenot 1,2 ו 3,4 התגלמויות microfabricated לאחרונה יכולים לשמש להכנת vivo לשעבר של שיתוף תרבויות עצביות ברשת עם היכולת להפריע באופן סלקטיבי אוכלוסיות גופניות השונות וגם בצמחים neurite שלהם. מכשירי microfluidic אלה למשל נעשו שימוש כדי ללמוד ניוון האקסון והתחדשות הבא axotomy הכימי 5,6 או לייזר 6-8, tauopathy 9, הפצה ויראלית 10,11, ולוקליזציה mRNA באקסונים 4.
אף אוזן גרון ">כדי להרחיב את הטווח של neurobiologists, התפתחויות טכנולוגיות נדרשות להכין שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי. זה מאפשר התרת סבך של הרשת העצבית לחקירה של המערכת עם תא בודד ודיוק משנה הסלולר. הדרישה למספרים סלולריים מינימאליים פותחת את האפשרות לנתח את סוגי תאים נדירים, כוללים תאי nigra substantia דופאמין רלוונטיים למחלת הפרקינסון, גרעיני ספירלה מהאוזן, תאי עצב היקפיים, ותאי גזע. מעבר לכך, כלכלה סלולרית היא רלוונטית ליוזמה 3Rs. שימוש בפלטפורמות אלה microfluidic, מסכי רעילות בקנה מידה גדולה או תפוקה גבוהה אחרת, יכולה כעת להיחשב סדרה ניסיונית נתונים עשירים הדורשת נוירונים בבעלי חיים.
במאמר זה בפרוטוקולים לייצור ושימוש במכשיר microfluidic מתוארים. עריכת microfluidic בשילוב עם בbiomateri האתר שיטת הדפוסים אל יכול לשמש לרישום של שיתוף תרבויות עצביות ביניהם ביותר באמצעות מספרי תא מינימאליים. עריכת microfluidic מבוססת על זרימת ההפרש גישת 12-15, לפיה מלכודות microstructured ממוקמות בתוך מעגלים נוזליים (מאויר יחד עם תמונות SEM באיור 1). הנתיב 0 → 1 יש התנגדות נמוכה יותר fluidic (R 2> R 1) להובלת נוירונים למערך ליניארי של פתחי microstructured - פתחי הכניסה לערוצי תולדת neurite. תפוסה של המלכודת על ידי תא בודד באופן מקומי מעכבת את הזרימה להסיט המייעלים ללכידת תאים עוקבים במלכודות שכנות. התפוסה מלאה של המלכודות במערך מתגי יחס fluidic (R 1> R 2) להסיט המייעלת לתוך הנתיב מתפתל (0 → 2) כדי לייצר מצב עוקף של ניתוח לסילוק של תאי עצב עודפים.
ss = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 1. Microfluidic מעגל. א) מעגל התנגדות ההפרש fluidic לעריכת נוירון בודד עם איגוף תאי תרבות מחוברים על ידי ערוצי תולדה neurite. B, תמונות C) SEM של מערך שיתוף תרבות bilayer נוירון הממודר עם micropillars המניסקוס מצמיד. עם העיצוב הזה, מבני השמנה נוירון בצורת קלשון שימשו כדי לקדם fasciculation של צמחי neurite. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) 12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
הכנת רשתות נוירונים micropatterned על מצעים מישוריים בקלות יכולה להיות מושגת (לexampl es מהקבוצה שלנו, רואה Frimat et al. 16 והיקה et al. 17). עם זאת, המתמצת דפוסי חומרים ביו בתוך מכשירי PDMS ועם הדרישה של יישור מיקרומטר בקנה מידה של אלה לערוצי microfluidic מציב אתגר טכני גדול. בסעיף 3.1 פרוטוקול, או באתרם, הכנה של דפוסים ביולוגי מוצג בשבב. דפוסים אלה מאפשרים רישום נוירון בלוחות זמנים ארוכים ולקדם את התרבות בצמחים בין תאים. microstructures המניסקוס-מצמיד משמשים כדי ליישר את מסכת מים מה שנקרא עם נוירון עריכת אתרים וערוצי תולדת neurite. מסכת המים מגנה על ציפוי מולקולת ההידבקות במהלך טיפול בפלזמה, בעוד שמשטחים חשופים הם התפרקו להגדיר את התבנית ביולוגי. בנוסף, פרוטוקולים ניתנים לתרבית תאים ולבידוד fluidic הכרחי לטיפול סלקטיבי של תאי שיתוף התרבות השונים.
