Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af neuralrøret, men migrere til nå passende mål. Facial branchiomotor (FBM) neuroner er en nyttig model til at studere neuronal migration. Denne protokol beskriver whole-mount ex vivo kultur museembryo hindbrains at undersøge mekanismer, der regulerer FBM migration.
Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af hjernen, men efterfølgende migrere til nye destinationer for at nå passende mål. Decifrere de molekylære signaler, der beredvilligt vejlede neuronal migration i embryonale hjerne er derfor vigtigt at forstå, hvordan de komplekse neurale netværk danner der senere støtter postnatal liv. Facial branchiomotor (FBM) neuroner i museembryo baghjerne migrere fra rhombomere (R) 4 caudally at danne de parrede facial kerner i R6-afledte region baghjerne. Her giver vi en detaljeret protokol for whole-mount ex vivo kultur museembryo hindbrains egnede til at undersøge de signalveje, der regulerer FBM migration. I denne fremgangsmåde er hindbrains af E11.5 musefostre dissekeret og dyrket i en åben præparat bog på cellekultur indsatse til 24 timer. I løbet af denne tid, FBM neuroner migrere caudally mod R6 og kan blive udsat for funktions-blokerende antistoffer og små molecules i kultur medier eller heparin perler læsset med rekombinante proteiner til at undersøge roller for signalveje impliceret i vejledende neuronal migration.
Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af hjernen, men efterfølgende migrere til nye destinationer for at nå passende målområder, der er placeret på en stor afstand. Den korrekte placering af nervecellelegemer på passende steder langs de dorso-ventrale og anterior-posterior akser i hjernens udvikling er afgørende for den korrekte ledningsføring, overlevelse og funktion af disse neuroner efter vandrende etape 1-4. Svarende til de molekylære mekanismer, der styrer Axon vejledning 5-7, er kombinatoriske sæt af attraktive og frastødende stikord menes at vejlede migrerer neuroner 1,8. Men på grund af vekselvirkninger af flere celletyper, de signaler, der styrer neuronal migration er blevet mindre grundigt undersøgt end dem, der er involveret i Axon vejledning, som kan studeres celle selvstændigt. Den udvikling baghjerne hvirveldyr er blevet anvendt i flere nylige undersøgelser for at forstå de molekylære og cellulære mekanismerneuronal migration, for eksempel i chick, mus og zebrafisk 1-4,9. Dette orgel indeholder flere forskellige typer af neuroner, herunder flere undertyper af precerebellar og motoriske neuroner 5,7,10,11.
Baghjerne motorneuron er født i den ventrikulære zone tæt på gulvpladen, og de differentierer til bestemte delmængder efter deres rhombomere oprindelsesland 1,12. Ansigtets branchiomotor (FBM) neuroner er genereret på rhombomere (R) 4 i baghjerne og udvide deres axoner dorsalt gennem en R4 udgangssted ind i den anden brankiebue innerverer ansigtets muskler 2,9,13. FBM neuroner i zebrafisk og mus giver gode modeller til at studere de molekylære og cellulære mekanismer neuronal migration i en proces, der let kan visualiseres, eftersom disse neuroner reproducerbart translokere deres somata i en spatiotemporally veldefineret proces. Hos mus FBM neuroner først migrere caudally gennem R5 og derefter både caudally og ventralt for at nå deres endelige holdning til pial side af baghjerne i det område af R6, hvor de danner de parrede kerner af det syvende kranienerver (VIIn) 10,11,14. I zebrafisk, FBM neuroner oprindeligt migrere ventralt og derefter ændre retning på r4-R5 grænsen til fortsat at migrere mod pial overflade i en laminin-afhængig måde 4,12,15,16. Denne migrering forløber over en periode på flere dage i udvikling, og kan opdeles i faser af tangential og radial migration, som muliggør identifikation af molekyler, der medierer disse to adskilte processer. I modsætning hertil FBM neuroner i den embryoniske kylling baghjerne forbliver i R4 3,13,17-19.
Under deres migration, kan identificeres FBM neuroner, ligesom andre typer eller motoriske neuroner gennem deres udtryk for homoeodomain transkriptionsfaktoren holm 1 (ISL1) 14.. Således, engemount immunfluorescensfarvning eller in situ hybridisering for denne markør på forskellige udviklingsstadier afslører særskilte vandrende strøm af FBM somata strækker sig fra R4 til R6 i zebrafisk eller mus 4,15,16. Desuden har fluorescerende transgene reportere såsom ISL1-GFP blevet brugt som egnede værktøjer til at visualisere migrere FBM neuroner i zebrafisk 3,17-19. Ud over deres egnethed til billeddannelse, har mange forskere studeret migration af FBM neuroner i udviklingen zebrafisk, fordi deres fritlevende embryoner kan manipuleres nemt med celletransplantation teknikker og farmakologiske forbindelser anvendes direkte til akvarievandet. I modsætning hertil udvikler museembryo indesluttet i livmoderen, udelukker implantation af kugler, der bærer vejlednings stikord eller administration af funktions-blokerende antistoffer, der ikke krydser placenta. Endvidere kan farmakologiske forbindelser administreres til gravide mor har unønskede bivirkninger, som indirekte kan hæmme embryogenese. Omgå denne begrænsning, har vi udviklet en ex vivo kultur metode til hele mus baghjerne der er kompatibel med FBM neuron migration og overlevelse for 24 timer efter eksplanteres 7,16. Denne metode gør det nemt farmakologisk manipulation, implantation af kugler, der bærer vejlednings stikord eller administration af funktions-blokerende antistoffer og kan også tilpasses til at studere migration af andre neuronale undertyper i baghjerne på forskellige udviklingsstadier.
