Summary
Der beskrives en fremgangsmåde til analyse af protein-nedbrydning under anvendelse af radioaktivt mærket og luciferase-fusionsproteiner i Xenopus æggeekstrakt og dens tilpasning til high-throughput screening for små molekyler modulatorer af proteinnedbrydning.
Abstract
Xenopus laevis æg ekstrakt er en velkarakteriseret, robust system til at studere biokemi af diverse cellulære processer. Xenopus æggeekstrakt er blevet brugt til at studere protein-omsætning i mange cellulære sammenhænge, herunder cellecyklus og signaltransduktionsveje 1-3. Heri beskrives en fremgangsmåde til isolering af Xenopus æg ekstrakt, der er optimeret til at fremme nedbrydningen af den kritiske Wnt vej komponent, β-catenin. To forskellige metoder er beskrevet til at vurdere β-catenin protein nedbrydning i Xenopus æg ekstrakt. En metode er visuelt informativ ([35S]-radiomærket proteiner), mens den anden er lettere skaleret for high-throughput assays (ildflue luciferase-mærkede fusionsproteiner). De beskrevne teknikker kan bruges til, men er ikke begrænset til, vurdere β-catenin protein omsætning og identificere molekylære komponenter, der bidrager til virksomhedens omsætning. Derudover koortet til at oprense store mængder af homogen Xenopus æggeekstrakt kombineret med kvantitativ og facile udlæsning af luciferase, mærkede proteiner tillader dette system nemt tilpasses til high-throughput screening for modulatorer af β-catenin-nedbrydning.
Introduction
Xenopus laevis æg ekstrakt har været brugt i udstrakt grad til at studere mange cellebiologiske processer, herunder cytoskeletal dynamik, nuklear samling og import, apoptose, ubiquitin stofskifte, cellecyklusprogression, signaltransduktion, og protein omsætning 1-17. Xenopus æggeekstrakt system er modtagelig for den biokemiske analyse af en legion af cellulære processer, fordi æggeekstrakt repræsenterer væsentlige ufortyndet cytoplasma, der indeholder alle de væsentlige cytoplasmatiske nødvendige komponenter til at udføre disse processer og muliggøre undersøgelse. Store mængder af æg ekstrakt kan tilberedes på én gang for biokemiske manipulationer, der kræver store mængder materiale (f.eks proteinoprensning eller high-throughput screening) 18-20. En anden fordel er, at koncentrationen af specifikke proteiner i Xenopus æggeekstrakt kan indstilles præcist ved tilsætning af rekombinant protein og / eller immunodepletion af endogenous proteiner i modsætning til transfektion af plasmid-DNA, hvor ekspression af proteinet af interesse er vanskeligt at kontrollere. Derudover kan manglen af tilgængelige rekombinante proteiner overvindes ved tilsætning af transkripter, der koder for proteinet af interesse, der udnytter den frisklavet Xenopus æggeekstrakt høje kapacitet til at omsætte exogent tilsat mRNA.
Reguleringen af protein nedbrydning er afgørende for kontrollen af mange cellulære veje og processer 21. Xenopus æg ekstrakt har været brugt i udstrakt grad til at studere protein nedbrydning, da systemet giver mulighed for flere måder at overvåge protein omsætning uden forstyrrende påvirkninger af transskription og translation. Wnt signalvejen er en meget bevares signalvej, der spiller afgørende roller i udviklingen og sygdom. Omsætningen af β-catenin, den største effektor af Wnt vej, er stærkt reguleret, og en øget steady-state lEvel af β-catenin er kritisk for aktivering af Wnt målgener. Betydningen af β-catenin nedbrydning fremhæves af det faktum, at mutationer i Wnt-vejen, som inhiberer β-catenin nedbrydning findes i ~ 90% af alle sporadiske tilfælde af kolorektal cancer 22. β-catenin nedbrydning af komponenter i Wnt vej kan trofast gentaget i Xenopus æggeekstrakt at studere den mekanisme af sin omsætning, samt at identificere nye småmolekyle modulatorer af dens nedbrydning 2, 19, 20, 23-29.
Fremgangsmåder til fremstilling af Xenopus æggeekstrakt til at studere celle-cyklus er blevet beskrevet i tidligere publikationer JOVÉ 30-32. Den nuværende protokol beskriver en ændring af disse metoder, og er optimeret til nedbrydning af [35S] radioaktivt β-catenin og luciferase-mærkede β-catenin iXenopus æg ekstrakt. Det radioaktivt mærkede nedbrydning assayet giver mulighed for direkte visualisering af protein-niveauer ved autoradiografi. [35S] methionin inkorporeres i proteinet af interesse ved anvendelse af en in vitro translationsreaktion, som derefter kan tilsættes direkte til en forringelse reaktion. Hertil kommer, at det radiomærkede protein turnover assay kræver ikke et antistof mod proteinet af interesse eller et epitopmærke, som kan påvirke proteinstabilitet. Fordi selv små ændringer i protein-niveauerne, som afspejlet i ændringer i intensiteten af det radioaktivt mærkede proteinbånd, let visualiseret ved autoradiografi på [35S]-radiomærket nedbrydning assay udgør en meget nyttig metode til visualisering af protein turnover 2.
Fusion af β-catenin til ildflueluciferase (herefter kaldet blot "luciferase"), giver mulighed for præcise og letkøbte kvantitative målinger af protein niveauer, med henblik påat bestemme de kinetiske egenskaber af β-catenin omsætning 19, 20. En stor fordel ved luciferase assayet er, at det giver et stærkt kvantitativt system, der er let skaleres op. Følgende protokol indeholder enkle fremgangsmåder til at analysere β-catenin nedbrydning og en robust, effektiv og effektiv metode til high-throughput screening af nye β-catenin modulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Xenopus æggeekstrakt
BEMÆRK: Hver frø giver ca 1 ml brugbar æg ekstrakt. Uddrag fra 10 frøer fremstilles typisk på én gang, og mængden af puffer, der er beskrevet nedenfor, er til at udføre en 10 frø Xenopus æggeekstrakt prep. Buffervolumenet kan justeres efter større eller mindre præparater af æg ekstrakt. Preps genereret på denne måde konsekvent opnåelse proteinkoncentrationer ≥ 50 mg / ml. Processen med at indsamle æg og forarbejdning til ekstrakt er mest effektive, når de udføres af to personer. (For grundlæggende frøen dyrkningsteknikkerne se Sive et al. 33).
- Ægudtagning
- Til prime frøerne, injicere hver hun frøen med 100 E Gravide Mare Serum gonadotropin (PMSG) fra en frisklavet 250 U / ml lager. Brug en 3 ml tuberculinsprøjte med en 27 G nål til at injicere subkutant affasningnålen op i den dorsale lymfe vej, som er placeret omkring 1 cm fra midterlinjen fra notched misfarvninger langs længden af benene af frø.
- Opbevar primede frøer i vand (plus 20 mM NaCl, se Sive et al. 33) ved 18 ° C i 5-10 dage. Til stående vand tankanlæg, belægningsgrad cirka 4 L vand pr kvindelige frø. BEMÆRK: Den mindste tid, der kræves til priming kan træde i kraft er 5 dage, og virkningerne af priming aftager efter 10 dage.
- Forbered 0.5x Marc Modified Ringers (MFR) løsning fra en 20x MMR lager. 20x MFR består af 2 M natriumchlorid, 40 mM kaliumchlorid, 40 mM calciumchlorid, 20 mM magnesiumchlorid og 100 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), pH 7,4.
- Opsætning spande for alle injicerede frøer (en Frog per 4 L spand). BEMÆRK: Selv om mere end en frø kan placeres i den samme spand til ægudtagningen, hvis en af de frøerlægger æg overvejende dårlig kvalitet, vil en betydelig del af indsatsen være forpligtet til at skille æg dårlig kvalitet fra dem, der er egnet til fremstilling af ekstrakt. Således at maksimere antallet af frøer i samme tank for at minimere mængden af buffer, der bruges til æg indsamler ikke er risikoen værd.
- Sprøjt 750 U Humant choriongonadotropin (HCG) i dorsale lymfe sæk i hver frø ved hjælp af en 27 G kanyle, som beskrevet i punkt 1.1.1.
- Placér hver af de HCG-indsprøjtning frøer i individuelle 4 L spande indeholdende 0.5x MMR afkølet til 16 ° C.
- Placér beholdere med frøer i en 16 ° C inkubator til at indsamle æg O / N (15-16 timer). BEMÆRK: at opretholde den rette temperatur er kritisk for hele proceduren, fra indsamling af æg til at forberede æg ekstrakt.
- Dejellying Æg
BEMÆRK: Æg er dækket med en gelé pels, der skal fjernes før at gøre ekstrakt. Sandsynligheden for spontan lysis af æg stiger som tiden between æglægning og udtrække forberedelse stiger. Således er det vigtigt at fortsætte gennem følgende trin så hurtigt som muligt.- Forbered 4 l 1x MMR 50 ml 0.1x MMR, og 400 ml 2% cystein, pH 7,7, fremstillet i destilleret vand. Bevar alle opløsninger ved 16 ° C.
- At udvise ekstra æg, forsigtigt klemme den nedre ryg og mave af frøen.
- Fjern frøer og hovedparten af MFR, at lade æggene i ca 1-200 ml MFR i hver spand.
- Fjerne snavs med en overførsel pipette, og vurdere kvaliteten af æg: æg af høj kvalitet er generelt præget af en klar adskillelse mellem det mørkt pigmenterede dyr halvkugle og let farvet vegetal halvkugle og har den højeste mørke-til-lys kontrast. Kassér med en overførsel pipette nogen æg, der vises senet, broget, eller lyseres (hvid og puffy), da de vil mindske den samlede kvalitet af ekstraktet. Hvis> 10% af æggene, er af ringe kvalitet, helebatch skal kasseres.
- Kombiner æg i et 500 ml bægerglas og hæld så meget MFR som muligt og samtidig holde æg neddykket.
- Skyl æg ved forsigtig hvirvlende med dobbelt æg mængden af MMR. Gentag to gange, og fjerne eventuelle rester eller æg åbenbart dårlig kvalitet.
- Der tilsættes ca 100 ml 2% cystein til bægerglasset, vendes forsigtigt for at blande og tillade æg til at nøjes med 5 minutter ved 16 ° C. Hæld cystein. BEMÆRK: Dejellying er præget af den gradvise udseende gelé frakker svæver over æg og mere kompakt pakning af æg, som de nu indtager en mindre volumen uden gelé pels.
- Tilføj yderligere 100 ml 2% cystein, hvirvl forsigtigt, vent 5 min, og derefter langsomt hæld cystein. Gentag indtil æggene er blevet stramt komprimeret (normalt ved den tredje cystein behandling). Bemærk: Hvis æg efterlades for længe i cystein, er de tilbøjelige til at lyse. Tilsvarende dejellied æg er skrøbelige og udsat for mekanisk lysis, hvis deer roteres for voldsomt, eller hvis de udsættes for luft. Når æggene er blevet dejellied, er det vigtigt hurtigt at gå videre til centrifugeringstrin.
- Hæld cystein, og skylle den gelé frakke og andet snavs ved forsigtigt at vaske æg i 1x MMR. Hæld buffer forsigtigt langs siden af bægeret. Gentag to gange, eller indtil MMR løsning ikke længere er uklar. Mens skylning med 1x MMR fortsætter med at fjerne de dårlige æg ved hjælp af en overførsel pipette.
- Udfør en endelig blid skylning med 30 ml 0,1 x MMR, og forsigtigt hæld så meget af bufferen som muligt. Igen, fjern eventuelle tydeligvis dårlige æg.
- Pakning og knusning Æg ved centrifugering
BEMÆRK: der er beskrevet nedenfor, at ekstrakt anvendes til β-catenin nedbrydning er en variant af den cytostatiske faktor ekstrakt (metafase II standset). I modsætning til den lave hastighed og høj hastighed ekstrakt bruges til cellecyklus undersøgelser, mellemliggende hastighed ekstrakt virker bedst for β-catenin nedbrydning. Jegnterphase ekstrakt fremmer ligeledes robust β-catenin nedbrydning selv er mere arbejdskrævende at forberede.- Tilføj Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin blanding (LPA, en proteaseinhibitor) ved 10 ug / ml (fortyndet fra en 10 mg / ml stamopløsning i DMSO) og Cytochalasin D ved 20 ug / ml (fortyndet fra en 10 mg / ml stamopløsning i DMSO) til de resterende 20 ml 0.1x MMR.
- Tilføj 0. X MMR indeholder LPA og Cytochalasin D til de vaskede æg, bland forsigtigt, og der inkuberes i 5 min ved 16 ° C.
- Overfør æg i 16 ° C pre-kølet 50 ml centrifugerør, lade æggene at bosætte sig, og fjerne resterende buffer fra toppen. For at forhindre eksponering for luft, trække en lille mængde buffer i overførselspipetten før tilbagetrækning æg til overførsel. Fortsæt med at overføre flere æg i centrifugerørene og fjerne resterende buffer fra toppen af røret, indtil æggene position centrifugerøret til toppen, hvilket vil maksimere udbyttet afekstrakt.
- At pakke de æg, spin-centrifugerør ved 400 xg i 60 sekunder ved 4 ° C under anvendelse af en rotor med fast vinkel. Fjerne tilbageværende buffer fra toppen af centrifugerørene.
- For knusning spin, spinde rør ved 15.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Indsamling Cytoplasmatisk lag af Extract
BEMÆRK: Den nedenfor beskrevne metode adskiller sig fra den klassiske metode til at punktere siden af centrifugerøret for at indsamle den cytoplasmatiske lag. Denne protokol er blevet tilpasset til forenkling og til brug med bestemte centrifugeglas, som kan genbruges. Ingen nævneværdige forskelle i kinetikken af β-catenin nedbrydning findes med enten metode. På dette tidspunkt ekstrakt bør holdes koldt under hele processen, og alle trin skal udføres ved 4 ° C.- Fjern et hul i lipid-lag ved hjælp af P1000 pipettespids.
- Saml den cytoplasmatiske lag (mellem den mørke pigmenterede lag og liGHT lipidlag) ved hjælp af en ny P1000 pipettespids i rene nedkølede centrifugerør (figur 1). For høj kvalitet ekstrakt, der håndfast nedbryder β-catenin, minimere mængden af pigmenterede og lipid lag, der er trukket tilbage med den cytoplasmatiske lag.
- Spin ekstraheret cytoplasmatisk lag ved 15.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C og igen at indsamle de cytoplasmatiske lag. Gentag spin og udvinding 1X. BEMÆRK: ekstrakt skal være "strå farvet." Hvis der er væsentlig forurening med pigmenterede og lipid lag på dette punkt, kan man gentage spin en gang mere, selv om store spins formindske kapaciteten af ekstrakten til at nedbryde β-catenin.
- Tilføj LPA og Cytochalasin D til ekstraktet i endelige koncentrationer på 10 ug / ml hver. BEMÆRK: Brug den beskrevne metode giver et ret konsekvent total proteinkoncentration på cirka 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separate preps) i Xenopus fxg ekstrakter.
- (Valgfrit) For oversættelse analyser, tilføje capped mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), og energi regenerering mix (2.2.1), og der inkuberes reaktionen ved stuetemperatur i 2 timer (for yderligere information se Saliske et al. 2 og Sive et al. 33). Brug oversatte uddrag straks for β-catenin nedbrydnings assays eller snap-freeze i flydende nitrogen til senere brug. BEMÆRK: Frisklavet ekstrakt har en høj kapacitet til at omsætte exogent tilsat mRNA, men desværre er denne kapacitet tabt, når ekstraktet er frosset. Capped mRNA kan let fremstilles ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits.
- Snap-freeze ekstrakt i flydende nitrogen. BEMÆRK: Uddrag lagres i små (200 ul) portioner til engangsbrug, fordi de hurtigt mister deres evne til at nedbryde β-catenin hvis genfryses. For langtidsopbevaring kan ekstrakt opbevares i flydende nitrogen. For kortvarig opbevaring, kan ekstrakt opbevares ved -80 ° C, selvom kapaciteten of ekstrakt at nedbryde β-catenin kan reduceres drastisk med udvidet opbevaring ved -80 ° C (i mere end 2 måneder).
2.. Forberedelse Extract for β-catenin Nedbrydning Assay
- Udtømning fra Xenopus Extract
BEMÆRK: En stor fordel ved Xenopus ekstrakt er evnen til hurtigt nedbryder dele af en vej og præcist tilføje tilbage en defineret mængde af et protein med henblik på at bestemme dets dosisafhængige virkninger.- Brug frisklavet Xenopus æg ekstrakt eller hurtigt optø frosne ekstrakt og sted på is. Udfør alle manipulationer i kulden.
- Tilføj ekstrakt til 1/10 volumen af pelleteret antistof eller affinitetsperler (fx 20 ml pelleterede perler til 200 ml ekstrakt). For at minimere fortynding af ekstraktet trække så meget væske fra perlerne som muligt, før tilsætning af ekstraktet ved hjælp af gel loading tips med lange, tilspidsede tips.
- Drej ekstrakt-perle blanding ved 4 ° C i 1 time.
- Spin ekstrakt-perle mix på 12.600 xg i mikrofuge ved 4 ° C i 30 sek. Alternativt, hvis der anvendes magnetiske perler, anvendes magnetfelt til at indsamle perler.
- Overførsel forarmet ekstrakt til en frisk mikrocentrifugerør på is. Vær forsigtig med ikke at overføre nogen perler med ekstraktet.
- Bekræft effektiviteten af nedbrydningen ved immunoblotting både forarmet ekstrakt og perler.
- Forbered ekstrakt til β-catenin nedbrydning assay som beskrevet i punkt 2.2.
- Optimering Xenopus Uddrag for β-catenin Nedbrydning
BEMÆRK: β-catenin nedbrydning i Xenopus æg ekstrakt er en energi-afhængig proces, der hurtigt dræner de endogene ATP butikker. Derfor er en energi regenerering system, der kræves for at opretholde robust β-catenin nedbrydning.- Forbered en 20x energi regenerering (ER) blanding bestående af 150 mM kreatin fosfat, 20 mM ATP, 600 ug / ml creatinphosphokinase,og 20 mM MgCl2. ER skal alikvoteres og opbevares ved -80 ° C. Undgå gentagne fryse / tø cykler ved hjælp af små frosne portioner.
- Hurtigt tø Xenopus æggeekstrakt ved at gnide den frosne rør mellem hænderne. Glasset anbringes på is lige før alle ekstraktet er smeltet.
- Tilsæt 10 ul af energi regenerering mix (20x ER) i en portion (200 ul) i Xenopus æg ekstrakt. Bland grundigt ved hurtigt at zappe røret og puls vortex. Puls-spin og straks placere på is.
- (Ekstraudstyr) Omsætningen i β-catenin kan let forbedres i Xenopus æggeekstrakt ved tilsætning af ubiquitin (1,25 mg / ml endelig). Cycloheximid (0,1 mg / ml endelig) kan også tilsættes for at minimere translation af endogene transskripter.
- Afmål de passende mængder for nedbrydning assay i nedkølede mikrofugerør på is. For radioaktivt mærkede β-catenin nedbrydningsprodukter analyser trække 2-5 ml ekstrakt for hvert tidspunkt. </ Li>
3. Radioaktivt mærket β-catenin nedbrydning assay Xenopus æggeekstrakt
BEMÆRK: Alle trin skal udføres på is, medmindre andet er angivet.
- Forberedelse Radiomærket β-catenin
- Forbered frisk in vitro-syntetiseret [35S] methionin-radiomærket protein under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits. NOTE: Generering af 35S-mærket (halveringstid 87 dage) proteiner er let og effektivt produceret ved hjælp af kommercielt tilgængelige in vitro-koblet transkription-oversættelse kits. Det er vigtigt, at det translaterede protein er tilstrækkeligt mærket, således at ændringer i protein turnover let kan visualiseres.
- For at bekræfte en vellykket radiomærkning udføre SDS-PAGE/autoradiography med 0,5 ul af oversatte protein. Kvantificere intensiteten af den radiomærkede β-catenin båndet ved hjælp ImageJ, ImageQuant eller et alternativt kvantitativ software program. BEMÆRK: Det radioaktivt mærkede β-catenin protein band skal være klart synlig på film inden for et par timer (4-6 time).
- Snap-fryse den radiomærkede protein i flydende nitrogen til opbevaring indtil brug. Bemærk: Langvarig opbevaring (> 2 måneder), og flere fryse / tø (større end 2), kan alvorligt påvirke kapaciteten af den radiomærkede β-catenin nedbrydes robust i Xenopus æggeekstrakt. Typisk stabiliteten af radioaktivt mærkede proteiner falder markant efter 1 måneds opbevaring ved -80 ° C; således relativt frisklavet radiomærket β-catenin giver de bedste resultater i disse nedbrydningsprodukter assays.
- Udførelse af β-catenin Nedbrydning Assay
- Læg 1-3 pi (afhængigt af styrken af det radiomærkede bånd signal) af in vitro-translateret β-catenin (og andre proteiner, små molekyler osv., som testes) i 20 ul Xenopus reaktionsblanding på is. Bland grundigt ved quickly svippede røret og en kort puls af vortex; dette er et vigtigt skridt, da Xenopus æg ekstrakt er meget tyktflydende, og ufuldstændig blanding vil påvirke konsistensen af resultaterne. Pulse spin og sted på is.
- Start β-catenin nedbrydning reaktion ved at flytte rørene til RT.
- På det angivne tidspunkt, fjerne 1-5 ml prøve og blandes straks med SDS-prøvebuffer (5x volumen) for at standse reaktionen. For at sikre at nedbrydningen reaktion er helt ophører, svirp rør flere gange og vortex kraftigt.
- Udfør SDS-PAGE/autoradiography. Kør 1 ml ækvivalenter (~ 50 mg protein) af ekstrakten for hvert tidspunkt / lane. Nedbrydning af β-catenin i Xenopus æggeekstrakt skal ses af den tidsafhængige fald i intensiteten af den radioaktivt mærkede β-catenin band Figur 2.. Kvantificer resultater ved hjælp ImageJ, ImageQuant eller andre foretrukne imaging software, hvis det er nødvendigt.
- (Optibørstes) Soak SDS-polyacrylamidgel i fikseringsopløsning (10% eddikesyre og 30% methanol i destilleret vand) før tørring for at mindske baggrunden radioaktivitet og øge kvaliteten af billedet.
4. Β-catenin-luciferase Nedbrydning Assay i Xenopus æggeekstrakt
Udfør alle trin på isen, medmindre andet er angivet.
- Forberedelse β-catenin-luciferase
- Syntetisere ikke-radiomærket luciferase-mærket β-catenin anvendelse af transcription-translation koblet system komplet aminosyre mix.
- Bekræft produktion af luciferase-mærket β-catenin ved måling af luciferaseaktivitet 0,5-1 ul af reaktionen. Vurdere baggrund luminescens ved at måle luminescens fra en utranslateret reaktion mix. Bemærk: Flere kommercielle kits er tilgængelige til at måle luciferaseaktivitet. Langlivet luminescens, arbejder dog særdeles godt for nedbrydningen ASSAy.
- Udførelse af β-catenin-luciferase Nedbrydning Assay
- Tø og forberede Xenopus æg ekstrakt som i 2.2.
- Tilføj in vitro-oversatte β-catenin-luciferase fusion (fra 4.1) i forberedt Xenopus reaktion mix (fra 2,2) på is og bland godt som i 3.2.1. BEMÆRK: Aktiviteten af β-catenin luciferase, der er til ekstraktet er typisk mellem 20 - 50.000 relative luminescens enheder (RLU) / ml ekstrakt (baseret på målinger opnået fra 4.1.2). Fra signalet skal være ca 100.000 RLU (2-5 ml af in vitro-translaterede β-catenin-luciferase fusion).
- Skift ekstrakt til RT at starte nedbrydningen reaktion.
- Fjern en portion af reaktionen på det angivne tidspunkt og snap-freeze i flydende nitrogen. BEMÆRK: Tredobbelte prøver fjernes typisk til analyse for hvert tidspunkt. Frosne ekstrakt kan opbevares ved -80 ° C UNTil de er klar til at blive analyseret.
- Tø prøver is, overføre prøver til standard hvide plader med 96 brønde på is, og proces for luciferaseaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af β-catenin nedbrydning i Xenopus æggeekstrakt er vist i figur 2A. 35S-mærket β-catenin blev inkuberet i Xenopus æggeekstrakt blev portioner (1 ml ekstrakt ækvivalent) fjernes på passende tidspunkter, og prøverne blev udsat for SDS-PAGE efterfulgt af autoradiografi. β-catenin nedbrydning af bestanddele af Wnt pathway'en er medieret af ubiquitin-proteasom system 2 og nedbrydning af [35S]-radiomærket β-catenin i Xenopus ekstrakt hæmmes ved tilsætning af proteasom-inhibitor MG132 figur 2B. Nedbrydning af β-catenin med komponenter i Wnt-vejen afhænger af dets phosphorylering af GSK3p 34. GSK3-afhængige nedbrydning hurtigt kan påvises på flere måder ved hjælp af Xenopus æggeekstrakt: 1) β-catenin (SA) mutant (GSK3 phosphoryleringssteder muteret til alaniner) stabiliseres i Xenopus æggeekstrakt i forhold til vildtype-β-catenin protein figur 2B. 2) småmolekyleinhibitorer af GSK3 (LiCI) ligeledes inhibere nedbrydning af β-catenin (figur 2C). 3) Endelig udtømning af GSK3 fra Xenopus æg ekstrakt hæmmer nedbrydning af β-catenin; nedbrydning kan reddes ved tilsætning af exogent GSK3 Figures 2D-E.
Det radioaktivt mærkede β-catenin nedbrydning analysen giver en særdeles informativ visuel vurdering af tilstanden af nedbrydning (dvs. ubiquitinmedieret nedbrydning versus apoptotic spaltning). Autoradiografi er imidlertid arbejdskrævende, og for det meste begrænset til high-throughput analyse af vejen (f.eks screening for små molekyler modulatorer af Wnt pathway). Den β-catenin-nedbrydning luciferase assay er lettere og hurtigere kvantificerbar som mængden af luminescens udsendes, er direkte proportional med amount af β-catenin-luciferase protein. Denne funktion gør luciferaseassayet enkel og let kan tilpasses til high-throughput assays.
Det er vigtigt at fastslå, at luciferase fusion har lignende egenskaber som den ikke-fusionsprotein. Dette kan bestemmes empirisk ved at fusionere luciferase protein til N-terminalen, C-terminalen, eller internt. Fusion af luciferase til N-eller C-terminalen af β-catenin påvirker ikke dens evne til at aktivere Wnt target gener incultured pattedyrsceller eller dens omsætningshastighed i Xenopus æggeekstrakt 2, 19, 20.
En repræsentativ β-catenin-nedbrydning luciferase assay Xenopus æggeekstrakt er vist i figur 3A, hvor nedbrydning af β-catenin-luciferase blev vurderet ved SDS-PAGE/autoradiography af radiomærket protein og luciferaseaktiviteten af fusionen. Satsen for degradation af β-catenin-luciferase ligner den umærkede β-catenin-protein. Reguleringen af nedbrydning af β-catenin-luciferase fusionen er i det væsentlige identisk med det ikke-fusionsprotein som tilsætning af LiCI eller udtømning af GSK3 resulterede i inhibering af β-catenin-luciferase omsætning. Som vist i figur 3B-C, ændringer i det radioaktive signal af β-catenin-luciferase protein paralleller ændringer i luciferase enzymatisk aktivitet over tid. Et problem, der opstår ved brug af β-catenin-luciferase (især fusionsprotein genereres ud fra in vitro-transskription-translation-system) er baggrunden luciferasesignal forårsaget af brug af interne translationsstart sites eller for tidlig translationel opsigelse Figur 3D. Dette problem kan undertiden overvindes ved at optimere DNA-koncentration, der anvendes i IVT reaktionen. Vi gjorde dog ikke iagttage et fald i baggrunden luciferaseaktivitet når vi varieredeDNA-koncentrationen plasmid til vores særlige β-catenin-luciferase-konstruktionen. Det er sandsynligt, at vi bliver nødt til at ombygge fusionsproteinet via mutagenese for yderligere at mindske interne translationelle start-sites og / eller for tidlig translationel afslutning af β-catenin-luciferase fusionsprotein. Fordi luciferase protein er ret stabil over tidsforløbet for nedbrydningen reaktion i Xenopus æggeekstrakt 3A, men denne baggrund signal kan simpelthen trækkes hvis forholdet mellem det trunkerede luciferase protein til fuldlængde-β-catenin fusion er kendt .
En styrke luciferaseassay er evnen til at skalere til en multi-brønds format, der tillader udførelse af high-throughput screening for modulatorer af β-catenin-nedbrydning. I figur 4 er et repræsentativt skakternet analyse vist med en inhibitor af β-catenin nedbrydning, MG132, som hæmmer proteasom. Resultatet af skakbræt-eksperiment viser, at assayet er en ensartet og reproducerbar i en 96-brønds format og demonstrerer dens egnethed til high-throughput screening.
Figur 1.. En skematisk fremstilling af præparatet af koncentreret Xenopus æg ekstrakt. Æg er indsamlet fra HCG-indsprøjtning Xenopus laevis hunner, komprimeret med en lav hastighed (400 xg) spin, og knust og adskilt med en medium-speed (15.000 xg ) spin. Vær omhyggelig med at injicere subkutant i den dorsale lymfe vej, fjerne de dårlige æg grundigt og omhyggeligt adskille høj kvalitet cytoplasmatisk ekstrakt fra den nederste kvalitet mørkere ekstrakt som nævnt i teksten.
igur 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figur 2. Β-catenin nedbrydes robust, når de inkuberes i Xenopus æggeekstrakt. A) en skematisk afbildning af et nedbrydningsprodukt assay. B) [35S]-mærket β-catenin fremstillet ved en IVT reaktion nedbrydes robust, når de inkuberes i Xenopus æggeekstrakt. Tilsætning af MG132 (200 uM) til Xenopus æggeekstrakt inhiberer β-catenin-nedbrydning. Mutation til alaniner af GSK3 phosphosites inden β-catenin (β-catenin SA) eller tilsætning af LiCI (25 mM) C) inhiberer β-catenin-nedbrydning. D) GSK3 bindingssted Axin (aminosyrerne 506-560) effektivt udtømmer GSK3 fra Xenopus æggeekstrakt. E) GSK3-udtømte Xenopus æggeekstrakt inhiberer β-catenin nedbrydning og kan reddes ved tilsætning of rekombinant GSK3 (0,1 mg / ml). Tilsætning af LiCl (25 mm) blokerer kapacitet af rekombinant GSK3 at redde β-catenin nedbrydning i GSK3-udtømte ekstrakt. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Luciferase-mærket β-catenin nedbrydes, når de inkuberes i Xenopus æggeekstrakt. A) Radiomærkede β-catenin-luciferase nedbrydes ved en hastighed, der svarer til umærkede β-catenin-protein. Som med vildtype-protein, tilsætning af LiCI (25 mM) inhiberer β-catenin-luciferase nedbrydning. Luciferase alene ikke mærkbart vende sig i Xenopus æg ekstrakt. Ændringer i luciferaseaktivitet af β-catenin-luciferase fusion parallelle ændringer i sine protein niveauer. B) Tilsætning af LiCl (25 mm) eller udtømning af GSK3 C) hæmmer β-catenin-luciferase omsætning som vurderet ved at måle luciferaseaktivitet. D) Immunoblotting til in vitro oversat β-catenin- luciferase (ved hjælp af et anti-luciferase antistof) afslørede betydelige mængder af gratis luciferase protein i bestemte preps der sandsynligvis bidrager til den højere baggrunden i forhold til den radioaktivt mærkede nedbrydning analysen. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Reguleret nedbrydning af β-catenin-luciferase i Xenopus ekstrakt kan tilpasses tilen high-throughput format. Et repræsentativt skakbræt-analyse for β-catenin-luciferase hjælp MG132 (450 uM) som en inhibitor af β-catenin-nedbrydning. Skraverede kolonner angiver MG132-behandlede brønde og lysere søjler repræsenterer køretøj (DMSO)-behandlede brønde. Kvantificering og beregningsresultat Z-faktor i en score på 0,3 indikerer en acceptabel assay for potentielle anvendelse i high-throughput screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus æg ekstrakt er et robust biokemisk system til at undersøge β-catenin omsætning. Koncentrationen af β-catenin i Xenopus æggeekstrakt er ~ 25 nM 2. Under optimale betingelser ægget ekstrakt er i stand til at nedbryde β-catenin med en hastighed på 50-100 nM / time og halv-maksimal ved 200 nM 24. Der er flere kritiske trin for vellykket rekonstituering af β-catenin nedbrydning hjælp Xenopus æg ekstrakt. Disse omfatter 1) generering af høj kvalitet Xenopus æggeekstrakt og den måde, hvorpå æggeekstrakt fremstilles, 2) at skabe kvalitet radiomærket β-catenin og β-catenin-luciferase protein, 3) at optimere reaktionsbetingelser til støtte β-catenin nedbrydning og 4 ) korrekt behandling af reaktions tidspunkter.
