Summary
Способ количественного нейтрофилов адгезию сообщается. Этот метод создает динамическую среду потока аналогичной той, что встречается в кровеносном сосуде. Это позволяет исследование нейтрофилов адгезии к или очищенных молекул адгезии (лиганда) или эндотелиальных клеток подложки (HUVEC) в контексте подобной окружающей среды в естественных условиях с чистой стресса.
Abstract
Нейтрофилов фирма адгезия к эндотелиальных клеток играет важную роль в воспалении в обоих здоровья и болезни. Процесс нейтрофилов фирмы адгезии включает в себя множество различных молекул адгезии, включая членов семейства интегринов β 2 и их контр-рецепторов семейства ICAM. В последнее время природные генетические варианты в обоих β 2 интегрины и ICAMs, как сообщается, связана с аутоиммунным заболеванием. Таким образом, количественный клей емкость нейтрофилов от физических лиц с различными аллельных форм этих молекул адгезии важно изучить в отношении механизмов, лежащих в основе развития аутоиммунных. Адгезии исследования в системах проточной камеры может создать среду с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях. Здесь мы представляем метод с использованием системы Проточная камера анализа для изучения количественных адгезионные свойства человеческой периферической крови нейтрофиловс до пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) и очищенных лиганд субстратов. С помощью этого метода нейтрофилов клейкие мощности от доноров с различным аллельных вариантов в рецепторов адгезии могут быть оценены и сравнены. Этот способ также может быть модифицирован с целью оценки адгезии других типов первичных клеток или клеточных линий.
Introduction
Генетические варианты в обоих β 2 интегринов и в ICAM лигандов в настоящее время признается, связаны с развитием аутоиммунных 1,2 заболевания. Определение функциональных последствий этих вариантов в клетках, полученных от физических лиц с этих вариантов необходимо для нашего понимания того, как эти варианты способствовать патогенезе аутоиммунного заболевания. Такие функциональные исследования позволяют для определения механизмов, посредством которых природные генетические варианты формируют иммунную реакцию как в норме и при патологии. В конкретном примере, СКВ, мы теперь знаем, что варианты в ITGAM (CD11b) и его лиганд, ICAM-1, сильно ассоциируется с развитием болезни 1,2. Потому что нейтрофилы имеют решающее значение в воспалительных реакциях, количественное исследование нейтрофилов адгезии может обеспечить механистические понимание того, как генетические варианты в ITGAM / ICAM изменить воспаление.
NeutropХиль твердую адгезии эндотелиальных клеток (ЭК) является весьма регулируемым процессом и играет существенную роль в воспалительных реакциях 3,4. Фирма адгезия нейтрофилов следует первоначальный нейтрофилов прокатки и захват на ЕС и в конечном итоге может привести к переселению в естественных условиях. Эти процессы включают много различных видов молекул адгезии, включая ICAM-1, ICAM-2, Р-селектин, E-селектин на эндотелиальных клетках и β 2 интегрины на нейтрофилов 5-9. Таким образом, тщательное количественное нейтрофилов адгезии от доноров с различными аллельных вариантов молекул адгезии будет важно понять, функциональные и патологические последствия этих генетических вариантов.
Экспериментальное использование проточной камеры может создать среду, в пробирке с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях 10-12. Действительно, камера поток анализа в сочетании с человеческой umbiliкал вены эндотелиальных клеток (HUVEC) могут имитировать окружающую среду в естественных условиях кровеносного сосуда. Используя этот метод, можно изучать общие клеточные адгезионные свойства по отношению к эндотелиальных клеток. Кроме того, весьма контролируемой среде проточной камеры также позволяет оценить клетки связывания с очищенными адгезии лигандов, таких как ICAM-1, чтобы облегчить изучение конкретных рецептор-лиганд.
Мы приведем здесь метод, использующий систему Пробирной палаты поток адгезии для изучения адгезионные свойства нейтрофилов периферической крови человека, HUVEC и очищенных лигандов субстратов. Используя этот метод с клетками доноров, выражающих различные варианты аллельных адгезии позволяет оценить, как эти генетические варианты могут изменить человека нейтрофилов твердую адгезию.
Protocol
Все доноры завербованные для этого исследования дали письменное информированное согласие и Исследование было одобрено в университете штата Алабама в Бирмингеме Institutional Review Board.
