Summary
Embryonale neuronen worden geboren in de ventriculaire zone van de neurale buis, maar migreren naar geschikte doelen te bereiken. Facial branchiomotor (FBM) neuronen zijn een bruikbaar model om neuronale migratie te bestuderen. Dit protocol beschrijft de wholemount ex vivo cultuur van muizenembryo hindbrains naar mechanismen die FBM regulering van de migratie te onderzoeken.
Abstract
Embryonale neuronen worden geboren in de ventriculaire zone van de hersenen, maar vervolgens migreren naar nieuwe bestemmingen om passende doelen te bereiken. Ontcijferen van de moleculaire signalen die gezamenlijk begeleiden neuronale migratie in de embryonale hersenen is daarom belangrijk om te begrijpen hoe de complexe neurale netwerken te vormen die het postnatale leven later ondersteunen. Facial branchiomotor (FBM) neuronen in de muis embryo hindbrain migreren van rhombomere (r) 4 caudaal aan de gepaarde gezicht kernen in de R6-afgeleide regio van de achterhersenen vormen. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor wholemount ex vivo cultuur van muizenembryo hindbrains geschikt om de signaalwegen die FBM regulering van de migratie te onderzoeken. In deze werkwijze worden hindbrains van E11.5 muizenembryo's ontleed en gekweekt in een open boek preparaat celkweek inserts voor 24 uur. Gedurende deze tijd, FBM neuronen migreren naar caudaal r6 en kan worden blootgesteld aan functie blokkerende antilichamen en kleine molecules in de cultuur media of heparine kralen geladen met recombinante eiwitten te rollen voor signaalwegen betrokken bij het begeleiden van neuronale migratie te onderzoeken.
Introduction
Embryonale neuronen worden geboren in de ventriculaire zone van de hersenen, maar vervolgens migreren naar nieuwe bestemmingen aan geschikt doelwit gebieden die zich op grote afstand te bereiken. De juiste positionering van neuronale cellichamen op geschikte plaatsen langs de dorso-ventrale en anterior-posterior assen van de ontwikkelende hersenen is essentieel voor de correcte bedrading, overleving en functie van deze neuronen na het trekkende fase 1-4. Net als de moleculaire mechanismen die axon begeleiding 5-7 beheersen, combinatorische reeksen aantrekkende en afstotende signalen worden verondersteld migreren neuronen 1,8 begeleiden. Vanwege de interactie van meerdere celtypes, de signalen regelen neuronale migratie zijn minder uitgebreid bestudeerd dan degenen die bij axon begeleiding, die autonoom kan worden bestudeerd cel. De ontwikkeling achterhersenen gewervelde dieren is gebruikt in verscheidene recente studies van de moleculaire en cellulaire mechanismen te begrijpenvan neuronale migratie, bijvoorbeeld in kuiken, muis en zebravis 1-4,9. Dit orgel bevat verschillende soorten neuronen, met inbegrip van verscheidene subtypes van precerebellar en motorische neuronen 5,7,10,11.
Achterhersenen motorneuron worden geboren in de ventriculaire zone dicht bij de vloerplaat, en te differentiëren in specifieke subgroepen volgens hun rhombomere van herkomst 1,12. De gezichtsbehandeling branchiomotor (FBM) neuronen worden gegenereerd in rhombomere (r) 4 in de achterhersenen en het uitbreiden van hun axonen dorsally via een r4 uitgang in de tweede kiemboog de gezichtsspieren 2,9,13 innerveren. FBM neuronen van zebravissen en muizen bieden uitstekende modellen om de moleculaire en cellulaire mechanismen van neuronale migratie bestuderen in een proces dat gemakkelijk wordt gevisualiseerd, omdat deze neuronen reproduceerbaar transloceren de somata een spatiotemporeel goed gedefinieerd proces. Bij muizen, FBM neuronen eerste migreren Caudally door R5 en vervolgens zowel caudaal en ventraal hun definitieve standpunt over de pial kant van de achterhersenen op het grondgebied van de R6, waar zij vormen de gekoppelde kernen van de VIIe hersenzenuw (Viin) 10,11,14 bereiken. In de zebravis, FBM neuronen aanvankelijk migreren ventraal en vervolgens richting de R4-r5 grens veranderen om verder te gaan migreren naar het pial oppervlak in een laminin-afhankelijke manier 4,12,15,16. Deze migratie voort gedurende enkele dagen in ontwikkeling en kan worden onderverdeeld in fasen van tangentiële en radiale migratie, waardoor de identificatie van moleculen die deze twee verschillende processen mediëren. In tegenstelling, de FBM neuronen van de embryonale kuiken achterhersenen blijven r4 3,13,17-19.