ve_content "> הפרוטוקולים נועדו למנף את העקרונות ידידותיים למשתמש של ליתוגרפיה הרכה לשכפול של פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירי microfluidic 18. בדומה לכך, בדפוסים ביולוגי באתר הוא פשוט, תוך ניצול תופעות מתח אידוי ולפני שטח, ורק דורש מקור כף יד זול פלזמה. מעגל microfluidic ביעילות טיפולי טעינה סלולרי תוכניות ותא ספציפיים עושים פעולות אלה פשוט עניין של מחלק חומרים ליציאה התחתונה הנכונה ונשיפה מלמעלה. באופן זה, הוא נועד לתת neurobiologists החופש כדי להכין ולהשתמש במכשירי microfluidic במעבדות שלהם.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים מיועדים למדעני מוח, ומסוכמים באיור 2. ככזה הוא ממליץ microfabrication של SU-8 אדונים המשמשים לשכפול PDMS הוא במיקור חוץ למתקנים מסחריים או מוסדיים. שני עיצובי מסיכת שכבה זמינים באופן חופשי כמידע משלים (ZIP) בחברה המלכותית של אתר הכימיה 12. חשוב מכך, שכבת SU-8 הראשונה צריכה להיות מפוברק לעומק של 2.5-3.0 מיקרומטר, והשני לעומק של 25-30 מיקרומטר. אלה הם ממדים מרכזיים הנדרשים לעריכת נוירון יעילה. מגבלת גובה 3 מיקרון היא גם הכרחית כדי למנוע נוירונים מועברים או נודדות בין שני התאים 12.
1. שכפול מכשיר microfluidic בPDMS
- מערבבים את prepolymer PDMS ביסודיות עם סוכן הריפוי (184) ביחס של 10:1 ודגה את התערובת בייבוש ואקום לבדרך כלל 20 דקות. לחלופין, לשים את התערובתמכשור בצינור פלקון 50 מיליליטר ולהשתמש g הנמוך צנטריפוגה לdegassing.
- מניחים את פרוסות SU-8 microstructured 2 שכבה על פלטה חשמלית 80 מעלות צלזיוס וליישר מסגרות פולימר לכל התקן על פרוסות סיליקון. יוצקים PDMS למסגרות עד לעומק של 5 מ"מ ≥ ולאפשר> 1 שעות כדי להבטיח ריפוי תרמית מוחלט.
- ברגע שנרפא, להסיר את רקיק מהפלטה החשמלית ולהתקרר על משטח שטוח.
- ללבוש משקפי מגן ולעבוד מפינת אחת (מmicrostructures SU-8) עם אזמל נוקשה לפרד בעדינות את המסגרת וPDMS מפרוסות סיליקון.
- הסרת עובש PDMS מן המסגרת ולהשתמש זוג המספריים כדי לחתוך את המכשיר של PDMS העודף. מהבהבים זה מה שנקרא לעתים קרובות נוצר כאשר השכבה דקה של PDMS מתפשט בין מסגרת הפולימר ורקיק פני השטח.
- ניתן ליישם PDMS שנותר לכל רקיק ונרפא להגן רקיק במהלך האחסון. להסיר את זה לפני דפוס מכשיר שלאחר מכן, ותוך כדי כך להסיר כל pלבטא את המזהמים מפני השטח.
2. עצרת התקן וחיבורים
- הכן את יציאות ממשק 6 באמצעות ביופסיה בקוטר 3 מ"מ. לעבוד על משטח כהה, בתנאי תאורה טובים ועם תכונות microstructured כלפי מעלה כדי לסייע יישור של היציאות עם ערוצי microfluidic.
- בדוק את המכשיר לחלקיקים. הסר אלה באמצעות דבק הפיך.
- מעגל microfluidic הוא כמוס באמצעות שכבה דקה PDMS רכוב על coverslip זכוכית: אלה שהוכנו על ידי שפיכת נפח קטן (~ 0.5 מיליליטר) של תערובת סוכן PDMS-ריפוי (10:01, 601) על גבי הבסיס גמיש, צלחת פטרי בכיתה בקטריולוגית. לחץ בעדינות על coverslip על גבי שכבת PDMS, הנח על פלטה חשמלית ותרמית תרופה במשך כמה דקות. במהירות לאחר הקירור, השתמש באזמל כדי לגזור ופרס bilayer coverslip-PDMS מצלחת פטרי. לקצץ במספריים במידת צורך.
- אג"ח פלזמה מכשיר PDMSושכבת תמיכה כדי לייצר חותם טוב: תנאים אופטימליים הם מכשיר ספציפי. לדוגמא, תנור פלזמה פועל ב70 W ו40 קילוהרץ באווירת 0.2 mbar חמצן ל40 שניות מייצר אג"ח PDMS-PDMS מצוין. ברגע שהפלזמה שטופלה, לחץ על שני החלקים ביחד ולעזוב לרגע לאג"ח במלואו.
- השתמש בצינורות סיליקון (ID 1.6 מ"מ; 3.2 מ"מ OD) להתממשק עם משאבות ומזרקים.
3. ביולוגי דפוסים ותפעול Microfluidic
הפרוטוקולים בדפוסים ביולוגי באתרו, תרבות נוירון וטיפולי fluidic הם באיור 2.
איור 2. פרוטוקולי microfluidic אילוסטרייטד. א) PL ודפוסי PLL-G-PEG; תוספת של שכבת הדבקת תא (לדוגמא,PL, ירוק), עם אידוי לייצור מסכת מים המיושרים טיפול פלזמה אוויר האטמוספירה של PL נחשף ב ').; שתי סיכות אנטנה נמצאות בשימוש, עם אנטנת ההקדמה פלזמה מאוירת עם כוכב ורוד. C) PBS (שטיפה כחולה) על ידי שאיפה משמש כדי להימנע מלזהם את האזור שטופלה בפלזמה עם PL. D) משלוח PLL-G-PEG (אדום ) על ידי שאיפה למעייל האזורים שטופלו הפלזמה E) הטעינה נייד.; עריכה סימולטנית microfluidic של נוירונים לשני תאי האיגוף על ידי שאיפה, מדיה F) זלוף (ורוד) באמצעות מונע זרימה ההידרוסטטי G) טיפולי fluidic מבודדים.; טיפול היקפי סוכן מבחן (שחור) של נמסר מהכניסה התחתונה איגוף על ידי שאיפה וטיפול המרכזי H) נמסר מהכניסה המרכזית התחתונה על ידי שאיפה. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה(RSC) 12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
פלזמה מייד לאחר מליטה את ערוצי microfluidic PDMS הן הידרופילי מאוד (זווית מגע ≤ 5 מעלות). משטחים כאלה הם מתאימים להדבקה והתרבות של שורות תאים כגון תאים כמו נוירון מובחנים אנושיים SH-SY5Y. עבור vivo התרבות לשעבר של נוירונים עיקרי והתרבות של שורות תאי מבשר עצביות כגון קו לונד תא mesencephalic האנושי (LUHMES) ציפוי polyamine, או polylysine (PL) או polyornithine (PO), נדרש כעוגן של חשמל סטטי. בנוסף חלבוני הידבקות כגון laminin או פיברונקטין נדרשים לעתים קרובות כציפוי התממשקות-integrin. עם זאת, ציפוי PL וPO קלות להיקשר נוירונים, פוגע משלוח microfluidic לאתרי המערך וגם הטלת מאמצי גזירה לא רצויים. כדי לפתור בעיה זו ביולוגי בשבבדפוסים נדרש למקם חומרי הידבקות באתרי המלכודת וmicrochannels תולדה. זה גם מקדם את ההתפתחות של קשרים בין תא ומפחית את ההסתבכות מקומית. הפרוטוקול כרוך גם בתוספת של חומרי PEG לאזורים שכנים כדי להבטיח חלבונים ותאי עצב מוגבלים למקומות הרצויים במהלך התרבות ארוכה. הפרוטוקול הבא מתועד באיור 3:
איור 3. מים מיסוך לדפוסים ביולוגי על ידי שכפול פלזמה. א) איור של תהליך מיסוך מים עם micropillars PDMS מצמיד המניסקוס המים במקום לשכפול פלזמה. עקמומיות של המניסקוס במישור האנכי הוזנחה. מסכת B) מים דמיינו עם צבע אדום ואת מיקומו על ידי p המניסקוסתוספת סיבוב. C) ציפוי PL-FITC הדוגמת צילם לאחר שכפול פלזמה. ד ') של חלבון שדחה ודוחה תא PLL-G-PEG-TRITC לציפוי PL-FITC בדוגמת פלזמה. זה שימש לרישום של תאי SH-SY5Y וגם לדפוסי שכבת פיברונקטין נוספת לתאי LUHMES. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) 12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
- מיסוך מים באתרו ביולוגי דפוסים ידי פלזמה שכפולה
- זמן קצר לאחר פיפטה המליטה הפלזמה 0.5 μl נפח של PL או PO (100 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS) ליציאת המרכז התחתונה. בתוך עניין של שניות מעגל microfluidic כל מתמלא על ידי פעולת נימים. השאר לכמה דקות למעייל באופן מלא את משטחי PDMS הידרופילי עם פוליהמוקשים.
- הסר מולקולות polyamine מאוגדת על ידי שטיפה מונעת שאיפה עם 1x PBS (ראה איור 2 ג) דקות 1.
- הסר את כל PBS מהנמלים ולחמם את המכשיר על ידי תאורה עם מיקרוסקופ. זה מגביר את האידוי מהיציאות להיווצרות מסכת מים מהירה. מסכת המים (באיור 3 א ומתועד באיור 3 ב) הוקמה בתוך ~ 5 דקות.
- בדוק את המכשיר על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח מיסוך מים הוא מלא. שים לב מבני מאגר במעלה הזרם של אתר המערך כלולים בעיצוב המסכה להאריך את היציבות של מסכת המים (~ 15 דקות).
- הכנס סיכות נירוסטה ליציאות (איור 2). אלה משמשים לזוג הפלזמה שנוצרה על ידי שחרור לחץ אטמוספרי כף יד עטרה או גנרטור טסלה (למשל, הפועלים ב2 MHz, 30 אות ק) 19,20 לערוצי microfluidic הפנויים. כוון את קצה tהוא פלזמת מקור קרוב לקצה של סיכה אחת ופלזמה לטפל microchannel ל≤ 1 שניות. השתמש בתנאי תאורה נמוכים כדי לבחון דפוסים פלזמה.
- להסיר את מסכת המים בצעד לשטוף. השתמש בשאיפה מקבילה מ3 יציאות העליונות. השתמש 4 אורכים שווים של צינורות סיליקון מחוברים באמצעות מתאם 4-דרך משאבת שאיפה להשגת שאיפה מקבילה. התחל שאיפה ולוותר PBS לתוך 3 היציאות התחתונה לצייר PBS דרך מעגל microfluidic. באופן זה ניגוד חומר PDMS-polyamine מופק (ראה איור 3 ג). לפנות PBS ממעגל microfluidic ולהשאיר לכמה שעות כדי לשחזר את המצב המקורי, הידרופובי. זה הופך את PDMS באופן מלא שאינו מתירנית להידבקות תא.
- יש חומרי הדבקה נוספים, כגון laminin או פיברונקטין, יהיו צורך בצעדים הבאים דרושים וצריך להיעשות מייד לאחר הסרת מסכת המים: פיפטה 10 μl נפח של השתל פולי-L שיתוף פולימר- ליזין-פולי (אתילן גליקול) (PLL-G-PEG, 100 מיקרוגרם / מיליליטר, ב-PBS) לשני ערוצים תחתון איגוף, ואחריו על ידי שאיפה מערוצי האיגוף העליונים למשך 2 דקות.
- מבלי להפריע לזרימה, להסיר PLL-G-PEG העודף על ידי חליפין עם חיץ PBS. זה סלקטיבי מעילי האזורים שאינן מצופה polyamine עם מחצית PEG פועלת למנוע ספיחת חלבון ותא הידבקות 17,21.
- חלבוני הידבקות כגון laminin או פיברונקטין אז יכולים להיות שותף מקומי עם ציפוי פולי-האמין: פיפטה 10 כרכים μl של חלבוני ECM אלה (בדרך כלל 10 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל שלוש יציאות בתחתית. לשאוב משלוש יציאות העליונה עד שההתקן מלא בפתרון החלבון ודגירה עבור שעה 1 כדי לייצר ציפוי באיכות טובה.
- הסר את החלבונים עודפים על ידי aspirating PBS מ3 יציאות התחתונה.
- Microfluidic יחיד Neuron עריכה
- ראש המכשירים עם ההולםאכלתי תקשורת. הוסף 20 כרכי μl ל3 יציאות התחתונה ועל ידי שאיפה במקביל משלוש יציאות העליונות במהירות למלא את מעגל microfluidic עם תקשורת. משתמש במחבר צינורות 4 כיוונים לבני זוג 3 יציאות העליונות דרך צינורות סיליקון שווה באורך למשאבת שאיפה.
- הוסף 20 μl של השעיה תא מפולחת (1 x 10 6 תאים / מיליליטר) לכל אחת מיציאות איגוף המפרצון (0, באיור 1).
- לצייד את משאבת שאיפה עם זרימת רגולטור או להשתמש במזרק לשאיבה עדינה מ3 יציאות העליונות. עריכת נוירון מלאה בדרך כלל דורשת דקות 1.
- קציר נוירונים עודפים שנותרו ב4 יציאות איגוף עם טפטפת לעריכה במכשירי microfluidic שלאחר מכן.
- הסר את צינורות. למלא את כל היציאות עם תקשורת ולהניח את המכשיר בחממה. תוך כמה שעות הפכו לתאים חסיד באופן מלא על הדפוס ביולוגי.
- Neuron תרבות, סלקטיבי Fluidic טיפול, אימונוגלובולינnostaining
- להחליף את התקשורת על ידי זלוף התקופתי באמצעות הזנה ההידרוסטטי (הפרש גובה עמודה 2 מ"מ הוא כראוי איטי).
- לחלופין, להטביע את מכשיר microfluidic בתקשורת, החלפת התקשורת מעת לעת (2-3 ימים) כמו עם תרביות תאים סטנדרטיות.
- טיפולי fluidic סלקטיבית לאו תא תרבות נוירון או לתא תולדת neurite המרכזי מושגות כדלקמן: לוותר 20 μl של חומר הבדיקה ליציאה התחתונה של הערוץ של עניין, ולשאוב מהנמל ישירות מעל. לטיפולים ארוכים להפחית את שיעור הזרימה באמצעות זרימת רגולטור ולחדש את חומר הבדיקה כנדרש.
- פרוטוקולי Immunostaining להשתנות עבור כל יעד מולקולרי וריאגנטים קשורים. על מנת להתמודד עם הסיכון הפוטנציאלי של נזק נגרם לתאי עצב גזירה קצב זרימה איטי היה בשימוש. כתוצאה מכך פעמים יישום מוגברות לתנקב במערכת באופן מלא, הארכת זמני פרוטוקול רגילים. Hyזלוף drostatic באמצעות יציאות עם גבהים שונים עמודה (למשל, על ידי 2 מ"מ) היה בשימוש, כדי לספק חומרים כימיים. בנוסף מהיר יותר מגיב וההסרה באמצעות משאבה ניתן להשתמש כדי להפחית את לוחות זמנים ניסיוניים. חבר משאבת השאיפה 3 היציאות העליונות לצייר ריאגנטים מ3 יציאות התחתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מעלליו מיסוך מים על פני השטח את המתח. סובלנות הלחץ בממשק האוויר הנוזלי מאזני הפוך עם רדיוס [עקמומיות 
, ייצור ממשקים מאוד יציבים בממדי microfluidic. Micropillars יעילות לעגן את מסכת המים במקום. היווצרות מסכת מים היא מונעת על ידי אידוי מנמלי microfluidic, עם השיעור המוגבר על ידי חימום. שימוש בחום נמוכה הגדלה (4X - 10X) מיקרוסקופיה תאורה, את מסכת המים הייתה בדרך כלל בהקמת ≤ 5 דקות. אידוי גם מוביל לחורבנה של מסכת המים. כדי להגדיל את חייו של מסכת מים ל~ 15 דקות (מעשיות לשכפול פלזמה), 18 מבני מאגר NL כבר ממוקמים במעלה הזרם של מדורי התרבות. קצב היווצרות מסכת מים וקריסה יכול להשתנות, והתבוננות לסירוגין מומלצת לזהות תקופה מתאימה לt פלזמהreatment. עם זאת, ניתן להכין מספר מכשירים בו זמנית.
שכפול פלזמה דורש ~ 1 שניות. השימוש בטיפולים ממושכים מאדה את מסכת המים, מה שמוביל להתפוררות פלזמה המוגזמת של ציפוי polyamine. על תוצאות טיפול פלזמה מספיקות אירוע, והשאיר את ציפוי polyamine שלם על קיר microchannel הסמוך (ראה איור 3D) שיכול לתמוך הידבקות נוירון 12. עם זאת, נוירונים בקליפת המוח עכבר ערוך היו יעילות דפוסים של 89.5% 12 הבאות תרבות במשך 6 ימים. יעילות זו היא שווה ערך לדפוסי PL / PEG על מצעים מישוריים. יש דפוסים ביולוגי הכשרון נוסף של קידום בצמחים לmicrochannels neurite. עם צמחי דפוסים ביולוגי מורחבים בתוך ~ 90% מmicrochannels, ואילו עם רמות תולדה מתמשכת polyamine ציפוי הופחתו ל ~ 70%. שימוש בתאי עצב בקליפת המוח, 7 ימים של תרבות בשבב נדרשו ללהיגמלths כדי להקיף את שני התאים (מרחק של 500 מיקרומטר). היו לי נוירונים SH-SY5Y מובחנים אנושיים שיעורי תולדה גבוהים, יצירת קשרים ב4-6 ימים. נוירונים בקליפת המוח, LUHMES וSH-SY5Y היו תרבותיים עד 2 שבועות. זה מספיק ארוך לתפקוד אלקטרו ספונטני ליושג וניתן למדוד באופן עקיף על ידי Ca 2 + הדמיה. זה יהיה לאמת את התחולה הנרחבת של הדפוסים ביולוגי ושיטות עריכת microfluidic להקמת רשתות עצביות פונקציונליות.
מבני מצמיד-מניסקוס, לעומת זאת, לקדם את הסתבכות neurite (ראה איור 4 ג). ממצא Edge הוא תכונה נפוצה של אקסונים בתרבית על משטחי microstructured 22. כדי למנוע הסתבכות כזו ועוד יותר לקדם את הקמתה של קשרים בין תא, ניתן למזג עמודי מצמיד-המניסקוס עם קיר microchannel (כלומר כבר לא עמד חופשי). בנוסף, בצמחיםבערוץ microfluidic המרכזי יכול להיות לא מאורגן. לניסויים הדורשים קישוריות ליניארי, הערוץ המרכזי ניתן להסיר (ראה עיצובי המסכה בDinh et al. מידע 12, נוסף). מעגל זה דורש עריכה סידורי של התא הראשון, ואחריה תקופה (למשל, 4 שעות) להידבקות תא או valving הסלולרי שנקרא 14 כדי להבהיר את המעגל מתירנית לעריכת תאים בתא השני.