1. HUVEC Начальная Культура и субкультура
- Культура человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC) в пробирке в полной среде роста, который состоит из эндотелиальных клеток базальной среде (см. список материалов) с добавлением эндотелиальных факторов роста клеток.
Примечание: факторы роста, использованные в этом исследовании, включают в себя: 5 нг / мл человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста (hEGF), 1,0 мг / мл гидрокортизона, 50 мг / мл гентамицина и 50 нг / мл амфотерицина-В (GA-1000), 2 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5 нг / мл фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), 10 нг / мл человеческий фактор роста фибробластов-Basic с гепарином (hFGF-B), 20 нг / мл рекомбинантного инсулиноподобный фактор роста человека ( R 3-IGF-1), 1 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 22,5 мкг / мл гепарина. Полный среднийполучают сначала при 37 ° С и затем может храниться при 4 ° С для использования в течение 1 месяца подготовки. - Для подготовки флягу для клеток, в комплекте ростовую среду добавляют к культуре ткани колбу 75 см 2 (1 мл / 5 см 2) и затем колбу позволило уравновесить до 37 ° С / 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе для не менее 30 мин. Человеком HUVEC будет высевают непосредственно в эту колбу культуры, уравновешенную при плотности 2500-5000 клеток / см 2.
- В то время как средства массовой информации уравновешивания, быстро таять фондового HUVEC криопробирку на водяной бане 37 ° C. Дисперсные ячейки в оригинальный флакон хранения встряхиванием и затем добавить их непосредственно в колбу культуры, содержащей предварительно уравновешенной HUVEC полную питательную среду для достижения плотность 2500-5000 клеток / см 2. Осторожно покачайте колбу, чтобы равномерно распределить клетки, а затем вернуться колбу в инкубатор. Эти клетки в настоящее время представляют 1-й проход. <литий> Средний следует менять каждые два дня, пока клетки не являются 70-80% сливной.
- HUVECs теперь могут быть собраны из культуральной колбы с помощью трипсина / EDTA. Культуральную среду отсасывали из колбы с культурой с последующим ополаскиванием в PBS, чтобы удалить остатки белка и кальция из клеток. Добавлен 0,25% раствор трипсина-ЭДТА и в течение 2-6 мин отрыва клеток должно быть очевидно, как определено с помощью световой микроскопии.
- Когда 90% клеток округлены от пластины, остановить трипсинизации добавлением равного объема ингибитора трипсина 2х. Для облегчения урожай клеток, добавить еще равное количество полной среде роста. Передача отдельные клетки в стерильную 15 мл центрифужную пробирку.
- Центрифуга отдельные клетки при 225 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант, а затем ресуспендирования клеток в 2-3 мл полной среды роста. Определить концентрацию клеток и жизнеспособность, используя гемацитометра и трипанового синего.
- Для использования тыс.э собирают клетки для исследования, повторно семян дополнительно 75 см 2 колбы с клетками при плотности 10000 клеток / см 2 и перейдите к шагу 2.2. Кроме того, клетки могут быть заморожены в этой точке для будущих исследований. Для клеток замораживания, осаждения клеток путем центрифугирования при 225 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте от супернатант и ресуспендируют осадок клеток в FBS, содержащей 10% ДМСО в концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. Клеточную суспензию затем переносили в криопробирки и хранили при -80 ° С после замораживания клеток в клеточной замораживания контейнера.
2. Подготовка HUVEC уровня
- Использование замороженных 2-й прохода HUVECs: возрождение и культура. При использовании активно растущие клетки, перейдите к шагу 2.2.
- Оттепель криопробирку содержащий 2-й проход HUVECs с шага 1.8 быстро в водяной бане при 37 ° C. Трансфер клетки от криопробирку к 15 мл стерильной трубки центрифуги и добавить 10 мл роста Mediмкм.
- Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирации супернатант для удаления остаточного ДМСО.
- Ресуспендируют осадок клеток с полной среде для роста и передавать клеток в 75 см 2 колбы. Добавить питательную среду до общего объема около 20-25 мл и инкубировать при 37 ° С / 5% СО 2.
- Визуально проверьте культуру клеток для слияния каждый день с медиа изменений каждые два дня. Обычно в течение 2-4 дней, клетки будут достигать 80-90% слияния в это время они будут готовы для использования в камере поток анализа.
- Для приготовления блюдо культуры, который будет использоваться в проточной камеры (см. раздел 5), добавить 1 мл 10 мкг / мл фибронектина и 0,05% (вес / объем) желатин в 35 мм блюдо культуры ткани и пипетки несколько раз, чтобы Убедитесь, что вся поверхность пластины покрыта. Снимите чрезмерное фибронектина и раствор желатина и воздух сухой тарелку по крайней мере 30 минут, чтобы оптимизировать образование белковой матрицы. Еibronectin и раствор желатина можно использовать повторно до 10 раз.
- Урожай клетки HUVEC с шага 2.2 с помощью трипсина-EDTA, как описано в шагах 1,5-1,7. Seed 500000 клеток в каждой покрытием блюдо культуры ткани. Добавить 2 средних мл роста в каждом блюде и инкубировать при 37 ° С / 5% СО 2.
- Разрешить клеткам расти до слияния, как в пункте 2.2. Клетки должны быть визуально осмотрены ежедневно со средними изменениями каждые два дня. До проточную камеру анализа, простое HUVEC с 20 нг / мл человеческого TNF-α в течение 4-6 ч, повышения активности и стимулировать экспрессию молекул адгезии.
3. Очищенная лиганд Покрытие
- Нарисуйте круг 0,5 см в диаметре с маркером или ручкой в центре 35 мм блюдо культуры ткани.
- Виброплиты 20 мкл 20 мкг / мл белка А в отмеченной области. Используйте пипетки распространяться белка Раствор для покрытия всей площади внутри круга диаметром 0,5 см. Важно, чтобы не задеть или поцарапать поверхность гиш. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
- Промыть белок с покрытием пластины 3 раза 1 мл PBS (рН 8,0).
- Пластина 50 мкл 1% БСА в отмеченной области блокировать неспецифическое связывание на тарелке. Инкубировать в течение 2 часов при 4 ° С.
- Вымойте заблокированные пластины 3 раза с 1 мл PBS, как в шаге 3.3.
- Подготовьте лиганд-рецептор Fc-адгезия химерных белков решения для покрытия. В этом эксперименте раствор ICAM-1/Fc химера при 25 мкг / мл и P-Selectin/Fc химера на 0,5 мкг / мл в PBS был использован (рН 8,0).
- Покройте отмечены области с 50 мкл субстрата. Выдержите в течение ночи при 4 ° С. Блюдо следует использовать в течение двух дней, а площадь покрытием не следует высыхать. Добавить PBS при необходимости для поддержания 50 мкл раствора на тарелку.
4. Нейтрофилов Разделение (Все стадии проводили при комнатной температуре)
- После получения информированного согласия, собирать участника кровь кровопускания вн антикоагулянт пробирку для сбора крови или Vacutainer (ЭДТА или гепарин). После забора крови, разбавить 1:01 крови с PBS перед разделением.
- Приготовьте два слоя для разделения Ficoll РВМС и нейтрофилов в 50 мл центрифужные пробирки. Сначала добавьте 15 мл с тяжелой Ficoll (см. перечень материалов, ρ = 1.118-1.120), а затем тщательно слой 10 мл свет Ficoll (см. перечень материалов, ρ = 1.077-1.080) в верхней части тяжелой фиколла. Там должно быть резкой границы между светом фиколла и тяжелых слоев фиколл. Наконец, тщательно слой 25 мл разбавленного образца крови на верхней части света Ficoll, не нарушая слой Ficoll.
- Центрифуга трубки при 250 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Примечание: ротора центрифуги тормоз должен быть отключен, чтобы эти спины, чтобы минимизировать потенциальную разрушение разделения клеток во время торможения ротора в конце центрифугирования. После центрифугирования следующие слои (сверху вниз) присутствуют: верхний слой плазмы Фоллоср слоем РВМС на верхней части света Ficoll слоя, нейтрофилов слой с небольшим количеством эритроцитов (RBC) находится между легкой и тяжелой Ficoll последующим тяжелой слой Ficoll и эритроцитов на дне пробирки.
- Урожай и передачи нейтрофилов слой в новую пробирку на 50 мл с пипетку, добавьте PBS до конечного объема 50 мл и центрифуге при 225 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- После центрифугирования, все еще может быть эритроциты, смешанные с нейтрофилов. Аспирируйте супернатант до отметки 10 мл. Ресуспендируют гранул нейтрофилов-RBC по осторожном перемешивании трубки (или краткого низкой скорости вортексе) и затем промыть снова с 50 мл PBS.
- После второй промывки, аспирата супернатант. Для удаления загрязняющих эритроцитов, ресуспендируйте осаждали клетки в остаточной PBS перемешиванием (или короткого встряхивания), добавить 25 мл H 2 O и осторожно вихрь в течение 10 сек лизировать РБК.
- Добавить 25 мл 1,8% NaCl и сразу смешатьцентрифугированием при 225 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Загрязняя РБК теперь должны быть лизируют оставляя белый осадок нейтрофилов клеток.
- Вымойте нейтрофилов осадок клеток с PBS.
- Ресуспендируют изолированных нейтрофилов в RPMI среде с 10% FBS и определения концентрации клеток под оптическим микроскопом с помощью гемоцитометра.
- Регулировка плотности клеток до 500000 клеток / мл с полной RPMI-10% FBS среде.
5. Проточная камера Адгезия Анализ
- Соберите проточную камеру. Поместите 35 мм блюдо, содержащий сливные HUVECs или очищенные лиганды адгезии рецепторов на столе микроскопа. Подключите камеру параллельного потока пластина с шприцевой насос, вакуумную систему и оставить одну строку открыт для входа нейтрофилов. Вставьте проточную камеру в верхней части пластины и закрепить проточную камеру в сборе 13. (См. рисунок 1)
- Запустите программу для записи видео на компьютер, подключенный то микроскоп. Отрегулируйте поля и сосредоточиться микроскопа до чистом поле с полностью выращенных клеток HUVEC или поле в область лиганд покрытие видно.
- Использование шприцевой насос, промыть проточную камеру с RPMI среде. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха внутри камеры или линейный вход нейтрофилов.
- Если желательно, нейтрофилы могут быть загрунтованы с низкой дозе (10 -8 М) FMLP течение 10 мин. Это позволит в течение согласования базального уровня активации нейтрофилов между различными донорами 14.
- Используйте шприцевой насос для введения нейтрофилы в камеру потока в определенных скоростях (скорость 350 мкл / мин, что равно напряжении сдвига 1,5 дин / см 2 используется в данном исследовании). Запишите видео. Потому нейтрофилов адгезия может произойти быстро, видео с длиной 4-5 мин обычно достаточно для количественного адгезии события для анализа.
- Прилипший клеток определяется как клетка, которая перемещается менее одного диаметра клетокв течение 5 секунд на HUVEC или лиганда покрытием поверхности 15,16. Подсчет общего количества прикрепленных клеток в поле, присутствующих в видеозаписи с использованием этого правила. Записывая аналогичные длины видео с нейтрофилов различных доноров, можно вычислить прилипшие клетки / мин сравнить адгезионные свойства между различными донорами.
Representative Results
Примеры нейтрофилов привязки к очищенной лиганда (ICAM-1/P-Selectin) покрытием проточной камеры (рис. 2) или нейтрофилов обязательного к HUVEC покрытием камеры поток анализа (рис. 3) показаны. Как показано на чертежах, нейтрофилы продолжают накапливаться / прилипать к поверхности, покрытой или HUVEC в условиях непрерывного потока. В наших типичных условий эксперимента, мы можем наблюдать 50-70 нейтрофилов человека твердо придерживаясь покрытием поверхности или HUVEC в течение четырех-минутного периода записи. Тем не менее, аллельные варианты молекул адгезии нейтрофилов, или аллельных вариантов в субстрате (очищенный лиганд или HUVEC), может существенно изменить количественный нейтрофилов адгезии 14.
Мы также оценили зависимость от времени нейтрофилов адгезии событий, наблюдаемых в наших исследованиях. В то время как мы поддерживаем условия постоянный поток, вполне возможно, что адгезионные свойства клеток изменяются с течением времени. Нowever, за относительно короткие курсы времени в наших исследованиях, мы не наблюдаем никаких существенных различий в скорости адгезии с течением времени. Например, оценки адгезии на 1-2 пункта минуту времени по сравнению с адгезией наблюдается между 3-4 мин моменты времени не последовательно разные. Конечно, если стимулируются клетки в ходе эксперимента адгезии, то изменения в адгезионных свойств с течением времени можно было ожидать.