Tijdens hun migratie, kan FBM neuronen worden geïdentificeerd, net als andere soorten of de motorische neuronen, door hun expressie van de homoeodomain transcriptiefactor eilandje 1 (ISL1) 14. Zo Groothemount immunofluorescentiekleuring of in situ hybridisatie voor deze marker in verschillende ontwikkelingsstadia onthult de verschillende migratiestroom van FBM somata zich uitstrekt van de R4 tot R6 in de zebravis en muis 4,15,16. Bovendien hebben fluorescerende transgene verslaggevers zoals ISL1-GFP gebruikt als geschikte instrumenten voor het visualiseren migreren FBM neuronen in de zebravis 3,17-19. Naast hun geschiktheid voor beeldvorming, hebben vele onderzoekers de migratie van FBM neuronen in zebravisembryo bestudeerd, omdat de vrij levende embryo gemakkelijk worden gemanipuleerd met celtransplantatie technieken en farmacologische samenstellingen rechtstreeks op het aquariumwater. In tegenstelling, ontwikkelt de muis embryo ingesloten in de baarmoeder, zich verzet tegen de inplanting van kralen dragen begeleiding signalen of de toediening van-functie blokkerende antilichamen die de placenta niet passeren. Bovendien kunnen farmacologische verbindingen toegediend aan de zwangere moeder un hebbengewenste bijwerkingen die indirect kunnen aantasten embryogenese. Omzeilen deze beperking, hebben wij een ex vivo kweken werkwijze voor gehele muis achterhersenen die geschikt FBM neuron migratie en overleving 24 uur na geëxplanteerd 7,16 is ontwikkeld. Deze werkwijze maakt een eenvoudige farmacologische manipulatie, implantatie kralen dragen begeleiding signalen of toediening van functie blokkerende antilichamen en kunnen worden aangepast aan de migratie van andere neuronale subtypes studeren in de achterhersenen in verschillende ontwikkelingsstadia.
Protocol
1. Optioneel: Bereid Affi-gel Heparine Beads (Gel Beads) voor FBM Assay attractie
OPMERKING: Bereid gelparels ten minste 1 dag voor aanvang van de explantatie procedure.
- Was 100 pl gel heparine kralensuspensie met steriel PBS gedurende 20 min op een wals bij kamertemperatuur (RT).
- Pellet kralen in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten bij 13.000 x g. Voeg steriele PBS en herhaal het wassen 4x.
- Na de laatste wasbeurt, verwijder PBS en genieten de kralen in een klein volume van een steriele oplossing die het recombinante eiwit van keuze, met zorg om de kralen te bedekken met de oplossing. Dit protocol maakt gebruik van 100 ng / ul recombinant humaan VEGF165 in PBS tot een eerder gepubliceerd experiment 16 reproduceren.
- Incubeer de gel heparine kralen met de recombinante eiwitoplossing gedurende minimaal 12 uur en maximaal 1 week op een wals bij 4 ° C.