מעגל microfluidic מספק פעולות fluidic מתוכנתים מראש. הפונקציות השונות נקבעות על ידי בחירתו של נמל כדי לטעון חומרים כימיים או ממשק עם צינורות או טיפים. זה ימנע את הצורך במכשור מורכב, יקר ודורש מרחב שבשליטת משוב על מנת להפוך את הטכניקה נגישה ביותר לneurobiologists. תכנון מעגלים תלוי באופן קריטי בממדים יחסי אופטימליים להשגת microfluidic עריכת 12-14. שינויים קטנים יכולים למנוע cirCUIT מלתפקד, ולכן אנו ממליצים מאמצים ראשוניים של הפרוטוקולים לעשות שימוש בעיצובים הזמינים באופן חופשי 12. עם מעגל אופטימלי, עריכת נוירון יחידה microfluidic היא מהירה, עם ~ 100 נוירונים ערוכים בכל חדר תרבות בדקות פחות מ 1. למרות המספר המצומצם של נוירונים, הצפיפות המקומית היא עדיין שווה ערך לתרבויות סטנדרטיות כדי לספק רמות איתות חיים תמיכה מספקות. כפי שתועד באיור 4 גישה זו בצורה יעילה מניבה נוירון 1 למלכודת (1.14 ± 0.09) 12. עם זאת, לא כל הנוירונים ערוכים. מעגל microfluidic מייצר מייעלת מקבילה, כך שתאי עצב המגיעים באזורים החיצוניים של הזרימה למינרית ימשיכו הערוץ מתפתל. יחד עם זאת המערכת שהוצגה היא 10-100 קיפול חסכוני יותר עם תאים ממודרים ממערכות קיימות. ניתן לקצור תאים גורשו מהיציאות וצינורות. בעיצובים בעתיד, תזוזה לרוחב דטרמיניסטית במעלה הזרםמבנים 23 יכולים לשמש כדי להסיט את כל התאים לעריכה מייעל לכלכלה הסלולר מוחלטת.
איור 4. עריכת נוירון microfluidic. א) שאיפה ידנית באמצעות מזרק משמשת לעריכת נוירון עדינה. מחבר צינורות 4 כיוונים משמש לממשק את המזרק עם 3 היציאות העליונות לתא עצב בו זמנית עריכה בשני התאים. ב ') מובחן תאים דמויי תאי עצב אנושיים SH-SY5Y ונוירונים אחרים מפוזרים בדייקנות תא בודדת (תא עצב אחד למלכודת ). C) לאחר 5 ימים של תרבות, הרחבות neurite הקישוריות שתי תרבויות. גרעיני מגואלות DAPI וimmunostaining אקטין שימש כדי לחזות בצמחים. דמות ואגדה הותאם לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC)
תכונה מרכזית של מערכות ממודרות היא היכולת לטפל באופן סלקטיבי אוכלוסיות תאים בודדות לחקור סחר בחומר ואיתות לטווח ארוך. עם זאת, שיטות זמינות בספרות הם או לקויים לבידוד fluidic או מתוארים בצורה גרועה. שיטת בידוד fluidic שפיתחנו מאפשרת אספקה המהירה (<1 דקות) של חומרי בדיקה ובידוד fluidic ממושך (> 1 שעות) 12. תוצאות מתועדות באיור 5. יכולת זו מתאפשרת על ידי השילוב של תכנון המעגל ובאמצעות השאיפה לספק את חומר הבדיקה. זאת בניגוד להזרקת נוזל או באמצעות משאבת מזרק על ידי הזנה ההידרוסטטי. למרות התנגדות fluidic הגבוהה של ערוצי תולדת neurite, שיטות אלה מייצרים t נתיבי הסעהכובע במהירות לפזר חומרי מבחן ולזהם את המכשיר כולו. שאיפה מהנמל העליון גם אינטראקציה עם נוזלים לאורך כל המעגל (תכונה מרכזית להתנגדות ההפרש עריכת עיקרון). עם זאת, במצב של פעולה זו, תקשורת נמשכות ממקום אחר במעגל כדי לדלל את חומר הבדיקה במקום לפזר אותה. בהתחשב בהתנגדות fluidic הקיצונית (יחסית) של ערוצי תולדת neurite, רמת הדילול אינה מהותית. לניסויים הכרוכים בהקמת הדרגתיים דיפוזיה, שיטת השאיפה יכולה לשמש לטיפול באופן סלקטיבי תא אחד, עם תזרים הפסקה משמשת לאתחול האבולוציה של השיפוע הכימי תלוי הזמן.
איור 5. טיפולי fluidic סלקטיבי. א) טיפולים סלקטיבית מונחה איפה של tהוא האיגוף מרכזי ו-B) תאים. החץ מציין את היציאה יחידה המשמשת לשאיפה. טיפולים הוקמו ב1 דקות (קווים אדומים) ונשמרו למשך תקופת הניסוי; 60 דקות (קווים כחולים). דמות ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) הותאם 12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת עריכת microfluidic היא הראשון מסוגו, המאפשר טיפול בתא עצב יחיד דיוק להקמת תרבויות מינימליסטי. יחד עם בשיטת דפוסים ביולוגי באתרו, בגישה רבת עוצמה כדי ליישר דפוסי תא עם מבני microfluidic, יש תרבויות מינימליסטי אלה רמות קישוריות גבוהה intercompartment עם הסתבכות מקומית מופחתת. תכונות אלה יכולות לשמש ללימוד יעיל של העברת בין תא, ועם יש שינויי עיצוב פשוט הפוטנציאל לבודד אקסונים בודדים להדמיה וניתוח כמוני. לדוגמא, בדור הבא עיצובים ניתן להחליף מבני הקלשון עם ערוץ תולדה אחד לכל נוירון להקטין את ההסתברות של אקסונים המרובים להרכיב חבילות. יכולות אלה יכולות להועיל למגוון רחב של יישומים במדעי המוח, הכוללים באופן משמעותי; רעילות nanoparticulate 24 והתפשטות מנגן 25, syn פעילותchronization באפילפסיה, ההפצה של חומרים מזהמים כגון פריונים 26, שידור ביתא עמילואיד (AB) במחלת אלצהיימר 9, וsynuclein אלפא במחלת פרקינסון 27.
עוד יתרון ברור של שיטת עריכת microfluidic הוא היכולת לבצע מחקר עם תת אוכלוסיות נוירון השפע נמוכות יותר מאשר תרבויות הטרוגנית מורכבות. לדוגמא, תאי עצב nigra substantia דופאמין מתאימים לנוירונים המחקר או היקפי פרקינסון שניתן לבודד רק במספרים קטנים עדיין מספיק מחקרים לשכפל באמצעות פלטפורמת microfluidic. דוגמאות יישום תא נדירות אחרות כוללות חקירה של הבסיס של אובדן שמיעה באמצעות הסדר ניסיוני של תאי שיער שיתוף תרבותיים עם נוירונים גרעיני ספירלה, או לימודים תוך שימוש בתאי גזע pluripotent מושרה מבני האדם. כמו כן, דרישות התא הנמוכה של המערכת לעשות את זהאפשר בקלות לבצע ניסויים עם נוירונים ממוח melanogaster Drosophilia מיניאטורי 28 ובכך למנף את היתרונות של המודל הגנטי רב עוצמה הזה.
נקודת המבט האחר הוא הפרגמטיזם של כלכלה הסלולר ואת טביעת רגל המכשיר הקטנה שעושה מחקר תפוקה גבוהה לניהול. כל תנאי ולשכפל דורש נוירונים מינימאליים, תכונה שיכול לשמש כדי להפחית מאוד מספרי בעלי חיים בקנה אחד עם היוזמה 3Rs המתמשך. לדוגמא, ניתוח תגובה במינון של פנל גדול של תרכובות יכול להתבצע באמצעות בעלי חיים אחת. סוגים של מסך כוללים בדיקות רעילות והחקירה של ספריות של siRNA או סוכנים תרופתיים להשפעה שלהם על סחר ארוך טווח והעברת אותות. לסיכום, הפרוטוקולים המתוארים להרחיב את טווח הניסוי של הנוירולוג, המציעים פוטנציאל לספק קצב העברת נתונים גבוה, כמוני ונתוןנתוני ברית חזקים עם רזולוציה אחת וsubcellular. זה והתפתחויות רבות הגדולות האחרות בתחום מדעי המוח יובילו לתובנות חדשות על פיתוח המנגנונים עצבי ותפקוד, כמו גם תהליכים פתולוגיים בגרימת מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לאולריך Marggraf (ISAS) עבור SU-8 ייצור ומריה בקר (ISAS) להדמית SEM. המחקר נתמך כלכלית על ידי (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium für מענק Bildung und Forschung (BMBF 0101-31P6541) ועל ידי המיניסטריום החדשנות, Wissenschaft und Forschung des נדס Nordrhein-Westfalen. הודות היקה Hardelauf בית הספר למוסמכי לייבניץ הבינלאומי "מעבדה על שבב מערכות ביולוגיה" לתמיכה כספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm biopsy punches | Kai Medical | Handle with care - extremely sharp | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way tubing connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polylysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Polyornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted fluorescent microscope | |||
| Example aspiration pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand held corona discharge device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto plasma oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum dessicator or centrifuge |
References
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
