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Neuroscience

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Abstract

Realizaciones de microfluidos de la cámara Campenot han despertado gran interés por parte de la comunidad de las neurociencias. Estas plataformas de co-cultivo interconectadas se pueden utilizar para investigar una variedad de preguntas, que abarca la neurobiología del desarrollo y funcional a la infección y la propagación de la enfermedad. Sin embargo, los sistemas convencionales requieren insumos significativos celulares (muchos miles por compartimiento), inadecuados para el estudio de las células de baja abundancia, como el nigra del substantia primaria dopaminérgico, ganglios espiral, y las neuronas melanogaster Drosophila y poco práctico para la experimentación de alto rendimiento. Los cultivos densos también se enredan muy localmente, con unos crecimientos (<10%) que interconectan las dos culturas. En este trabajo se describen los protocolos de microfluidos y de modelado sencillas que frente a estos desafíos: (i) una neurona única de microfluidos método arraying, y (ii) un método de enmascaramiento de agua para recubrimientos de biomateriales de modelado de plasma para Register neuronas y promover la excrecencia de entre los compartimentos. Co-cultivos neuronales Minimalistic se prepararon con alto nivel (> 85%) la conectividad intercompartimiento y se pueden utilizar para los de alto rendimiento experimentos neurobiología con precisión simple célula.

Introduction

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Tejido neuronal es muy complejo; una mezcla celular heterogénea que se ordena espacialmente dentro de las capas y los compartimentos definidos y con conectividad de plástico a través de contactos celulares y en especial a través de los axones y dendritas excrecencias. Se requieren nuevas técnicas para conferir una mayor libertad experimental para obtener una visión más profunda y los mecanismos centrales para desentrañar la enfermedad, el desarrollo y la función saludable. La cámara de Campenot 1,2 y, más recientemente microfabricado realizaciones 3,4 se pueden utilizar para la preparación ex vivo de co-cultivos neuronales conectados en red con la capacidad para perturbar de forma selectiva las diferentes poblaciones somáticas y también sus excrecencias de neuritas. Estos dispositivos de microfluidos han, por ejemplo, han utilizado para estudiar la degeneración axonal y la regeneración siguiente químico 5,6 o láser axotomía 6-8, tauopatía 9, difusión viral 10,11, y la localización del mRNA en los axones 4.

ent ">

Para ampliar el alcance de los neurobiólogos, se requieren desarrollos tecnológicos para preparar co-cultivos neuronales minimalistas. Esto permite que el desenmarañado de la red neuronal para la investigación del sistema con una sola célula y la precisión de sub-celular. El requisito para el número de células mínimas abre la posibilidad de analizar los tipos de células raras, incluyendo células dopaminérgicas de la sustancia negra pertinentes a la enfermedad de Parkinson, los ganglios de espiral desde el oído, las neuronas periféricas, y las células madre. Más allá de esto, la economía celular es relevante a la iniciativa de las 3R. El uso de estas plataformas de microfluidos, pantallas de toxicidad a gran escala u otras de alto rendimiento, rica serie experimental de datos que requieren las neuronas de los animales puede considerarse ahora.

En este trabajo se describen los protocolos para la fabricación y el uso de un dispositivo de microfluidos. De agrupación de microfluidos en combinación con un en biomateri situmétodo de modelado al se puede utilizar para el registro de los co-cultivos neuronales altamente interconectadas que utilizan el número de células mínimas. De agrupación de microfluidos se basa en un enfoque de flujo diferencial 12-15, en el que las trampas microestructurados se colocan dentro de un circuito de fluido (ilustrada junto con imágenes de SEM en la Figura 1). La ruta de 0 → 1 tiene la resistencia fluídica inferior (R2> R1) para el transporte de las neuronas a una serie lineal de aberturas microestructurados - las entradas a los canales de desarrollo de neuritas. Ocupación de la trampa por una sola célula impide localmente el flujo de desviar las líneas de corriente para atrapar las células posteriores en trampas vecinos. Ocupación completa de las trampas de la matriz cambia la relación de fluidos (R1> R2) para desviar las líneas de corriente en la trayectoria de serpentina (0 → 2) para producir un modo de derivación de operación para la eliminación del exceso de neuronas.