2. Coating van Cultuur Inserts
Achterhersenen explantaten zijn gekweekt op Corning cultuur voegt met een 8 micrometer poriegrootte, of gelijkwaardig inserts. Cultuur inserts kunnen worden gebruikt na voltooiing van het protocol, mits gewassen met gedistilleerd water, gesteriliseerd met ethanol en bewaard in 70% ethanol totdat het nodig is.
OPMERKING: De volgende stappen moeten in een stroming kap onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
- Bereid explantatie kweekmedium bestaande uit Neurobasal medium aangevuld met B27 (20 ul / ml), glucose (6 mg / ml) en penicilline / streptomycine (5 ug / ul).
- Wassen cultuur inzetstukken met steriele PBS gedurende 5 minuten en droog gedurende 5-10 minuten onder de stroming kap.
- Plaats een cultuur insert in elke individuele well van een 12well plaat. Opmerking: inserts kan een klein zetje te strak in de put nodig.
- Bedek de inzetstukken cultuur met 10-20 ug / ml muis laminin in Neurobasal medium en leg ze in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO
3. Dissectie van Hindbrains uit E11.5 muizenembryo's
- Cull getimede zwangere vrouwelijke muis met een ethisch goedgekeurde procedure op embryonale dag (E) 11.5 en plaats de baarmoeder met de embryo's in een 100 mm plastic schaaltje met ijskoude L15 medium.
OPMERKING: Alle dissectie maatregelen moeten in ijskoude L15 worden uitgevoerd. - Met behulp van een dissectie microscoop en Dumont horlogemaker pincet nummer 5, scheur de baarmoeder spier muur om de embryo's bloot, laat elk embryo, verbreken de navelstreng, en verwijder voorzichtig de dooierzak.
- Met behulp van een plastic Pasteur pipet met een wide-bore opening, breng elke embryo in een schone plastic schaaltje met ijskoude L15.
- Met behulp van Dumont tang, onthoofden het embryo net boven de voorpoten. Als het experiment vereist genotypering van de embryo's, het verzamelen van weefselmonsters voor genomische DNA-isolatie (bijv. een kleine piece van dooierzak of staartpunt 16,20).
- Draai het hoofd dorsale zijde naar boven en identificeren van de 4e ventrikel, die is bedekt met een dun laagje weefsel (Figuur 2B). Doorboren voorzichtig het dak zelf en beginnen om het afpellen caudaal over de middellijn over de achterste achterhersenen en het ruggenmerg, en rostraal over de middenhersenen. De achterhersenen moet nu worden blootgesteld (figuur 2C).
- Zorgvuldig plagen weg de resterende kop mesenchym en alle hersenvliezen die zijn aangesloten op het pial zijde van de achterhersenen (figuur 2D).
- Verwijder de middenhersenen en het ruggenmerg weefsel zodat de achterhersenen ontvouwt en in een open boek voorbereiding (figuur 2E) plat kan liggen.
- Met behulp van een wide-bore plastic Pasteur pipet elke ontleed hindbrain een 12-wells plaat met ijskoude L15 en bewaar ze op ijs totdat alle hindbrains werden ontleed.
- Met behulp van een wide-bore plastic Pasteur pipet een zondegle achterhersenen een lege schaal, waardoor het een open boek voorbereiding, ventriculaire kant naar boven, in een druppel van ongeveer 100 ul L15.
- Breng enkele microliter van de gel geïncubeerd heparine kralen dezelfde druppel. Opmerking: Door de grootte van de kralen zijn variabel, is het raadzaam om ongeveer 10 kralen overdracht selecteren en een optimale grootte voor transplantatie in de achterhersenen.
- Voeg een kleine scheur in de achterhersenen weefsel en plaats voorzichtig 1-3 gelkorrels in de achterhersenen weefsel ter hoogte van r5 / 6, ongeveer halverwege tussen de middellijn en de zijrand van de achterhersenen, ze verlagen in het weefsel, zodat de kraal is gepositioneerd net onder de achterhersenen oppervlak.
OPMERKING: De dissectie procedure kan tussen 5-20 min / achterhersenen, afhankelijk van de ervaring en kunnen uitstrekken over een langere periode als nesten zijn groot, in ieder geval moet hindbrains in kweek niet langer dan 3 uur na het slachten voor goede resultaten.
4. HindbrainExplantaatkweek
- Verwijder de plaat met de basiselementen uit de incubator cultuur, zuig het laminine coating oplossing.
- Plaats een cultuur insert in een aparte cultuur schotel gevuld met ijskoude L15 en, met behulp van een wide-bore plastic Pasteur pipet elke hindbrain ventrale zijde naar boven op de cultuur insert (figuur 2G). De achterhersenen moet volledig plat op de insert membraan.
- Til de cultuur inzetstuk uit de schaal en dep het meerdere malen op schone tissue om overtollige vloeistof te verwijderen. Dit proces zorgt ervoor dat de achterhersenen zich aan de cultuur insert in een vlakke, open boek voorbereiding. Als de achterhersenen roept, kan haar weefsel onherstelbaar samen groeien.
- Vul het originele 12-well plaat met 500 ul voorverwarmde cultuur media en plaats het inzetstuk terug in dit goed. Zorgvuldig het volume aanpassen met een andere 400-600 ul van media om gewoon de achterhersenen dekken, zodat de achterhersenen niet zwevenuit het membraan. Als drijft terug naar stap 4.4 en herhaal tot de achterhersenen bevestigd blijft aan het membraan.
- In dit stadium is het mogelijk om biologisch remmers van belang aan de media om hun effect op de migratie van FBM neuronen te bestuderen.
OPMERKING: Indien implanteren kralen of andere behandelingen toegediend, wordt aanbevolen om ten minste 2 controle-explantaten onder normale groeiomstandigheden per experiment te handhaven zodat het experiment is opgezet succesvol. - Incubeer explantaten gedurende 24-30 uur in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2).
5. Wholemount immunofluorescentiekleuring van hindbrain Explantaten
- Zuig het medium uit elk putje, spoel in PBS en vast gedurende 2 uur bij 4 ° C onder zacht schudden in ijskoude 4% formaldehyde (vers bereid of vers ontdooid 4% paraformaldehyde in PBS opgelost). Opmerking: Probeer niet om hindbrain van de cultuur inzetstuk voor fixatie verwijderenvoltooid.
- Spoel 3x met PBS. Trek voorzichtig de hindbrains van de inserts culture met behulp van Dumont tang. Sommige explantaten zijn moeilijk los te laten, maar meestal kan worden opgeheven door het toepassen van lichte druk door herhaaldelijk verdrijven PBS uit een pipet.
- Breng de hindbrains tot 2,0 ml met ronde bodem buizen voor immunofluorescentie etikettering. Permeabilize hindbrains gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) in PBS dat 0,1% Triton X-100 (PBT) met zachte rollen.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBT met 10% door warmte geïnactiveerd normaal geit serum met zachte rollen.
- Incubeer explantaten met zachte rollen bij 4 ° C gedurende 5 dagen met primair antilichaam specifiek voor ISL1, 1:100 verdund in PBT met 1% door warmte geïnactiveerd normaal geitenserum.
- Was de explantaten bij KT 4x met PBT gedurende 15 min. elk.
- Incubeer explantaten met zachte rollen bij kamertemperatuur gedurende 3 uur met fluorofoor geconjugeerd geit anti-muis antilichaam (bijv. Alexa Fluor 488 geit antimuis, 1:200 verdund) in PBT met 1% door warmte geïnactiveerd normaal geitenserum.
- Was de explantaten 4x bij KT met PBT gedurende 15 minuten elk met zacht glooiende.