Et præparat af høj kvalitet Xenopus æggeekstrakt, hvor β-catenin er robust nedbrydes afhænger af både kvaliteten af the æg og hvor æggene håndteres forud for knusning trin, samt hvordan Ekstrakten centrifugeres derefter for at opnå det endelige ekstrakt. Som nævnt i protokollen, er det vigtigt at sikre, at æg kun høj kvalitet (dokumenteret ved skarp kontrast mellem den mørke dyr halvkugle og lys vegetal halvkugle), på, at æg dårlig kvalitet (træede, plettede, eller hvide puffs) fjernes i hele den proces, at æg holdes ved en kølig temperatur (16 ° C) under hele proceduren, og at proceduren udføres så hurtigt som muligt. Det er vigtigt ikke at ofre kvalitet til mængde ekstrakt. Derudover, som tidligere nævnt, æg fra en frø, der lægger æg dårlig kvalitet (> 10%) skal være helt kasseres.
Den ovenfor beskrevne ekstrakt er en modifikation af meiose II anholdt CSF ekstrakt 11. Udarbejdelsen af Xenopus æg ekstrakt til β-catenin nedbrydning (mellemliggende hastighed uddrag) differs fra klassiske ekstrakter forberedt til at studere celle cyklus 30-32, der er lav hastighed eller høj hastighed udtrækker 35. Tilpasning Xenopus æg ekstrakt for optimal nedbrydning af andre proteiner kan kræve ændring af centrifugeringshastigheden og antal spins. Low-speed ekstrakt indeholder intakte organeller og andre store cellulære komponenter. Således vil højere hastighed spin ændre sammensætningen af ekstrakten og potentielt fjerne hæmmende og / eller væsentlige komponenter, der vil påvirke nedbrydningen af proteinet af interesse. Fremstillingen af mellemprodukt hastighed ekstrakt beskrevet heri er optimeret til nedbrydning af β-catenin med komponenter i Wnt-vejen. Spinning ekstraktet større end 4X kan markant reducere kapaciteten af ekstrakten til at nedbryde β-catenin (selvom det har minimal effekt på nedbrydningen af en anden Wnt komponent Axin). β-catenin er modtagelige for caspase-medieret proteolyse i lav hastighed centrifugering ekstrakt og ikke noticeably nedbrydes i høj hastighed centrifugering ekstrakt. Således er det sandsynligt, at forskellige hastighed ekstrakter vil være optimal for nedbrydning af bestanddele af andre signalveje.
Frembringelsen af 35 S-β-catenin og β-catenin-luciferase kan udføres ved hjælp af et antal kommercielt tilgængelige kits. Protein produktion ved hjælp af transkription-oversættelse koblede systemer er meget afhængig af kvaliteten af plasmid: meget rene midi-præparater af plasmider arbejde bedre og er mere pålidelige i forhold til DNA mini-præparater. Til radiomærkning β-catenin, frisk fremstillet [35S] methionin eller Translabel ([35S] methionin plus [35S] cystein) foretrækkes. Bemærk, at methionin og cystein begge har en tendens til at oxidere med langvarig opbevaring dermed mindske deres inkorporering i β-catenin i in vitro transcription-translation koblet reaktion. Fordi længere tids opbevaring og gentagne fryse-optøningcyklusser kan hæmme nedbrydningen, er små mængder af radioaktivt mærket β-catenin udarbejdet på et tidspunkt og anvendes snart efter.
Mængden af protein oversat og antallet af methioniner i proteinet bestemme styrken af den radiomærkede signal. For β-catenin, bør der ikke være problemer med at få stærke radioaktive signaler for nedbrydningsprodukter assays. For proteiner med få methioniner og / eller som ikke oversætte godt, en [35S] methionin og kan [35S] cystein blanding anvendes i stedet for [35S] methionin og / eller tilsættes et epitopmærke (Myc), som indeholder flere methioniner. Selv om succes med forskellige ekspressionsplasmider indeholdende de relevante fag-promotorer (T7, T3 og SP6) kan fås for in vitro reaktioner transkription-oversættelse, pCS2-baserede plasmid generelt giver de bedste resultater. Hertil kommer, at signalet fra translaterede protein kan undertiden øges dramatisk ved at slette det endogene 5'UTR. Endelig for storskalaforsøg (f.eks high-throughput screening), kan kræves en stor mængde af rekombinant β-catenin-luciferase. β-catenin-luciferase fra Sf9 / baculovirussystem nedbrydes med lignende kinetik som vildtype-β-catenin i Xenopus ekstrakt og embryoner 2. Alternativt kan et højt udbytte af in vitro ekspressionsanalyse (f.eks hvedekim-baseret) er med held blevet anvendt til high-throughput screening 19, 20.