Figura 1. Microfluidic Circuito. A) El circuito de resistencia diferencial de fluido para el solo arraying neurona, con flanqueando cámaras de cultivo interconectados por canales de desarrollo de neuritas. B, las imágenes C) de SEM de la bicapa neurona compartimentada gama co-cultivo con menisco fijando micropilares. Con este diseño, se utilizaron estructuras de captura de neuronas en forma de tridente-para promover fasciculación de las excrecencias de neuritas. La figura y la leyenda reproducido con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) 12. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

La preparación de las redes neuronales micropatterned en sustratos planos se puede conseguir fácilmente (por EJEMPLOS es de nuestro grupo, ver Frimat et al. 16 y Heike et al. 17). Sin embargo, la encapsulación de patrones materiales bioactivos dentro de los dispositivos de PDMS y con el requisito de alineación micrómetro escala de estos a los canales de microfluidos plantea un gran desafío técnico. En la sección 3.1 de un protocolo para la en-chip, o in situ, se presenta la preparación de los patrones de biomateriales. Estos patrones permiten la inscripción de las neuronas durante las largas escalas de tiempo de cultivo y promover crecimientos entre los compartimentos. Microestructuras de menisco-colocación de clavos se utilizan para alinear una llamada máscara de agua con la neurona sitios y canales de desarrollo de neuritas arraying. El agua máscara protege los recubrimientos de moléculas de adhesión durante el tratamiento de plasma, mientras que las superficies expuestas se desintegran para definir el patrón de biomaterial. Además, se proporcionan protocolos para el cultivo celular y para el aislamiento de fluido necesario para el tratamiento selectivo de los diferentes compartimentos de co-cultivo.

ve_content "> Los protocolos están diseñados para aprovechar los principios de uso fácil de la litografía suave para la replicación de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos de microfluidos 18. Del mismo modo, en el patrón de biomaterial in situ es sencillo, la explotación de la superficie de evaporación y fenómenos de tensión, y sólo que requiere una fuente de plasma de mano barata. El circuito de microfluidos con eficacia los programas de carga celular y compartimiento tratamientos específicos que hacen estas operaciones De esta manera, se pretende dar a los neurobiólogos simplemente una cuestión de distribución de materiales en el puerto inferior correcto y aspirando desde arriba. la libertad de preparar y usar los dispositivos de microfluidos en sus propios laboratorios.

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Protocol

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Los protocolos están destinados a los neurocientíficos, y se resumen en la Figura 2. Como tal, es recomendar que la microfabricación de los SU-8 maestros utilizados para la replicación de PDMS se externaliza a las instalaciones comerciales o institucionales. Los dos diseños de máscara de capa están disponibles gratuitamente como información complementaria (CP) en la Real Sociedad de Química página web 12. Es importante destacar que la primera capa de SU-8 debe ser fabricado a una profundidad de 2,5-3,0 micras, y la segunda a una profundidad de 25-30 micras. Estas son las principales dimensiones necesarias para arraying neurona eficaz. El límite de altura de 3 micras es también necesario para evitar que las neuronas que se transportan o la migración entre los dos compartimientos 12.

1. Replicación de dispositivo de microfluidos en PDMS

  1. Mezclar el prepolímero de PDMS a fondo con el agente de curado (184) en una proporción de 10:01 y desgasificar la mezcla en un desecador de vacío durante típicamente 20 min. También puede poner la mezclatura en un tubo Falcon de 50 ml y use bajo g centrifugación para la desgasificación.
  2. Coloque el 2-capa microestructurada SU-8 oblea en una placa calefactora 80 ° C y alinear marcos de polímero a cada dispositivo en la oblea. Vierta PDMS en los marcos a una profundidad de ≥ 5 mm y permiten> 1 h para asegurar un curado térmico completo.
  3. Una vez curado, retirar la oblea de la placa calefactora y dejar enfriar sobre una superficie plana.
  4. Use gafas de protección y el trabajo de una esquina (lejos de los SU-8 microestructuras) con un bisturí rígido para premio suavemente el marco y PDMS de la oblea.
  5. Retire el molde de PDMS de la estructura y el uso de un par de tijeras para cortar el dispositivo de exceso de PDMS. Este llamado parpadeo se produce a menudo cuando una fina película de PDMS se extiende entre el marco de polímero y la superficie de la oblea.
  6. PDMS restantes se pueden aplicar a toda la oblea y se curan para proteger la oblea durante el almacenamiento. Eliminar a esta antes del moldeo dispositivo posterior, y al hacerlo, eliminar cualquier particular contaminantes de la superficie.

2. Asamblea de dispositivos y de interconexión

  1. Preparar los puertos de interfaz 6 utilizando un punzón de biopsia de diámetro 3 mm. Trabaje sobre una superficie oscura, en buenas condiciones de luz y con las características microestructuradas hacia arriba para ayudar a la alineación de los puertos con los canales de microfluidos.
  2. Inspeccione el dispositivo para las partículas. Remover estos con cinta adhesiva reversible.
  3. El circuito de microfluidos se encapsula usando una capa delgada de PDMS montado en un cubreobjetos de vidrio: Estos se preparan mediante el vertido de un volumen pequeño (~ 0,5 ml) de la mezcla de agente de curado de PDMS-(10:01, 601) sobre la base de una solución flexible, grado bacteriológico placa de Petri. Presione suavemente un cubreobjetos sobre la capa de PDMS, colocar sobre la placa calefactora cura térmicamente durante unos minutos. Rápidamente después del enfriamiento, use un escalpelo para cortar y el premio de la bicapa cubreobjetos-PDMS de la placa de Petri. Recorte con tijeras si es necesario.
  4. Bonos Plasma dispositivo PDMSy capa de soporte para producir un buen cierre: Las condiciones óptimas son el instrumento específico. Por ejemplo, un horno de plasma que funciona a 70 W y 40 kHz en una atmósfera de oxígeno 0,2 mbar durante 40 segundos produce una excelente unión de PDMS-PDMS. Una vez tratada plasma, presione ambas piezas conjuntamente y dejar actuar durante un minuto para completamente fianza.
  5. Use un tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior, 3,2 mm OD) para interactuar con bombas y jeringuillas.

3. Biomaterial Patrones y Operaciones de microfluidos

Los protocolos para los patrones en biomaterial in situ, la cultura neurona y tratamientos fluídicos se ilustran en la Figura 2.

Figura 2
Figura 2. Protocolos de microfluidos Illustrated. A) PL y PLL-g-PEG patrón; Además de la capa de adhesión celular (por ejemplo,PL, verde), con la producción de la máscara de agua alineados B) del tratamiento con plasma de aire atmosférica del PL expuesto evaporación.; se utilizan dos pasadores de antena, con la introducción de la antena de plasma ilustrado con una estrella de color rosa. C) PBS (azul) de lavado por aspiración se utiliza para evitar la contaminación de la región de plasma tratado con PL. D) de entrega de PLL-g-PEG (roja ) por aspiración para recubrir las regiones tratadas con plasma E) de carga de la célula.; arraying microfluidos simultánea de las neuronas para ambos compartimentos que flanquean por aspiración, F) medios de comunicación (rosa) de perfusión utilizando un flujo de accionamiento hidrostático G) tratamientos de fluidos aislados.; tratamiento periférico de un agente de prueba (negro) libró de la entrada inferior de flanqueo por aspiración y H) central de tratamiento librado de la entrada central inferior por aspiración. La figura y la leyenda reproducidas con permiso de la Sociedad Real de Química(RSC) 12. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Inmediatamente después plasma la unión de las canales de microfluidos PDMS son muy hidrófilos (ángulo de contacto ≤ 5 °). Tales superficies son adecuados para la adhesión y la cultura de líneas celulares tales como células similares a neuronas SH-SY5Y diferenciadas humanos. Para el cultivo ex vivo de las neuronas primarias y la cultura de líneas de células precursoras neuronales, tales como la línea celular de Lund mesencefálico humana (LUHMES) un revestimiento de poliamina, ya sea polilisina (PL) o poliornitina (PO), se requiere como un ancla electrostática. Además proteínas de adhesión tales como la laminina o fibronectina se requieren a menudo como el recubrimiento de la integrina-interfaz. Sin embargo, los revestimientos de PL y PO se unen fácilmente las neuronas, lo que dificulta la entrega de microfluidos a los sitios de la matriz y también imponer tensiones de cizallamiento no deseadas. Para resolver este problema biomaterial en el chipSe requiere patrón para localizar materiales de adhesión en los sitios de trampa y los microcanales excrecencia. Esto también promueve el desarrollo de las conexiones entre compartimentos y reduce el enredo local. El protocolo también implica la adición de materiales de PEG a las áreas vecinas para asegurar las proteínas y las neuronas se limitan a las ubicaciones deseadas durante largo cultura. El siguiente protocolo se documenta en la Figura 3:

Figura 3
Figura 3. Agua de enmascarar para modelar biomaterial por estarcir plasma. A) Ilustración del proceso de enmascaramiento de agua con las micropilares PDMS fijar el menisco de agua en el lugar de colocación de letreros de plasma. La curvatura del menisco en el plano vertical se ha descuidado. B) máscara de agua visualizado con un colorante rojo y se coloca por menisco pinning. C) El patrón de recubrimiento PL-FITC fotografiado después de estarcir plasma. D) La adición de proteína de rechazar y repelente celular PLL-g-PEG-TRITC a un recubrimiento PL-FITC plasma con dibujos. Esto se utilizó para el registro de células SH-SY5Y y también para modelar una capa de fibronectina adicional para las células LUHMES. La figura y la leyenda reproducido con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) 12. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

  1. El enmascaramiento de agua para In situ biomaterial Patterning por Plasma Stenciling
    1. Poco después de la pipeta de unión de plasma un volumen de 0,5 l de PL o PO (100 g / ml en PBS 1X) en el puerto del centro de la parte inferior. En cuestión de segundos todo el circuito de microfluidos se llena por acción capilar. Dejar durante unos minutos para cubrir completamente las superficies de PDMS hidrófilos con el poliAminas.
    2. Eliminar las moléculas de poliamina no unidos por lavado aspiración impulsada con 1x PBS (ver Figura 2C) durante 1 min.
    3. Quite todo el PBS de los puertos y calentar el dispositivo mediante la iluminación con un microscopio. Esto aumenta la evaporación de los puertos para la formación de agua máscara rápida. La máscara de agua (se ilustra en la Figura 3A y documentado en la Figura 3B) se establece dentro de ~ 5 min.
    4. Inspeccione el dispositivo mediante microscopía para asegurar el enmascaramiento del agua se ha completado. Tenga en cuenta las estructuras de depósito aguas arriba del sitio de matriz están incluidos en el diseño de la máscara para prolongar la estabilidad de la máscara de agua (~ 15 min).
    5. Inserte los pasadores de acero inoxidable en los puertos (Figura 2B). Estos se utilizan para acoplar el plasma generado por una mano la presión de descarga en corona atmosférica o Tesla generador (por ejemplo, que funciona a 2 MHz, la señal de 30 kV) 19,20 en los canales de microfluidos vacantes. Coloque la punta de tse plasma fuente cercana a la punta de un alfiler y plasma a tratar la de microcanal para ≤ 1 seg. Utilice las condiciones de poca luz para observar el patrón de plasma.
    6. Quite la máscara de agua con un paso de lavado. Utilice la aspiración paralelo desde los puertos superiores 3. Utilice 4 longitudes iguales de tubo de silicona unidos por un adaptador de 4 vías a una bomba de aspiración de lograr la aspiración paralelo. Inicie la aspiración y dispensación PBS en los 3 puertos inferiores para dibujar PBS a través del circuito de microfluidos. De esta manera un contraste material PDMS poliamina es producido (ver Figura 3 C). Evacuar PBS desde el circuito de microfluidos y se deja durante varias horas para restaurar el, estado hidrófobo nativa. Esto hace que el PDMS totalmente no permisiva para la adhesión celular.
    7. En caso de que los materiales de adhesión adicionales, tales como la laminina o fibronectina, se necesitarán son necesarios los siguientes pasos y se debe hacer inmediatamente después de quitar la máscara de agua: pipeta un volumen de 10 l de injerto de copolímero de poli-L- Lisina-poli (etilenglicol) (PLL-g-PEG, 100 g / ml, en PBS) en ambos canales de fondo de acompañamiento, seguido por la aspiración de los canales que flanquean superiores para 2 min.
    8. Sin interrumpir el flujo, eliminar el exceso de PLL-g-PEG por intercambio con un tampón PBS. Este selectivamente recubre las regiones no-poliamina-revestido con el resto de PEG que actúa para evitar la adsorción de proteínas y la adhesión celular 17,21.
    9. Proteínas de adhesión tales como la laminina o fibronectina pueden ser co-localizada con el recubrimiento de poli-amina: Pipetear 10 volúmenes l de estas proteínas ECM (típicamente 10 mg / ml) en los tres puertos de fondo. Aspirar a partir de los tres principales puertos hasta que el dispositivo se llena con la solución de proteína y se incuba durante 1 hora para producir un revestimiento de buena calidad.
    10. Retire el exceso de proteínas mediante la aspiración de PBS a partir de los 3 puertos inferiores.
  2. Microfluidic sola neurona Arraying
    1. Prime los dispositivos con aprocomió medios. Añadir 20 volúmenes mu l a los 3 puertos de fondo y por la aspiración paralelo de los tres puertos superiores llenar rápidamente el circuito de microfluidos con los medios de comunicación. Utilice un conector de tubo de 4 vías para acoplar los 3 puertos superiores a través de un tubo de silicona de longitud igual a una bomba de aspiración.
    2. Añadir 20 l de una suspensión de células desglosados ​​(1 x 10 6 células / ml) a cada uno de los puertos de entrada de acompañamiento (0, en la Figura 1).
    3. Equipar una bomba de aspiración con un regulador de flujo o utilizar una jeringa para aspiración suave de los puertos superiores 3. De agrupación completa neurona requiere típicamente 1 min.
    4. Coseche exceso neuronas que quedan en los 4 puertos de flanqueo con una pipeta para poner en orden en dispositivos de microfluidos posteriores.
    5. Retire el tubo. Rellene todos los puertos con los medios y coloque el dispositivo en la incubadora. En pocas horas las células se vuelven totalmente adherente sobre el patrón de biomaterial.
  3. Neurona Cultura, Selectiva Tratamiento neumático y Immunostaining
    1. Cambie los medios de comunicación por perfusión periódica utilizando alimentación hidrostática (una diferencia de altura de columna de 2 mm es adecuada lento).
    2. Alternativamente, sumerja el dispositivo de microfluidos en medios de comunicación, el intercambio de los medios de comunicación periódicamente (2-3 días), como con los cultivos celulares convencionales.
    3. Tratamientos de fluidos selectivos a cualquiera de neurona compartimiento de cultivo o el compartimento central de la excrecencia de neuritas se consiguen de la siguiente manera: Dispensar 20 l de la sustancia de ensayo en el puerto inferior del canal de interés, y aspirado desde el puerto directamente encima. Para los tratamientos largos reducen la velocidad de flujo utilizando un regulador de flujo y reponer la sustancia de ensayo como se requiere.
    4. Protocolos Inmunomarcación varían para cada diana molecular y reactivos asociados. Con el fin de contrarrestar el riesgo potencial de daño inducido por cizalla a las neuronas se utilizó una tasa de flujo lento. Esto se traduce en un aumento de los tiempos de aplicación para perfundir plenamente el sistema, extendiendo los tiempos normales de protocolo. Hyperfusión hidrostática utilizando puertos con diferentes alturas de columna (por ejemplo, de 2 mm) se utiliza para entregar los reactivos. Más rápida adición de reactivos y eliminación de material mediante una bomba se pueden utilizar para reducir los tiempos experimentales. Conecte una bomba de aspiración de los puertos superiores 3 para dibujar los reactivos de los 3 puertos inferiores.

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Representative Results

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Hazañas de enmascaramiento Agua tensión superficial. La tolerancia a la presión en la interfase aire-líquido escalas inversamente con el radio de curvatura [ , La producción de las interfaces altamente estables en las dimensiones de microfluidos. Los micropilares anclar eficazmente el agua máscara en su lugar. Formación de máscara de agua es impulsado por la evaporación de los puertos microfluídicos, con la tasa de aumento de por calentamiento. Usando el calor de bajo aumento (4X - 10X) microscopía de iluminación, la máscara de agua se suelen establecer en ≤ 5 min. La evaporación también conduce a la eventual caída de la máscara de agua. Para aumentar la vida útil de la máscara de agua a ~ 15 min (práctico para estarcir de plasma), 18 estructuras de depósito nl se han colocado aguas arriba de los compartimentos de cultivo. La tasa de formación de máscara de agua y colapso puede variar, y se recomienda la observación intermitente para identificar un periodo adecuado para el plasma Tratamiento. Sin embargo, varios dispositivos se pueden preparar de forma simultánea.

Estarcir Plasma requiere ~ 1 seg. El uso de tratamientos prolongados se vaporiza la máscara de agua, que conduce a la excesiva desintegración del revestimiento de plasma poliamina. En ocasiones insuficientes resultados del tratamiento de plasma, dejando intactos los revestimientos de poliaminas en la pared microcanal adyacente (véase la Figura 3D) que puede apoyar la adhesión neuronal 12. Sin embargo, el ratón ataviado neuronas corticales tenían una eficiencia de los patrones del 89,5% 12 después del cultivo durante 6 días. Esta eficiencia es equivalente a patrones de PL / PEG sobre sustratos planos. Patrones biomaterial tiene además el mérito de promover crecimientos en los microcanales neuritas. Con excrecencias de modelado de biomateriales extendido dentro de ~ 90% de los microcanales, mientras que con una poliamina continuos niveles de excrecencia de recubrimiento se redujeron a ~ 70%. El uso de las neuronas corticales, los 7 días de la cultura en el chip se requería para la superan con la edadmls para abarcar ambos compartimentos (una distancia de 500 m). Neuronas SH-SY5Y diferenciadas humanos tenían mayores tasas de crecimiento externo, estableciendo conexiones en 4-6 días. Las neuronas corticales, LUHMES y SH-SY5Y se han cultivado durante un máximo de 2 semanas. Esto es lo suficientemente largo para espontánea función electrofisiológica que hay que alcanzar y se puede medir indirectamente por Ca 2 + de imágenes. Esto sería validar la aplicabilidad generalizada de los patrones biomaterial y los métodos de agrupación de microfluidos para el establecimiento de redes neuronales funcionales.

Las estructuras de menisco-pinning hacen, sin embargo, promover el entrelazamiento de las neuritas (ver Figura 4C). Hallazgo Edge es una característica común de los axones cultivadas en superficies microestructurados 22. Para evitar tales enredos y promover aún más la formación de conexiones entre compartimentos, pilares de menisco-pinning se pueden combinar con la pared de microcanal (es decir, ya no es libre-de pie). Además, excrecenciasen el canal de microfluidos central puede ser desorganizado. Para los experimentos que requieren conectividad lineal, el canal central se puede eliminar (ver los diseños de máscara en Dinh et al. 12, la información complementaria). Este circuito requiere de agrupación de serie del primer compartimento, seguido por un período (por ejemplo, 4 horas) para la adhesión celular o la llamada de válvula celular 14 para hacer que el circuito permisivo para poner en orden las células en el segundo compartimento.

El circuito microfluídico proporciona operaciones de fluidos pre-programados. Las diferentes funciones están determinadas por la elección del puerto para cargar los reactivos o interfaz con un tubo o consejos. Esto evita la necesidad de exigir la instrumentación de realimentación controlado complejo, costoso y el espacio para hacer la técnica altamente accesible a los neurobiólogos. Diseño de circuito es críticamente dependiente de las dimensiones relativas óptimas para lograr microfluidos arraying 12-14. Los pequeños cambios pueden impedir que el circuitoCUIT funcione, y por lo tanto se recomienda adoptantes iniciales de los protocolos para hacer uso de los diseños de libre acceso 12. Con un circuito óptima, de microfluidos de agrupación única neurona es rápida, con ~ 100 neuronas dispuestas en cada cámara de cultivo en menos de 1 min. A pesar del número limitado de neuronas, la densidad local sigue siendo equivalente a culturas estándar para proporcionar niveles suficientes de señalización de soporte vital. Como se documenta en la Figura 4B este enfoque produce efectivamente 1 neurona por trampa (1,14 ± 0,09) 12. Sin embargo, no todas las neuronas se disponen. El circuito de microfluidos genera líneas de corriente paralelas, tales que las neuronas que llegan a las regiones exteriores de la flujo laminar siguen el canal de serpentina. Sin embargo, el sistema presentado es 10-100 veces más económico que los sistemas con células compartimentadas existentes. Expulsados ​​células pueden ser cosechadas a partir de los puertos y los tubos. En los diseños futuros, desplazamiento lateral determinista aguas arribaestructuras 23 se pueden utilizar para desviar todas las células en el de agrupación optimiza para la economía celular absoluta.

Figura 4
Figura 4. Arraying neurona microfluidos. A) la aspiración manual utilizando una jeringa se utiliza para de agrupación neurona suave. Un conector de tubo 4-forma se utiliza para conectar la jeringa con los puertos superiores 3 para neurona simultánea arraying en ambos compartimentos. B) células diferenciadas SH-SY5Y humanos similares a neuronas y otras neuronas están dispuestos con precisión una sola célula (una neurona por trampa ). C) Después de 5 días de cultivo, las extensiones de neuritas interconectar las dos culturas. Los núcleos se tiñeron con DAPI y inmunotinción actina se utilizó para visualizar las excrecencias. Modificado figura y la leyenda reproducidas con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Una característica clave de los sistemas compartimentados es la capacidad de tratar selectivamente poblaciones de células individuales para investigar el tráfico y la señalización de material de largo alcance. Sin embargo, los métodos disponibles en la literatura son ya sea inadecuada para el aislamiento de fluidos o están mal descrito. El método de aislamiento de fluidos hemos desarrollado permite la entrega rápida (<1 min) de sustancias de ensayo y prolongado aislamiento de fluidos (> 1 h) 12. Los resultados se documentan en la Figura 5. Esta capacidad es posible gracias a la combinación del diseño de circuito y mediante el uso de aspiración para entregar la sustancia de ensayo. Esto está en contraste con la inyección de fluido utilizando una bomba de jeringa de alimentación por hidrostática. A pesar de la gran resistencia de fluidos de los canales de desarrollo de neuritas, estos métodos producen sendas convección tsombrero de dispersar rápidamente sustancias de ensayo y contaminar todo el dispositivo. La aspiración desde el puerto superior también interactúa con el fluido en todo el circuito (una característica central de la resistencia diferencial arraying principio). Sin embargo, en este modo de funcionamiento, los medios de comunicación se han extraído de otra parte en el circuito para diluir la sustancia de ensayo en lugar de dispersarlo. Dada la resistencia fluídica extrema (relativa) de los canales de desarrollo de neuritas, el nivel de dilución es insignificante. Para los experimentos que implican el establecimiento de gradientes de difusión, el método de aspiración se puede utilizar para tratar selectivamente un compartimiento, con el cese de flujo utilizado para iniciar la evolución dependiente del tiempo de la gradiente químico.

La figura 5
Figura 5. Tratamientos de fluidos selectivos. A) impulsadas por aspiración tratamientos selectivos de tlo central y B) que flanquean compartimentos. La flecha indica el solo puerto utilizado para la aspiración. Los tratamientos se establecieron en 1 min (líneas rojas) y se mantuvieron durante la duración del experimento; 60 min (líneas azules). Modificado figura y la leyenda reproducido con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) 12. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

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La técnica de agrupación de microfluidos es el primero de su tipo que permite precisión simple manejo de las neuronas para establecer culturas minimalistas. Junto con el método in situ patrón biomaterial, un enfoque poderoso para alinear patrones celulares con estructuras de microfluidos, estas culturas minimalistas tienen niveles de conectividad de alta intercompartimiento con reducida entrelazamiento local. Estas características se pueden utilizar para el estudio eficiente de transmisión inter-compartimiento, y con modificaciones de diseño simples tienen el potencial para aislar los axones individuales para la visualización y el análisis cuantitativo. Por ejemplo, en la próxima generación de diseños de las estructuras de tridente puede ser reemplazado con un canal de derivación por neurona para reducir la probabilidad de múltiples axones formando haces. Estas capacidades pueden beneficiarse mucho de una variedad de aplicaciones de la neurociencia, entre ellos; toxicidad de nanopartículas de 24 y la propagación de manganeso 25, la actividad synzación en la epilepsia, la propagación de agentes infecciosos, como los priones, 26 beta-amiloide (Ab) de transmisión de la enfermedad de Alzheimer 9 y alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson 27.

Otro beneficio obvio del método de agrupación de microfluidos es la capacidad para llevar a cabo la investigación con bajos neuronas abundancia sub-poblaciones en lugar de cultivos heterogéneos complejos. Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra adecuados para la investigación o periférico neuronas de Parkinson que sólo pueden ser aisladas en pequeñas cantidades son todavía suficientes para estudios replicados utilizando la plataforma de microfluidos. Otros ejemplos de aplicación de células raras incluyen la investigación de la base de la pérdida de la audición mediante un dispositivo experimental de las células ciliadas co-cultivadas con neuronas de los ganglios espirales, o los estudios con células madre pluripotentes inducidas a partir de los seres humanos. Del mismo modo, los requisitos de bajos de células del sistema hacen que seafácil posible para llevar a cabo experimentos con neuronas del cerebro en miniatura melanogaster Drosophila 28 y así aprovechar los beneficios de este potente modelo genético.

La otra perspectiva es el pragmatismo de la economía celular y la huella pequeño dispositivo que hace que la investigación de alto rendimiento manejable. Cada estado y la réplica requiere neuronas mínimos, una característica que puede ser utilizada para reducir enormemente el número de animales de acuerdo con la iniciativa de las 3R en curso. Por ejemplo, el análisis de respuesta a la dosis de un gran panel de compuestos puede llevarse a cabo utilizando un solo animal. Tipos de pantalla incluyen pruebas de toxicidad y la investigación de las bibliotecas de siRNA o agentes farmacológicos para su efecto en el tráfico de larga distancia y la transducción de señales. En resumen, los protocolos descritos extienden el alcance experimental del neurocientífico, ofreciendo el potencial de ofrecer un alto rendimiento, cuantitativa y estadísticadatos aliado de gran alcance con una resolución única y subcelular. Esto y muchos otros grandes avances en el campo de la neurociencia dará lugar a nuevos conocimientos sobre los mecanismos de desarrollo neuronal subyacente y la función, así como los procesos patológicos que causan la enfermedad.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricación y Maria Becker (ISAS) para obtener imágenes de SEM. La investigación fue apoyada financieramente por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), una Bundesministerium für Bildung und Forschung subvención (BMBF 0101-31P6541) y por el Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf agradece al Leibniz Escuela Internacional "Systems Biology Lab-on-a-Chip" para el apoyo financiero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

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References

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Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell
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Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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