- PostFix de explantaten in 4% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Bedek een glasplaatje met 3 lagen zwarte isolatietape en accijnzen met een scalpel een klein vierkant van de gelaagde band naar een zak voor de explants maken, als alternatief, gebruik dan een depressie glasplaatje.
- Monteer elke achterhersenen in Slowfade reagens in een zak en dek af met een glazen dekglaasje, zorgvuldig vermeden te vangen luchtbellen en beeld met behulp van een confocale laser scanning microscoop.
Opmerking: Als alternatief voor immunokleuring, in situ hybridisatie met riboprobes die FBMS (dwz Isl1 of PHOX2B) herkennen kunnen gebruikt worden om FBM neuronen 16,21 visualiseren.
Overzicht van de stappen en timing
Getimed paring tot E11.25 zwangerschappen verkrijgen: ~ 14 dagen
Optioneel: Bead voorbereiding (protocol 1): ~ 2 uur, op de dag voor embryo isolatie
Bereid cultuur inserts en media (Protocol 2): ~ 30 min, voordat embryo isolatie
Embryo isolatie en achterhersenen dissectie (stappen 3.1-3.4): ~ 10 min / embryo
Achterhersenen dissectie (stappen 3,5-3,7): ~ 5-10 min / hindbrain
Explant procedure (stappen 3,8-3,9): ~ 5-10 min / hindbrain
Optioneel: bead implantatie (stappen 3,10-3,11): ~ 5-10 min / hindbrain
Explantaatkweek (stap 4.7): 24 uur
Fixatie voor antilichaamkleuring (stap 5.1): 2 uur
Kleuringsprocedure en imaging (Protocol 5): 5 dagen
Representative Results
Dit gedeelte geeft voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van FBM neuron migratie in de muis hindbrain door ex vivo cultuur. We zien dat de FBM neuronen in geëxplanteerd hindbrains vanaf dag 11 muizenembryo's eerste tangentiële migratie (figuur 3A) ondergaan en dan beginnen de gezichts motor kernen (figuur 3B), vergelijkbaar met hun gedrag in utero (zie figuur 1) monteren. We tonen verder aan dat de implantatie van een VEGF165 doordrenkte bead trekt FBM neuronen (Figuren 3C en 3D), zoals eerder aangegeven 16. Belangrijk Dit protocol maakt studeren FBM migratie in de afwezigheid van bloedvaten of-vaartuig afgeleide factoren die FBM migratie in utero kunnen beïnvloeden, omdat de nonperfused vasculatuur degenereert in kweek 16. Zo is de onspecifieke bloedcellen labeling waargenomen bij gebruik van de ISL1 muizenantilichaam op versgeïsoleerde muis hindbrains (figuur 1) is niet meer aanwezig in hindbrain weefsel na 24 uur in de cultuur (Figuren 3A-F). Tot slot laten we twee voorbeelden van hindbrains die niet correct werden geëxplanteerd en daarom bevatten FBM neuronen in een abnormale verdeling, hetzij omdat de achterhersenen niet snel genoeg werd explanted na embryo isolatie (figuur 3E) of omdat de achterhersenen weefsel opgevouwen in de transwell ( Figuur 3F).
Figuur 1. FBM neuron migratie Confocal z-stack van wildtype muis hindbrains na ISL1 wholemount immunolabeling en flatmounting;.. De achterhersenen middellijn wordt aangegeven met een sterretje in alle panelen (A) ventriculaire oppervlak van een E11.5 hindbrain in de gebied met ISL1 FBM-positieve neuronen (pijl), waaruit hun tangentiële migratie van R4 tot R6,. de positie van de R4, R5 en R6 is aangegeven (A) Pial oppervlak van een helft van dezelfde achterhersenen in het gebied met de anlage . van een van de gepaarde FBM kernen (aangeduid met Viin), evenals andere ISL1-positieve neuron populaties (B) Ventriculaire oppervlak van een E12.5 achterhersenen met FBM neuronen die tangentieel migreren (pijl), de pijlpunt geven een voorbeeld van een bloedvat met circulerende cellen die aspecifiek worden gelabeld door kruisreactie van anti-muis secundair antilichaam gebruikt voor het ISL1 muis IgG-antilichaam detecteren. (B) Pial oppervlak van een helft van dezelfde E12.5 achterhersenen, dat geheel een van de gepaarde FBM kernen. De middellijn wordt aangegeven met een sterretje in elk paneel. Schaalbalk (alle panelen): 200 micrometer. V, ventrale, P, pial./ 51397fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. E11.5 muis achterhersenen dissectie en ex vivo cultuur. (AE) De belangrijkste stappen in het E11.5 hindbrain dissectie protocol; schaal bar:. 1 mm (A) hoofd van het embryo na het weg van de rest van het embryo in voorpoot niveau werd gesneden (B) Het rostrale deel van de. hoofd werd verwijderd en de rest van de kop weefsel gepositioneerd dat de 4e ventrikel (pijl) naar boven is gericht. (C) Het dak van het 4e ventrikel werd afgepeld, en achterhersenen werd blootgelegd door afpellen weefsel onder de achterhersenen afstand rostraal en caudaal. (D) De pial membraan werd verwijderd (er rekening mee dat in deze exruime sommige cervicale ruggenmerg (SC) weefsel bleef aan de achterhersenen). (E) Overmaat middenhersenen (MB) en het ruggenmerg (SC) weefsel is verwijderd om alleen de achterhersenen behouden. (F) Cultuur inzetstukken werden bekleed met laminine en geplaatst in een 12 well weefselkweek plaat. (G) Elk hindbrain werd geplaatst op een insert en bedekt met media. (H) Schematische weergave van de weg die door de migratie FBM neuronen (blauw) tijdens de 24 uur van de cultuur. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Muis achterhersenen ex vivo cultuur. (A, B) Een E11.5 hindbrain werd gekweekt gedurende 24 uur en immunofluoresc ently gelabeld voor ISL1 te FBM neuron migratie illustreren een explantaat, zowel ventriculaire (A) en pial (B) zijden van de achterhersenen getoond (C, D) E11.5 littermate hindbrains werden gekweekt in aanwezigheid van geïmplanteerde heparine kraal doorweekt. in PBS (C) of VEGF165 (D), mee dat FBM neuronen gemigreerd naar en op de VEGF165 kraal, en de migrerende stroom verlengde daarom verder caudaal ten opzichte van de onbehandelde zijde van dezelfde achterhersenen of achterhersenen met de controlekorrel (E. , F) Voorbeelden van onbevredigende E11.5 hindbrain explantaten, waarin FBMS niet emigreerden uit r4 (E), of waarin de achterhersenen weefsel gevouwen tijdens cultuur (F). De middellijn wordt aangegeven met een sterretje in elk paneel. Schaalbalk (voor alle panelen): 200 urn. V, ventrale, P, pial."> Klik hier voor grotere afbeelding.
Discussion
Dit protocol beschrijft de wholemount cultuur van E11.5 muis hindbrains in een transwell systeem om de migratie van FBM neuronen te bestuderen. Met dit protocol kunt muis hindbrain neuronen in leven en migreren worden bewaard voor een periode van 24 uur, waardoor ex vivo manipulatie. Deze methode heeft vele voordelen voor experimentele onderzoekers die de moleculaire en cellulaire mechanismen van neuronale migratie identificeren. Terwijl traditionele migratie assays explantatie kleine zenuwweefsel stukken in matrix op kweekschalen en maken observatie van individuele neuronen als zij reageren op exogene stimuli, een groot voordeel van de transwell test is de geschiktheid voor migrerende neuronen te manipuleren binnen de ontvangende orgaan milieu en daarmee een fysiologische context. Belangrijk stoffen kunnen gemakkelijk worden toegepast op ex vivo achterhersenen explantaten om het effect te testen op neuronale migratie omzeilen mogelijke bijwerkingen van administering deze stoffen een zwangere muis. Tot slot, de ex vivo model maakt het ook mogelijk het testen van stoffen die niet de placenta, zoals-functie blokkerende antilichamen kruizen. Vanwege deze voordelen, de ex vivo achterhersenen cultuur verschaft een alternatieve en aanvullende manier om het zebravis embryo's, die kunnen worden behandeld met water oplosbare kleine moleculen in het aquariumwater of in utero elektroporatie van de embryonale hersenen, die het gebruik van gespecialiseerde vereist apparatuur en is moeilijker te beheersen dan de kweektechniek beschreven. Een ander voordeel van de hier beschreven protocol is de ontvankelijkheid voor implanteren kralen gedrenkt in recombinante eiwit of andere reagentia, waardoor deze de toepassing van een standaard embryologische methode ontwikkeld om kippenembryo's te manipuleren om een muismodel van neuronale migratie. In het bijzonder kan het ex vivo kweken model worden toegepast hindbrains van genetisch gemanipuleerde muizen defectetief specifieke moleculen betrokken bij neuronale migratie, zoals groei of begeleiding factor receptoren, en gecombineerd met kralen implantaten testen of ontvankelijkheid voor liganden verloren. Naast farmacologische manipulatie, kan het ex vivo kweken protocol worden aangepast aan expressievectoren die expressie van genen plaats kon manipuleren elektroporatie, geschikte werkwijzen voor elektroporatie zijn eerder beschreven 22,23. Dit protocol kan ook worden aangepast aan neuron migratie visualiseren door time-lapse microscopie in hindbrain explantaten van transgene muizen met fluorescent gelabelde FBM neuronen, bijvoorbeeld Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Tenslotte kan dit protocol ook worden gebruikt om andere soorten migreren neuronen in de achterhersenen, zoals die de oliva vormen bestuderen, hoewel het gebruik van hindbrains op latere embryonale stadia vergt en kan cultuur vereist tot 48 uur, afhankelijk neuronale levensvatbaarheid Kritische stappen en het oplossen van problemen Voor het succes van dit protocol, is het cruciaal dat de embryo's in een vroeg stadium verzameld op dag E11.5, dichter bij E11.25, wanneer FBM neuron migratie net is begonnen. Het is echter niet altijd mogelijk om embryo's te vangen in dit ontwikkelingsstadium door natuurlijke paring variabiliteit van muizen en derhalve kan er enige variatie in de mate van FBM migratie tussen verschillende experimenten. Variabiliteit in FBM migratie kan ook worden waargenomen als het experiment niet binnen het tijdskader toegewezen is voltooid, ongeveer 3 uur, zoals te zien in figuur 3E. Achterhersenen weefsel van E11.25 muizenembryo's is delicaat. Wanneer ontleden en gedurende de explantatie procedure, is het belangrijk om niet scheurt de achterhersenen weefsel in het gebied van R4-R6 waarbij de FBM neuronen bevinden. Vanwege de gevoelige aard van de disseel proces, en omdat de snelheid waarmee hindbrains in cultuur worden geplaatst beïnvloedt uitkomst, kan de procedure neemt een paar praktijk loopt te beheersen, in het bijzonder voor kostbare monsters of reagentia worden gebruikt. Tenslotte is het belangrijk dat de achterhersenen weefsel wordt geplaatst in een open boek configuratie op het kweekinsert, omdat vouwen van de achterhersenen weefsel tijdens cultuur niet normaal FBM migratie (zie fig. 3F).
Disclosures
Geen van de auteurs hebben tegenstrijdige belangen of tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
MT wordt ondersteund door een PhD studententijd [ref. 092839/Z/10/Z] en CR door een New Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] van de Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., et al. The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. Biol, D. ev. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -L., Heisenberg, C. -P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