Denne protokol beskriver whole-mount kultur E11.5 mus hindbrains i et transwell system til at studere migration af FBM neuroner. Protokollen giver mus baghjernen motoriske neuroner skal holdes i live og migrerer i en periode på 24 timer, så ex vivo manipulation. Denne metode har mange eksperimentelle fordele for efterforskerne søger at identificere de molekylære og cellulære mekanismer i neuronal migration. Mens de traditionelle migration assays eksplanterer små neurale væv stykker i matrix på kultur retter og muliggøre observation af individuelle neuroner, som de reagerer på udefrakommende stimuli, en stor fordel ved transwell analysen er dens egnethed til at manipulere migrerer neuroner inden værten orgel miljø og derfor en mere fysiologisk kontekst. Vigtigt er det, kan stofferne let anvendes på de ex vivo baghjernen explanter at teste deres virkning på neuronal migration, omgå mulige bivirkninger forbundet med administering af disse stoffer til en gravid mus. Endelig ex vivo model giver også mulighed for afprøvning af stoffer, der ikke krydser placentabarrieren, såsom funktions-blokerende antistoffer. På grund af disse fordele, ex vivo baghjerne kultur tilvejebringer en alternativ og supplerende metode til at bruge zebrafisk embryoner, som kan behandles med vandopløselige små molekyler i akvariet vand eller i utero elektroporation af embryonale hjerne, som kræver brug af specialiserede udstyr og er sværere at mestre end kulturen her beskrevne teknik. En anden fordel ved protokollen beskrevet her er dens modtagelighed for implantering perler gennemvædet i rekombinant protein eller andre reagenser, således at tillade anvendelse af en standard embryologiske metode udviklet til at manipulere kyllingefostre til en musemodel af neuronal migration. Navnlig kan ex vivo-kultur-modellen anvendes til hindbrains gensplejsede mus defekttive i specifikke molekyler impliceret i neuronal migration, såsom vækst eller vejledning faktor-receptorer, og kombineret med perle implantater at teste, om lydhørhed over for ligander er tabt. Ud over farmakologisk manipulation, kan ex vivo-kultur protokol også tilpasses til at elektroporere ekspressionsvektorer, som kan manipulere ekspressionen af gener af interesse, egnede metoder til elektroporation er tidligere blevet beskrevet 22,23. Denne protokol kan også tilpasses til at visualisere neuron migration ved time-lapse mikroskopi i baghjernen explanter fra transgene mus indeholdende fluorescensmærkede FBM neuroner, fx Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Endelig kan protokollen også anvendes til at studere andre typer migrerende neuroner i baghjerne, såsom dem, der danner ringere oliven, selv om dette ville kræve anvendelse af hindbrains på ældre fosterstadiet og kan kræve kultur i op til 48 timer, afhængigt af neuronal levedygtighed <em> Ex vivo.
Kritiske trin og fejlfinding
For succes i denne protokol, er det afgørende, at embryonerne opsamles tidligt på dagen E11.5 tættere på E11.25, da FBM neuron migration er lige begyndt. Imidlertid er det ikke altid muligt at fange fostrene udviklingsstadiet grund af naturlig parring variabilitet af mus, og derfor kan der være en vis variation i omfang af FBM vandring mellem forskellige eksperimenter. Variabilitet i FBM migration kan også observeres, hvis eksperimentet ikke er afsluttet inden for den tidsramme tildelt, omkring 3 timer, som det kan ses i figur 3E. Baghjerne væv fra E11.25 musefostre er delikat. Ved dissekering og hele eksplantatet procedure, er det vigtigt ikke at rive baghjerne væv i områderne fra R4-R6, hvor FBM neuroner er placeret. På grund af den følsomme karakter af dissfdeling proces, og fordi den hastighed, hvormed hindbrains placeres i kulturen påvirker resultatet, kan proceduren tage et par praksis løber til mester, især før der bruges dyrebare prøver eller reagenser. Endelig er det vigtigt, at baghjerne væv anbringes i en åben bog konfiguration på kulturen indsatsen, da foldning af baghjerne væv under kultur vil forhindre normal FBM migration (se figur 3F).
The authors have nothing to disclose.
MT understøttes af en ph.d. studentship [ref. 092839/Z/10/Z] og CR af en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] fra Wellcome Trust.
Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
Cell culture plates, 12 well | Thermo Scientific | 150628 | |
Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
Recombinant human VEGF165 | R&D systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |