Teknikken præsenteres her måler stien frit svømme mikroskopiske arter ved hjælp af enkelt bølgelængde eksponering. C. elegans anvendes til at demonstrere skygge billeddannelse som et billigt alternativ til dyre mikroskoper. Denne teknik kan tilpasses til at rumme forskellige orienteringer, miljøer og arter til at måle retning, hastighed, acceleration og kræfter.
Denne undersøgelse viser en billig og enkel teknik, der tillader måling af fysiske egenskaber, såsom position, hastighed, acceleration og kræfter involveret i motorisk adfærd nematoder suspenderet i en vandsøjle, som reaktion på enkelte bølgelængder af lys. Vi viser, hvordan du vurdere bevægelse af en mikroskopisk organisme ved hjælp af enkelt bølgelængde Shadow Imaging (SWSI) ved hjælp af to forskellige eksempler.
Det første eksempel er en systematisk og statistisk levedygtig undersøgelse af den gennemsnitlige afstamning C. elegans i en søjle af vand. For denne undersøgelse, brugte vi levende og døde vildtype C. elegans. Når vi sammenlignede hastigheden og retningen af nematode aktiv bevægelse med den passive afstamning af døde orme i tyngdefeltet, denne undersøgelse viste ingen forskel i descent-tider. Den gennemsnitlige nedstigning var 1,5 mm / sek ± 0,1 mm / sek for både levende og døde orme anvender 633 nm sammenhængendelys.
Det andet eksempel er et casestudie af vælge enkelte C. elegans ændrer retning under nedstigning i en lodret vandsøjle. Acceleration og kraft analyseres i dette eksempel. Dette casestudie viser omfanget af andre fysiske egenskaber, som kan evalueres ved hjælp SWSI mens evaluere adfærd ved hjælp af single bølgelængder i et miljø, der ikke er tilgængelige med traditionelle mikroskoper. Ved hjælp af denne analyse, vi anslået en individuel nematode er i stand til at støde med en kraft på over 28 NN.
Vores resultater viser, at levende nematoder udøve 28 NN når man drejer, eller bevæger sig imod tyngdefeltet. Resultaterne tyder endvidere på, at nematoder passivt ned i en søjle af vand, men aktivt kan modstå tyngdekraften primært ved at dreje retning.
Caenorhabditis elegans er en fritlevende gavnlig jord rundorm, der er en kraftfuld model organisme for at studere mekanismer genregulering, udvikling og mere for nylig for at forstå sensorisk biologi og adfærd. Trods kun 302 neuroner, C. elegans er i stand til komplekse bevægelsesmæssigt mønstre, reproduktive adfærd, navigation, kemotaksi og mange andre adfærd. C. elegans besidder mekanoreceptorer, kemoreceptorer og endda registrere blå bølgelængder af lys (Ward et al. 2008) 1. Mens meget er kendt om den neurale kredsløb af sensomotoriske funktion og generelle bevægelsesmæssigt mønstre i C. elegans, mindre kendt svarene til flere, samtidige stimuli eller mere komplekse miljøforhold, end der kan modelleres under et mikroskop. Enkelte undersøgelser har afsløret mere komplekse bevægelsesmæssigt mønstre, der er meget plastik 2,3,4. Vores metodiske tilgang vil gøre det muligt studier af NEMatodes i opløsning i real tid, hvor vi let kan levere flere miljøforhold samtidig. Dette spørgsmål er vanskeligt at løse ved anvendelse af traditionelle mikroskop baseret billeddannende teknikker. Vi har udviklet en imaging teknik, der giver os mulighed for at placere nematoder i en vandsøjle til at undersøge bevægelsesmæssigt adfærd, samt bestemme kapaciteter af nematoder til at ændre bevægelse som reaktion på forskellige miljøforhold.
Enkelt bølgelængde Shadow Imaging (SWSI) er præsenteret i dette papir for første gang at tage manglerne ved traditionelle mikroskoper. Traditionelle mikroskoper er begrænset til at observere arter i et vandret fokalplan nogle få mikrometer i dybden 5,6. Med hensyn til enkelt bølgelængde studier, de fleste traditionelle mikroskoper bruge farvefiltre til at filtrere hvidt lys meget bredt, typisk 50-100 nm. Ved hjælp af en laser til SWSI indsnævrer valget bølgelængde på mindre end 1 nm, samtidig med at tegnificant lysintensitet 7. Ligeledes har enkelte bølgelængder blevet anvendt til at måle svømning frekvenser C. elegans i realtid 8.
For første demonstration af vores metode, vi overvåger den vandrette position x, og den lodrette position, y, af en frit svømning C. elegans i en vandsøjle, over en afstand på omkring en centimeter. Især er vi interesseret i den lodrette bevægelse, da tyngdekraften fungerer også lodret. Hældningen af en lineær tilpasning til lodret stilling giver den lodrette hastighed, v y af nematoden som det ned i vandsøjlen:
(1)
Den geometriske middelværdi af fejl (RMSE) 9 angiver kvaliteten af pasform og indikerer, om faldende hastighed er generelt konstant. De lodrette hastigheder derefter gennemsnitligt for ØKh arter og døde orme. Ved hjælp af disse resultater, træk, som orme erfaring kan estimeres.
For anden demonstration af vores metode, vi har valgt C. elegans der ikke synke ved en konstant hastighed i modsætning til de fleste af orme overholdes. De udvalgte orme enten vendte rundt og svømmede opad eller svævede et stykke tid, før du fortsætter nedstigningen. Fysisk, denne sag viser undersøgelsen, at der kan beregnes hovedlinjerne i en swimming mikroorganisme. Newtons love dikterer, at et organ, der ændrer retninger accelererer, hvilket indebærer en netto kraft, , Er handler på dette organ 10:
(2)
hvor erden lineære momentum og t er tiden. Accelerationen af ormen er direkte proportional med den kraft, der virker på orm da massen af ormen forbliver konstant. Som et resultat, den lodrette nettokraft er:
(3)
hvor m er massen af en orm og y repræsenterer den lodrette acceleration. Den resulterende kraft i lodret retning repræsenterer derefter ormen drivkraft i samme retning. Den samlede kraft kan beregnes ved at tage den horisontale komponent i betragtning.
Den SWSI teknik giver en ekstra måde at forstå de bevægelsesmæssigt kapaciteter af mikroskopiske organismer som fritlevende nematoder. Med denne teknik har vi skelnet mellem aktiv bevægelse (svømning) og passiv drift på grund af tyngdekraften, der opererer på døde nematoder. Hertil kommer, når fritsvømmende nematoder ændre retning under bevægelse i vand, er vi i stand til at måle trækkræfterne og kantede kræfter, der opererer på nematoder og udøves af nematoder.
Nematoder møde forskellige miljømæssige forhold i jorden. Der er vand lommer i jorden, såvel som faste partikler og biologiske materialer i forskellige former og teksturer. Derudover findes nematoder inden et tyngdefelt miljø, som de reagerer på 14.. Endvidere er nematoder nær overfladen af jorden udsat for forskellige bølgelængder af lys, ændringer i temperatur og fugtighed, samt biologiskvariabler som bakterier, røveriske svampe og jord andre organismer. Nematoder skal reagere på alle disse forskellige variabler, svømning og kravle i forskellige medier, drejning og ændre navigations strategier. Alle disse komplekse beregninger udføres af kun 302 neuroner, en delmængde af dem er involveret i bevægelse, og 95 kroppens væg muskelceller. Målinger af den slags, der er beskrevet af SWSI teknik giver vigtig indsigt i, hvordan nematoder opnå dette navigations kompleksitet.
For den første del har vi målt den generelle faldende sats for vildtype C. elegans i 633 nm lys. Ved hjælp af disse målinger, kan vi estimere trækkraften en orm møder.
For casestudie af en accelererende rundorm, de kræfter involveret forandring uafbrudt siden trækkraften ændringer med hastigheden. Der er nogle udsagn, som vi er i stand til at gøre om de kræfter, der virker på orm. Da ormen bremser og forsøger at swim opad lodrette komposant af trækkraften aftager, indtil den når nul ved det laveste punkt af nematoden udfoldelser. På dette punkt må ormen have en opadgående kraft til at svømme op.
Denne fremgangsmåde kan modificeres på flere måder. Eventuelle mikroskopiske arter, der navigerer i en klar væske kan spores ved hjælp SWSI. Undersøgelser kan udføres med eventuelle bølgelængder, der er tilgængelige for digitalkameraer. Digitale kameraer vil typisk afhente bølgelængder lige fra UV til nær IR. Desuden kan horisontale undersøgelser udføres ved at rette laseren lodret opad. Arterne kan derefter placeres på en vandret transparent overflade, som et mikroskopobjektglas. Justering af strålen expander eller lup efter strålen expander kan skærpe slørede billeder. Brugeren skal sørge for at fastgøre alle komponenter til bordet for at sikre en ensartet og let lyshøjden.
Metoden er begrænset af tilgængelig laser wavelengths og opløsning. Essensen af fordelene ved denne metode i forhold til eksisterende mikroskoper, som er fleksibiliteten i retninger og bølgelængder, er også svagheder, da opsætningen er enkel. De usofistikeret optik og prikker i laser begrænse opløsningen. Nogle af disse ulemper kan sikkert forbedres i fremtiden ved at inkludere rumlige filter og rager billedet direkte på et CCD-kamera.
De mest kritiske trin i protokollen kan nemt læres som eksperimentet udføres for første gang. Lægger nematoden i kuvetten uden at skabe turbulens er kritisk. Desuden kan vibrationer forstyrre setup og ændre adfærd orme. Vær sikker på at begrænse den strøm, som bruges til at skygge billedet. 2 mW for en laserstråle, der er 1 mm i diameter bør være det maksimale for at undgå opvarmning effekter. Opsætningen bør testes for spredning effekter ved brug af andre end destilleret vand væsker.
I øjeblikket mest microscopes operere på et vandret plan ved hjælp af hvidt lys eller farvefiltre, som stadig er meget bred i bølgelængdeområdet. Mikroskoper, der virkelig bruge enkelte bølgelængder og have fleksibilitet i visning scenarie, dvs horisontal placering, er normalt begrænset til en fordel eller det andet. Også disse typer mikroskoper er normalt meget dyre og stadig begrænset til fokusplaner modsætning vores metode. Vores setup kan nemt bygges med et ekstremt lavt budget. Denne metode er klar til at blive brugt af skoler, miljøvirksomheder samt andre enheder, der opererer med få midler. I fremtiden kan denne metode anvendes i et meget sofistikeret setup til at studere realtid virkninger på bevægelse og mechanosensation af mikroskopiske arter. Denne metode gør enkelt bølgelængde studier på en bred vifte af vinkler og visning dybder let tilgængelige.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for den støtte fra Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (ursi), Lucy Maynard Laks Research Fund, NASA prisen No NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence i Videnskab og Teknologi (NSF-CREST) tildele No 0630388 og NSF tildeling nr. 1.058.385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |