Een werkwijze wordt beschreven voor het analyseren eiwitafbraak met radioactief gemerkt en luciferase-fusie-eiwitten in Xenopus ei extract en de aanpassing voor high-throughput screening kleinmoleculige modulatoren van eiwitafbraak.
Xenopus laevis ei extract is een goed gekarakteriseerd, robuust systeem voor het bestuderen van de biochemie van diverse cellulaire processen. Xenopus ei extract gebruikt om eiwitturover studeren in vele cellulaire contexten, zoals de celcyclus en signaaltransductie 1-3. Hierin wordt een werkwijze beschreven voor het isoleren Xenopus ei extract die is geoptimaliseerd om de afbraak van de kritische Wnt component, β-catenine bevorderen. Twee verschillende methoden beschreven β-catenine eiwitafbraak beoordelen Xenopus ei extract. Een methode is visueel informatief ([35 S]-radioactief gemerkte eiwitten), terwijl de andere gemakkelijker geschaald voor high-throughput assays (vuurvlieg luciferase-gemerkte fusie-eiwitten). De beschreven technieken kunnen worden gebruikt, maar zijn niet beperkt tot, beoordelen β-catenine eiwit omzet en identificeren van moleculaire componenten die bijdragen aan de omzet. Bovendien, de Abilheid om grote hoeveelheden homogene Xenopus ei extract gecombineerd met kwantitatieve en gemakkelijke uitlezing van luciferase-gemerkte eiwitten te zuiveren kan dit systeem eenvoudig worden aangepast voor high-throughput screening op modulators van β-catenine afbraak.
Xenopus laevis ei extract is uitgebreid gebruikt om vele celbiologische processen, waaronder het cytoskelet dynamiek, nucleair geheel en import, apoptose, ubiquitine metabolisme, voortgang van de celcyclus, signaaltransductie en proteïne omzet 1-17 bestuderen. De Xenopus ei extract systeem vatbaar is voor de biochemische analyse van een legioen van cellulaire processen, omdat ei extract vertegenwoordigt in wezen onverdund cytoplasma dat alle essentiële cytoplasmatische componenten die nodig zijn om deze processen uit te voeren en in staat onderzoek bevat. Grote hoeveelheden ei extract kan worden bereid in een keer voor biochemische manipulaties die grote hoeveelheden materiaal (bijvoorbeeld eiwitzuivering of high-throughput screening) 18-20 vereisen. Een ander voordeel is dat de concentratie van specifieke eiwitten in Xenopus ei extract nauwkeurig kan worden ingesteld door toevoeging van recombinant eiwit en / of immunodepletie van endogenous eiwitten in tegenstelling tot transfectie van plasmide-DNA waarbij expressie van het eiwit van interesse is moeilijk te controleren. Bovendien kan het gebrek aan recombinante eiwitten worden overwonnen door de toevoeging van transcripten coderend voor het eiwit van belang te maken van hoge capaciteit de vers bereide Xenopus ei extract aan toegevoegd exogeen mRNA te vertalen.
De regulering van eiwitafbraak is van cruciaal belang voor de bestrijding van vele cellulaire mechanismen en processen 21. Xenopus ei extract is uitgebreid gebruikt om afbraak van eiwitten te bestuderen als het systeem maakt het mogelijk voor meerdere manieren om eiwitturover controleren zonder verstorende invloeden van transcriptie en vertaling. De Wnt signaleringsroute is een sterk geconserveerd signaalweg dat cruciale rol bij ontwikkeling en ziekte speelt. De omzet van β-catenine, de belangrijkste effector van de Wnt-route, is sterk gereguleerd, en een verhoogde steady-state lEvel van β-catenine is essentieel voor de activatie van de Wnt doelgenen. Het belang van β-catenine afbraak wordt benadrukt door het feit dat mutaties in de Wnt route die β-catenine afbraak remmen in ~ 90% van sporadische colorectale kanker 22. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt-route kan getrouw worden samengevat in Xenopus ei extract om het mechanisme van de omzet bestuderen en om nieuwe kleine molecuul modulatoren afbraakproducten 2, 19, 20, 23-29 identificeren.
Werkwijzen voor de bereiding van Xenopus ei extract voor het bestuderen van de celcyclus zijn beschreven in eerdere publicaties Jupiter 30-32. Het huidige protocol beschrijft een aanpassing van deze werkwijzen en geoptimaliseerd voor de afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-catenine en luciferase gelabeld β-catenine inXenopus ei extract. De radiogelabelde degradatie assay maakt directe visualisatie van eiwitniveaus via autoradiografie. [35 S] methionine wordt opgenomen in het eiwit van interesse met een in vitro translatiereactie die dan direct worden toegevoegd aan een afbraakreactie. Bovendien is het radioactief gemerkte eiwit omzet assay geen antilichaam tegen het eiwit van belang of een epitoop-tag die eiwitstabiliteit beïnvloeden vereisen. Omdat zelfs kleine veranderingen in eiwitniveaus, zoals blijkt uit veranderingen in de intensiteit van het radioactief gemerkte eiwit band, worden gemakkelijk gevisualiseerd door autoradiografie, de [35S]-radioactief degradatie assay is een zeer bruikbare werkwijze voor visualisatie eiwit omzet 2.
Fusie van β-catenine om vuurvlieg luciferase (hierna eenvoudig "luciferase") maakt nauwkeurige en gemakkelijke kwantitatieve metingen van eiwitniveaus, teneindede kinetische eigenschappen van β-catenine omzet 19, 20 bepalen. Een groot voordeel van de luciferase assay is dat het een krachtig kwantitatief systeem dat gemakkelijk opgeschaald. Het volgende protocol voorziet in eenvoudige werkwijzen voor het testen β-catenine afbraak en een robuuste, efficiënte en effectieve methode voor high-throughput screening van nieuwe β-catenine modulatoren.
Xenopus ei-extract is een robuust biochemisch systeem voor het onderzoeken van β-catenine omzet. De concentratie van β-catenine in Xenopus ei extract ~ 25 nM 2. Onder optimale omstandigheden, het ei extract kan afbreken β-catenine met een snelheid van 50-100 nM / uur en half-maximaal bij 200 nM 24. Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle reconstructie van β-catenine afbraak berekend Xenopus ei extract. Deze omvatten 1) het genereren van hoge kwaliteit…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Laurie Lee voor het kritisch lezen van het manuscript. TWC wordt ondersteund door een American Heart Association predoctorale Fellowship (12PRE6590007). MRB wordt ondersteund door een National Cancer Institute opleiding subsidie (T32 CA119925). SSH wordt ondersteund door National Institutes of Health (R01DK078640). EL wordt ondersteund door de National Institutes of Health (R01GM081635 en R01GM103926).
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
ATP | Sigma | A2383-5G | |
Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
Name of Equipment | Company | ||
FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
16°C Incubator | Percival Scientific |