For pålideligt at måle nedbrydningen af β-catenin i ekstrakten system, er det vigtigt, at det første signal fra enten radioaktivt mærkede β-catenin eller luciferase β-catenin fusion er tilstrækkeligt robust. Således vis mængde af optimering af eksperimentatoren på størrelsen af nedbrydningen assay antal tidspunkter nødvendigt, og effektiviteten af in vitro translationsreaktionen will være påkrævet. Ved montering af nedbrydningen reaktion, der er flere skridt man kan tage for at forbedre chancen for at opnå robust nedbrydning. For det første skal alle reagenser optøs hurtigt og placeres på is forud for deres fuldstændige tø. Da nedbrydning af β-catenin er meget energiafhængig, er det vigtigt, at ER er relativt frisk. Andet Xenopus æggeekstrakt er tyktflydende, og det er afgørende, at reaktionen er fuldstændig blandet efter tilsætning af radioaktivt mærket β-catenin/β-catenin-luciferase fusion, ER, protein, lille molekyle modulatorer osv. tredje præ-inkubering af reaktionen bland i 20-30 minutter på is giver mere reproducerbare resultater ved test af virkningerne af de små molekyle modulatorer.
Evnen til at udtømme proteiner fra Xenopus æg ekstrakt er et effektivt redskab til at vurdere proteinernes funktion og deres koncentrations-afhængige effekter. Som et eksempel, viser vi, at nedbrydende GSK3 fra XeNOPUS æggeekstrakt blokerer nedbrydningen af β-catenin, der angiver den vigtige rolle GSK3 β-catenin omsætning. Forskellige depletion forhold skal bestemmes empirisk for forskellige proteiner. For eksempel vil rigelige proteiner kræver en stigning i mængden af antistof eller affinitetsligand perler, der anvendes for at opnå fuld udtynding. Et godt udgangspunkt er at bruge pakkede perler med 1/10 volumen af ekstraktet for at minimere ekstrakt fortynding. Ud over styrken af binding af antistof / affinitetsligand til målproteinet, typen af kugler (fx sepharose, agarose eller magnetiske) anvendes, kan påvirke effektiviteten af protein udtømning fra Xenopus æggeekstrakt 36. Endelig ville det være ideelt at undersøge omfanget af depletion (typisk ved immunoblotting). Når β-catenin reaktionen er afsluttet, kan den måde, hvorpå prøverne behandles stor betydning for resultatet af forsøget. Koncentrationen afXenopus æggeekstrakt præparationer fremstillet på den beskrevne måde er 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, og det er vigtigt ikke at overbelaste kapaciteten af SDS-PAGE-gel; dette er ikke et problem med luciferase-β-catenin-assay. Således for hvert tidspunkt, ikke mere end 1 ml svarende ekstrakt skal fyldes i hver bane af en SDS-PAGE-gel. For yderligere at forbedre kvaliteten af de resultater, vil gelen fiksationstrin (valgfrit) falde baggrundsradioaktivitet og øge signal-støj-forholdet. For luciferaseassayet, et fald fra et første signal på 100.000 RLU i Xenopus æggeekstrakt trofast afspejler ændringen i protein-niveauer af β-catenin-luciferase fusionsprotein.
Xenopus æggeekstrakt systemet repræsenterer et attraktivt system til at studere reguleringen af β-catenin nedbrydning. Ekstraktet Systemet giver mulighed for præcis styring af koncentrationen af enkelte proteiner via udtømning og rekonstituering tion. Kapacitet til at overvåge deres virkninger på kinetikken af β-catenin omsætning over tid giver mulighed for en bedre forståelse af biokemiske mekanisme af dette afgørende skridt i Wnt signaltransduktion. Sådanne manipulationer har givet dyb indsigt i de komplekse molekylære interaktioner mellem komponenter i Wnt vej og var afgørende for udviklingen af den første matematisk model af Wnt vej 24. En hage er, at koncentrationerne af Wnt pathway komponenter i Xenopus æg ekstrakt og pattedyr cellelysater har vist sig at afvige, muligvis afspejler forskelle i den måde, Wnt vej reguleres under embryogenese versus voksne situationen 37. Evnen til at udføre både radioaktive og enzymatiske, luciferase assays hjælp Xenopus æg ekstrakt giver ekstra kraftige supplerende kvalitative og kvalitative værktøjer til at studere den biokemiske regulering af β-catenin nedbrydning.
t "> Ud over at overvåge omsætningen af β-catenin, kan nedbrydning af den negative Wnt regulator, Axin, overvåges i Xenopus æggeekstrakt enten som et radioaktivt mærket protein eller fusion til luciferase. Ved hjælp af en variant af luciferase, Renilla fusioneret til Axin, er tidligere blevet tilpasset til luciferase nedbrydning assayet i en high-throughput format til samtidig screening for modulatorer af to Wnt pathway proteiner, β-catenin og Axin 19, 20. Denne biokemisk screening identificerede FDA-godkendt lægemiddel, pyrvinium at en øget og reduceret nedbrydningshastighed β-catenin og Axin henholdsvis i Xenopus æggeekstrakt 19. Pyrvinium blev efterfølgende valideret i dyrkede humane celler og i forskellige modelorganismer (fx Xenopus og C. elegans) som et lille molekyle hæmmer af kanoniske Wnt vej. Sammenfattende Xenopus æggeekstrakt system er et alsidigt biokemisk system, that kan udnyttes i en lang række forskellige måder at undersøge den mekanisme af Wnt signalering samt til identifikation af små molekyler modulatorer af Wnt-vejen. Den biokemiske fremgangsmåde, der er beskrevet heri, kan anvendes på andre signalveje, hvor proteinnedbrydning kan spille en afgørende rolle.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Laurie Lee til kritisk læsning af manuskriptet. TWC er understøttet af en American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB er støttet af en National Cancer Institute uddannelse tilskud (T32 CA119925). SSH er støttet af National Institutes of Health (R01DK078640). EL er støttet af National Institutes of Health (R01GM081635 og R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