В наших исследованиях мы контролировали изоляции индуцированной активации нейтрофилов, намеренно грунтовки клетки с низкой дозой ФМЛФ (10 -8 М) в течение 10 мин до начала исследования. Эндотелиальные клетки (HUVEC в наших исследованиях) также требуют предварительной активации повышать экспрессию молекулы адгезии для оптимального лейкоцитов фирмы адгезии. При отсутствии предварительной обработки, эндотелиальные клетки (HUVECs) будет поддерживать очень мало нейтрофилов адгезии. В наших исследованиях мы использовали 10 нг / мл лечение ФНО для 4-6 часа до использования. IL-1β (10 нг / мл) и ЛПС (0,5-1 мкг / мл) также могут быть использованы предварительно активировать эндотелиальные клетки. Важно отметить, что необработанный HUVEC может быть использован в качестве отрицательного контроля, чтобы обеспечить адгезию клеток обусловлено специфических (рецептор-опосредованного) нейтрофилов и эндотелиальных клеток взаимодействий. Альтернативно, антитела анти-рецепторов могут быть использованы, чтобы блокировать специфические рецепторы, чтобы оценить специфичность адгезии.
Рисунок 1. Конфигурации проточной камеры на столик микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
Выстрелы Рисунок 2 экрана от образца видео нейтрофилов, придерживающихся ICAM-1/P-Selectin поверхность, покрытую в различные моменты времени (:. 0 момент времени, В: 1 раз мин точка, C: 2 раз мин точка, и D: 4 мин момент времени). Концентрация ICAM-1 25 мкг / мл и P-селектин 0,5 мкг / мл. Скорость потока нейтрофилов 350 мкл / мин с плотностью нейтрофилов при 500000 клеток / мл.
Отношение Рисунок 3 Экран из образца видео нейтрофилов прилипших к поверхности, покрытой HUVEC в различные моменты времени (А: 0 момент времени, B: 1 мин момент времени, C: 2 раз мин точкой, и D: 4 мин момент времени)..Скорость потока нейтрофилов 350 мкл / мл с плотностью нейтрофилов при 500000 клеток / мл.
| Вид | Расположение | Напряжение сдвига (дин / см 2) |
| Человек | Общие caroid артерии | 11.6 |
| Человек | Жаберный артерии | 6.5 |
| Человек | Общие бедренной артерии | 4.3 |
| Человек | Надпочечников аорты | 7.3 |
| Человек | Supraceliac аорты | 4.2 |
| Человек | Поверхностная fermoral артерии | 4.4 |
| Человек | Венулы | 0,5-5,0 |
| Человек | Сетчатки первые артериол | 40.2 |
| Человек | Сетчатки второго артериол | 0.001 |
| Человек | Сетчатки первые венул | 23.2 |
| Человек | Сетчатки второго венул | 0.43 |
| Собака | Общие caroid артерии | 15.8 |
| Кролик | Общие caroid артерии | 23.3 |
| Крыса | Общие caroid артерии | 46.6 |
| Мышь | Общие caroid артерии | 64.8 |
| Собака | Общие бедренной артерии | 9.8 |
| Кролик | Общие бедренной артерии | 156,8 |
| Крыса | Общие бедренной артерии | 65.9 |
Стресс Таблица 1. Пример сдвига в различных органах и различных видов.
* Представлены с ссылками 13, 16, 19, и 20.
Discussion
Этот протокол направляет разделение и изоляцию минимально активированных нейтрофилов для тщательного количественного нейтрофилов адгезии под отвесными условиях стресса. Нейтрофилов адгезия критический процесс в воспалении. Поскольку генетические варианты в нескольких молекул в этом процессе были продемонстрированы предрасполагают к развитию аутоиммунного заболевания 1,2, анализ система способна количественно оценить нейтрофилов человека твердое сцепление не требуется. Способ, описанный в данном протоколе позволяет тщательного и количественного определения твердой клейкой потенциала нейтрофилов в контролируемой среде в пробирке под чистой стресса. Этот метод позволяет, таким образом прямое сравнение количественного нейтрофилов адгезии между генотипированных лиц, чтобы определить важность генетической изменчивости в адгезионных молекул 14.
Несколько шагов в этом методе заслуживает отдельного рассмотрения в резуэ высоко количественные и воспроизводимые результаты. При подготовке HUVEC, крайне важно для достижения 100% слияния клеток, прежде чем использовать их в проточной камеры. Для использования поверхности, покрытые очищенным лиганда, площадь подложки покрытие никогда не должны высыхать, чтобы избежать денатурации лиганд. Кроме того, подготовка нейтрофилов человека имеет решающее значение для успеха эксперимента. Ключевые вопросы в изоляции нейтрофилы из крови включают мягко обработки за счет минимизации вихревание, чтобы избежать активации, сохраняя клетки при комнатной температуре (то есть кровь не следует хранить на льду и центрифугирования шаги должны быть выполнены при комнатной температуре) и выполняя выделение и эксперимент в наименьшее количество времени, как это возможно. Существуют дополнительные методы изоляции нейтрофилов, которые также могут быть использованы для подготовки клеток для этих анализов 17,18.
С практической точки зрения, адгезии анализов с помощью Свежевыделенные нейтрофилов человека должна быть начата в течение 3-6 ч после участника кровопускания. Как нейтрофилы чрезвычайно чувствительны к внешнему воздействию, продолжительное время между взятия крови и использования может повлиять опробования результатов. Тщательное определение концентрации клеток нейтрофилов до проточную камеру анализа также необходимо достичь точных и воспроизводимых результатов.
В ходе анализа проточной камеры, важно контролировать видеозапись тщательно, чтобы гарантировать, что скорость потока последовательной и нет турбулентность по всей длине эксперимента. Изменения в скоростях потока или наличие турбулентности потребует, что эксперимент повторить. После эксперимента, важно также, чтобы оценить оставшиеся нейтрофилы микроскопически чтобы гарантировать, что нейтрофилы не слипания. Слипания в этот момент будет означать, что нейтрофилы стали активированный которые могли бы существенно изменить плотность нейтрофилов в ходе эксперимента.
Содержание "> Проточная камера создает около однородной чистой стресс внутри камеры (τ = 6Qμ / (WH 2), где Q = расход, μ = динамическая вязкость и Ш = ширина камеры потока, Н = высота камеру 15 потока). В наших исследованиях мы использовали скорость потока 350 мкл / мин для нейтрофилов присоединения, который создает истинное напряжение 1,5 дин / см 2 (W = 0,25 см, Н = 0,01 дюйма, вязкость воды при 37 ° С (0,007 пуаз) был использован в качестве приближения вязкости RMPI носителя). Для конкретного проточной камеры, можно изменять скорость потока для достижения различных уровней чистого стресса, чтобы имитировать различные физиологические условия. Типичное напряжение сдвига физиологический в кровеносных сосудах человека может диапазоны между 0,5-5,0 дин / см 13,16. напряжение сдвига в других кровеносных сосудов и других животных были представлены в таблице 1 113,16,19 20.В то время как наш метод была сосредоточена на изучении адгезии человека neutrophiлс, этот способ не ограничивается нейтрофилов и может быть легко применен к адгезии или прокатки исследований других типов клеток с простых модификаций. Кроме того, подложки в этом методе может быть изменен для различных целей.
Хотя этот протокол легко адаптируется к различным исследованиям, есть некоторые ограничения. Протокол, как реализуется здесь требуется большое количество первичных клеток для анализа. Это может препятствовать анализ первичных клеток из мелких животных. Кроме того, необходимость иммобилизации очищенных адгезионные лиганды в активном / доступны конформации может ограничить диапазон лигандов. Использование Fc-слитых белков значительно повышает шансы на достижение надлежащего лиганда конформацию на поверхности пластины. Тем не менее, наш метод имеет значительную гибкость, чтобы позволить количественный анализ адгезии событий. Эти исследования значительно повысит наше понимание рецептор-лиганд пар адгезии и потенциальную функцию важность генетических вариантовв этих белков, в патогенезе заболеваний человека.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа проводится при финансовой поддержке Lupus исследовательского института (Нью-Йорк, Нью-Йорк), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 и NIH UL1-TR00165. Мы благодарим доктора Роберта П. Кимберли за его постоянную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
