Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine usando radioattivo e proteine luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.
Xenopus laevis estratto uovo è un ben caratterizzato, robusto sistema per studiare la biochimica di diversi processi cellulari. Estratto uovo Xenopus è stato usato per studiare il ricambio proteico in molti contesti cellulari, tra cui il ciclo cellulare e trasduzione del segnale percorsi 1-3. Qui, è descritto un metodo per isolare estratto uovo Xenopus che è stato ottimizzato per promuovere la degradazione della componente pathway Wnt critico, β-catenina. Due diversi metodi sono descritti per valutare β-catenina degradazione delle proteine in estratti di uova di Xenopus. Un metodo è visivamente informativo ([35 S] radiomarcato proteine), mentre l'altro è più facilmente scalato per saggi high-throughput (lucciola proteine di fusione luciferasi-tagged). Le tecniche descritte possono essere utilizzate per, ma non sono limitati a, valutare β-catenina turnover proteico e identificare i componenti molecolari che contribuiscono al fatturato. Inoltre, la poslità di purificare grandi volumi di omogenea estratto uovo Xenopus combinata con la lettura quantitativa e facile di proteine luciferasi-tag permette questo sistema di essere facilmente adattato per screening ad alto rendimento per modulatori di degradazione β-catenina.
Estratto uovo Xenopus laevis è stato ampiamente utilizzato per studiare molti cellulari processi biologici, tra cui la dinamica del citoscheletro, l'assemblaggio e l'importazione nucleare, l'apoptosi, il metabolismo ubiquitina, progressione del ciclo cellulare, trasduzione del segnale, e proteine fatturato 1-17. Il sistema estratto uovo Xenopus è riconducibile alla analisi biochimica di una legione di processi cellulari perché estratto uovo rappresenta sostanzialmente citoplasma non diluito che contiene tutti i componenti essenziali citoplasmatici necessari per eseguire questi processi e consentire indagine. Grandi quantità di estratto di uova possono essere preparati in una sola volta per le manipolazioni biochimiche che richiedono grandi quantità di materiale (ad esempio, purificazione di proteine o high-throughput screening) 18-20. Un altro vantaggio è che la concentrazione di proteine specifiche in estratto uovo Xenopus può essere regolata con precisione mediante aggiunta di proteine e / o immunodeplezione di endog ricombinanteproteine enous in contrasto trasfezione di DNA plasmidico in cui l'espressione della proteina di interesse è difficile da controllare. Inoltre, la mancanza di proteine ricombinanti disponibili può essere superato con l'aggiunta di trascritti codificanti la proteina di interesse, sfruttando elevata capacità estratto uovo Xenopus preparata per tradurre mRNA esogenamente aggiunti.
La regolazione della degradazione delle proteine è fondamentale per il controllo di molte vie cellulari ed elabora 21. Estratto uovo di Xenopus è stato ampiamente utilizzato per studiare la degradazione delle proteine in quanto il sistema permette diversi modi per monitorare il turnover proteico, senza influenze confondenti di trascrizione e traduzione. La via di segnalazione Wnt è una via di segnalazione altamente conservato che svolge un ruolo critico nello sviluppo e nella malattia. Il fatturato di β-catenina, il principale effettore della via di Wnt, è altamente regolamentato, e un aumento steady-state level di β-catenina è critica per l'attivazione di Wnt geni bersaglio. L'importanza di degradazione β-catenina è evidenziata dal fatto che mutazioni nella via di Wnt che inibiscono la degradazione β-catenina trovare in ~ 90% di tutti i casi sporadici di tumore colorettale 22. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt può essere fedelmente riassunta in estratto uovo Xenopus per studiare il meccanismo del fatturato nonché per identificare nuovi modulatori piccole molecola della sua degradazione 2, 19, 20, 23-29.
Metodi per la preparazione di estratto uovo Xenopus per studiare il ciclo cellulare sono stati descritti in precedenti pubblicazioni JoVE 30-32. Il protocollo attuale descrive una modifica di questi metodi ed è ottimizzato per la degradazione di [35 S]-radiomarcato β-catenina e luciferasi-tag β-catenina inEstratto uovo di Xenopus. Il test di degradazione radioattivo permette la visualizzazione diretta dei livelli di proteine tramite autoradiografia. [35 S] metionina è incorporata nella proteina di interesse utilizzando una reazione di traduzione in vitro che possono poi essere aggiunto direttamente ad una reazione di degradazione. Inoltre, la proteina radiomarcato dosaggio fatturato non richiede un anticorpo contro la proteina di interesse o un epitopo, che può influenzare la stabilità della proteina. Poiché anche piccoli cambiamenti nei livelli di proteine, che si riflette in variazioni dell'intensità della banda di proteina radiomarcato, sono facilmente visualizzati mediante autoradiografia, la [35 S]-radiomarcato saggio degradazione rappresenta un metodo molto utile per la visualizzazione di proteine fatturato 2.
Fusione di β-catenina a luciferasi di lucciola (di seguito denominato semplicemente "luciferasi") consente di misure quantitative precise e facili dei livelli di proteine, al fine diper determinare le proprietà cinetiche di β-catenina fatturato 19, 20. Uno dei principali vantaggi del saggio luciferasi è che fornisce un sistema quantitativo forte che è facilmente calcificato. Il protocollo che segue fornisce metodi semplici per saggiare la degradazione β-catenina e un metodo affidabile, efficiente ed efficace per high-throughput screening nuovi modulatori β-catenina.
Estratto uovo di Xenopus è un sistema biochimico robusto per indagare fatturato β-catenina. La concentrazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus è ~ 25 Nm 2. In condizioni ottimali, l'estratto uovo è in grado di degradare β-catenina ad una velocità di 50-100 nM / hr e metà-massimale a 200 nM 24. Ci sono diversi passaggi critici per il successo ricostituzione del degrado β-catenina con estratto di uova di Xenopus. Questi includono 1) generare Xenopu…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Laurie Lee per la lettura critica del manoscritto. TWC è supportato da un American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB è sostenuto da una borsa di formazione del National Cancer Institute (T32 CA119925). SSH è supportato dal National Institutes of Health (R01DK078640). EL è supportato dal National Institutes of Health (R01GM081635 e R01GM103926).
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
ATP | Sigma | A2383-5G | |
Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
Name of Equipment | Company | ||
FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
16°C Incubator | Percival Scientific |