Summary
सिर और गर्दन ट्यूमर के ऊतक में उच्च जोखिम एचपीवी की उपस्थिति अनुकूल परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है. RNAscope बुलाया सीटू संकरण तकनीक में हाल ही में विकसित आरएनए FFPE ऊतक वर्गों में एचपीवी E6/E7 mRNA की प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है.
Abstract
Oncogenic एचपीवी का पता लगाने के लिए 'सोने के मानक' ट्यूमर के ऊतक में transcriptionally सक्रिय उच्च जोखिम एचपीवी का प्रदर्शन है. हालांकि, मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT-पीसीआर) द्वारा E6/E7 mRNA का पता लगाने के रूपात्मक संबंध के लिए ट्यूमर के ऊतक संदर्भ महत्वपूर्ण नष्ट कर देता है और नियमित नैदानिक व्यवहार में अपनाया जाना मुश्किल हो गया है, जो शाही सेना निकासी की आवश्यकता है. सीटू संकरण प्रौद्योगिकी, RNAscope में हमारे हाल ही में विकसित शाही सेना, एक अणु संवेदनशीलता और किसी भी शाही सेना biomarker के सीटू विश्लेषण में बेहद संवेदनशील और विशिष्ट सक्षम बनाता है जो एकल कक्ष संकल्प के साथ formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों में शाही सेना के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट नियमित नैदानिक नमूनों में. RNAscope एचपीवी परख जीनोटाइप विशेष जांच का एक पूल का उपयोग E6/E7 सात उच्च जोखिम एचपीवी जीनोटाइप की mRNA (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, और 58) का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था. यह उत्कृष्ट संवेदनशीलता का प्रदर्शन कियाऔर QRT-पीसीआर द्वारा E6/E7 mRNA का पता लगाने के वर्तमान 'सोने के मानक' विधि के खिलाफ विशिष्टता. RNAscope द्वारा निर्धारित एचपीवी स्थिति oropharyngeal कैंसर रोगियों में नैदानिक परिणाम की जोरदार शकुन है.
Introduction
दुनिया भर में 1 सभी तरह के कैंसर के लगभग 5% के लिए उच्च जोखिम मानव papillomavirus (HR-एचपीवी) संक्रमण खातों. एचपीवी जुड़े oropharyngeal कैंसर की घटनाओं को विशेष रूप से लोगों के बीच, पिछले दशकों के दौरान बढ़ गया है. एचपीवी पॉजिटिव oropharyngeal स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (OPSCC) संभावना है कि अगले 20 साल 2 में संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी सिर और गर्दन के कैंसर के बहुमत का गठन होगा. एचपीवी के कारण oropharyngeal स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा अनुकूल अस्तित्व के साथ जुड़े थे, और ट्यूमर एचपीवी स्थिति अस्तित्व 3 के लिए एक मजबूत और स्वतंत्र शकुन कारक है.
वायरल ओंकोजीन E6 और E7 के transcriptional सक्रियण के लिए साक्ष्य चिकित्सकीय प्रासंगिक एचपीवी 4 की उपस्थिति के लिए सोने के मानक के रूप में माना जाता है. हालांकि, आरटी पीसीआर तकनीक द्वारा ताजा ट्यूमर के ऊतक से E6/E7 mRNA का पता लगाने के लिए नियमित नैदानिक अभ्यास में व्यावहारिक नहीं है और अनुसंधान प्रयोगशालाओं तक सीमित कर दिया गया है. हाल ही में, हम हवलदारई formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक नमूनों (FFPE) 5-10 में एक शाही सेना अणु संवेदनशीलता के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं में मल्टीप्लेक्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो RNAscope नामक उपन्यास शाही सेना ISH प्रौद्योगिकी विकसित की है. हम एक अणु का पता लगाने के लिए 5 सबूत के तीन लाइनों प्रदान की. सबसे पहले, RNAscope जांच डिजाइन और संकेत प्रवर्धन प्रणाली हेला और एसके -बी.आर. -3 सेल लाइनों में भी कॉपी HER2 जीनोमिक डीएनए ठिकानों का पता लगाने की अनुमति दी. HER2 जीनोमिक डीएनए संकेतों के साथ तुलना में दूसरा, जब HELA कोशिकाओं में HER2 mRNA संकेत डॉट्स की फ्लोरोसेंट तीव्रता का वितरण डॉट प्रति एक अणु के अनुरूप था. तीसरा, सेल प्रति HER2 mRNA संकेत डॉट्स की संख्या आगे एक अणु का पता लगाने का समर्थन करते हुए निकट एक समाधान आधारित मात्रा का ठहराव परख से अनुमान लगाया HER2 mRNA प्रतिलिपि नंबर का मिलान नहीं हुआ. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में या उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में hematoxylin साथ DAPI साथ नाभिक counterstaining क, व्यक्तिगत नाभिक के दृश्य की अनुमति देताआईसीएच बारी में एक एकल कोशिका आधार 10 पर पता लगाने और आरएनए लक्ष्य की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. नियमित नैदानिक नमूनों में बगल में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने की क्षमता विशेष रूप से उन FFPE ऊतक अनुभाग आधारित assays 10,11, RNAscope नैदानिक विकृति विज्ञान के लिए एक आशाजनक मंच बना देता है. हम जीनोटाइप विशेष जांच का एक पूल का उपयोग कर सात उच्च जोखिम एचपीवी जीनोटाइप (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, और 58) का E6/E7 mRNA पता लगाने के लिए एक RNAscope आधारित एचपीवी परख विकसित किया है. OPSCC में हमारे हाल ही के अध्ययन RNAscope एचपीवी परख FFPE ऊतकों 12-17 पर एचपीवी स्थिति का निर्धारण करने में अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट है, और भी OPSCC 12,16 में रोग का निदान बताते हैं कि पता चला है.
RNAscope प्रौद्योगिकी के सिद्धांत के पहले 5 वर्णित किया गया है. यहाँ, हम पूरी RNAscope परख प्रोटोकॉल का वर्णन और FFPE ट्यूमर के ऊतक वर्गों में मानव संसाधन एचपीवी का पता लगाने में इसके उपयोग का प्रदर्शन.
Protocol
1. नमूना, उपकरण, और अभिकर्मक तैयार
- कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 16-32 घंटे के लिए नए सिरे से 10% तटस्थ बफर formalin में तय करने और आयल में एम्बेड, मोटाई में 3-4 मिमी के ब्लॉक में ऊतक नमूना काटें. FFPE ब्लॉक से 5 ± 1 माइक्रोन मोटाई के वर्गों में FFPE कट, स्लाइड और शुष्क हवा पर वर्गों माउंट. नोट: स्लाइड अप करने के लिए 3 महीने के लिए सुखाना के तहत कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है. घुड़सवार ऊतक स्लाइड पूर्व RNAscope परख करने के लिए 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पर एक सूखे में पकाया किया जाना चाहिए.
- 40 डिग्री सेल्सियस के संकरण ओवन लाओ आर्द्रता नियंत्रण ट्रे में एक humidifying पेपर रखें. यह पूरी तरह से गीला करने के लिए humidifying पेपर के लिए 50 मिलीलीटर DH 2 हे जोड़ें. उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए prewarm को ओवन में कवर ट्रे डालें.
- बनाओ 700 मिलीलीटर 1x pretreat DH 2 ओ में 10x Pretreatment समाधान गिराए द्वारा 2 सॉल्यूशन (10 NL, पीएच 6 साइट्रेट बफर) 1x pretreat 2 फोड़ा करने के लिए समाधान और माई गर्मीअधिक से उबलते रोकने जबकि 100-104 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान ntain.
- DH 2 ओ में prewarmed 50x धो बफर गिराए द्वारा 3 एल 1x धो बफर (0.1x एसएससी) बनाओ
- एक धूआं हुड के तहत deparaffinization के लिए 2 X 200 xylene के मिलीग्राम और 100% EtOH के 2 एक्स 200 मिलीलीटर की तैयारी.
- एक धूआं हुड के नीचे के बाद धुंधला के लिए 50% Hematoxylin धुंधला समाधान और उदास अभिकर्मक (0.01% अमोनिया पानी) तैयार करें.
- एक धूआं हुड के तहत निर्जलीकरण के लिए xylene की 200 मिलीलीटर, 200 मिलीलीटर 70%, और 2 एक्स 200 मिलीलीटर 100% EtOH तैयार करें.
- 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर और थपका वर्णकोत्पादक ब्राउन एक और ब्राउन बी को छोड़कर, आरटीयू Amp1, AMP2, AMP3, Amp4, एम्प 5-ब्राउन, और Amp6 ब्राउन सहित, कमरे के तापमान को आरटीयू जांच किट अभिकर्मक लाने Prewarm लक्ष्य जांच .
2. RNAscope परख
Deparaffinization और निर्जलीकरण
पाक के बाद, लगातार आंदोलन के साथ 2 एक्स 5 मिनट के लिए xylene में ऊतक वर्गों deparaffinize, और निर्जलीकरणलगातार आंदोलन के साथ 2 एक्स 3 मिनट के लिए 100% EtOH में. एयर 5 मिनट के लिए सूखी और एक hydrophobic बैरियर पेन के साथ ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक बाधा आकर्षित.
Pretreatments
- Pretreat 1 के साथ ऊतक वर्गों सेते अंतर्जात peroxidase गतिविधि का शमन के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए, DH 2 ओ में कुल्ला
- DH 2 ओ में दो बार कुल्ला, शाही सेना बहाली के लिए 15 मिनट के लिए एक उबलते तापमान पर रखा pretreat 2 के साथ ऊतक वर्गों सेते
- DH 2 ओ में दो बार कुल्ला, HybEZ ओवन में प्रोटीन के पाचन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए pretreat 3 के साथ ऊतक वर्गों सेते
लक्ष्य जांच संकरण
लक्ष्य जांच एचपीवी मानव संसाधन 7 पूल शामिल हैं: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, और 58. अलग तीन adjacently ऊतक वर्गों पर एचपीवी जांच, ubiquitin सी (यूबीसी) और जीवाणु जीन dapB जांच जोड़ें. 2 के लिए ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर संकरणमानव संसाधन, तो आरटी पर 2 एक्स 2 मिनट के लिए 1x धो बफर में कुल्ला.
संकेत प्रवर्धन
- 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, AMP3 (एम्पलीफायर) पर 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, AMP2 (पृष्ठभूमि reducer) पर 30 मिनट के लिए Amp1 (preamplifier) के साथ ऊतक वर्गों सेते हैं, और Amp4 (लेबल जांच) 15 मिनट के लिए HybEZ ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर. प्रत्येक संकरण कदम के बाद, आरटी पर 2 एक्स 2 मिनट के लिए 1x धो बफर में कुल्ला.
- आरटी पर 15 मिनट के लिए 30 मिनट और Amp6 के लिए Amp5 साथ ऊतक वर्गों सेते हैं. प्रत्येक ऊष्मायन कदम के बाद, आरटी पर 2 एक्स 2 मिनट के लिए 1x धो बफर में कुल्ला.
संकेत का पता लगाने
आरटी पर 10 मिनट के लिए ब्राउन एक और ब्राउन बी की बराबर मात्रा मिलाकर 01:01 थपका मिश्रण के साथ ऊतक वर्गों सेते हैं, DH 2 ओ में दो बार कुल्ला
Counterstaining
स्लाइड बढ़ते
2 मिनट प्रत्येक के लिए 70%, 100%, और 100% EtOH में ऊतक वर्गों निर्जलीकरण, xylene 5 मिनट के लिए, xylene आधारित बढ़ते मीडिया के साथ माउंट.
Representative Results
RNAscope एचपीवी परख कार्यप्रवाह
RNAscope परख (चित्रा 1) आईएचसी के समान है कि एक बेहद सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह है. Pretreatments, संकरण, संकेत amplifications, और पहचान: यह चार प्रमुख उपाय शामिल हैं. यह उच्च निष्ठा संकेत प्रवर्धन 5 सुनिश्चित करता है कि एक अद्वितीय जांच डिजाइन रणनीति कार्यरत हैं. RNAscope एचपीवी परख में, सात HR-एचपीवी जांच सेट सभी हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) से जुड़ा हुआ ही संकेत प्रवर्धन प्रणाली द्वारा मान्यता प्राप्त है, जमा कर रहे हैं. एचआरपी द्वारा गठित भूरे अवक्षेप आसानी मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं जो सब्सट्रेट के रूप में थपका का उपयोग वर्णजनीय प्रतिक्रिया उत्प्रेरित के रूप में विशिष्ट संकरण संकेतों का पता लगाया जाता है.
एचपीवी का पता लगाने के लिए प्रतिनिधि धुंधला
चित्रा 2 सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के दाग FFPE वर्गों से उदाहरण छवियों को दिखाता है. एचपीवी पॉजिटिव मामले (चित्र मेंure 2A), HR-एचपीवी जांच विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं में मजबूत कबरा संकेतों का पता चला. UBC जांच ट्यूमर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) दोनों में कई कबरा cytoplasmic संकेतों का पता चला. बैक्टीरियल जीन dapB जांच एक साफ पृष्ठभूमि (चित्रा -2) का प्रदर्शन किया. मजबूत संकेतों UBC जांच (चित्रा 2 ई) का उपयोग करते हुए पाया गया जबकि एचपीवी नकारात्मक स्थिति में, मानव संसाधन एचपीवी जांच और dapB जांच में दोनों, कोई संकेत (आंकड़े 2 डी और 2 एफ) का पता चला. इस परख में, UBC पृष्ठभूमि संकेतों के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ऊतक शाही सेना गुणवत्ता और dapB का आकलन करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण में कार्य करता है. एचपीवी स्थिति निर्धारण के लिए स्कोरिंग प्रत्येक मामले के लिए सभी तीन स्लाइड जांच शामिल है. नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड (dapB) स्लाइड पर धुंधला स्तर कटऑफ के रूप में प्रयोग किया जाता है: एचपीवी सकारात्मकता कबरा cytoplasmic और / या dabpB स्लाइड पर संकेत ऊपर था कि परमाणु धुंधला की मौजूदगी से परिभाषित किया गया है.
चित्रा 1. RNAscope परख कार्यप्रवाह के RNAscope परख की फ्लोचार्ट. चित्रण. RNAscope परख 4 बड़े कदम, pretreatments, लक्ष्य जांच संकरण, संकेत प्रवर्धन और संकेत का पता लगाने में शामिल है. पूरे परख प्रक्रिया 8 घंटा में पूरा किया जा सकता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. RNAscope से सना हुआ स्लाइड्स का उदाहरण छवियों. HR-एचपीवी, UBC (सकारात्मक नियंत्रण) और dapB के लिए जांच के साथ दाग FFPE वर्गों (नकारात्मक नियंत्रण)दो HNSCC मामलों से. एसी. एचपीवी पॉजिटिव मामले. ट्यूमर कोशिकाओं में ए, HR-एचपीवी E6/E7 mRNA अभिव्यक्ति. इनसेट, कबरा संकेतों को दिखाने के लिए 40x बढ़ाई. बी और सी). लोमो) एचपीवी नकारात्मक मामला. डी) क्रमशः, एचपीवी E6/E7 mRNA के लिए कोई धुंधला सकारात्मक UBC धुंधला (बी) और dapB (सी के लिए नकारात्मक) दिखा सटे ऊतक वर्गों , dapB नकारात्मक नियंत्रण (एफ) के समान है. ई) UBC सकारात्मक धुंधला हो जाना. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
RNAscope एचपीवी परख एचपीवी जुड़े सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में बगल में E6/E7 mRNA की प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति दी. RNAscope परख नियमित तय ट्यूमर के ऊतक के साथ पूरी तरह से संगत है और histopathological सहसंबंध के लिए ऊतक आकारिकी (चित्रा 2) को बरकरार रखता है. पारंपरिक CISH तरीकों पर RNAscope परख की एक प्रमुख लाभ यह विशेष रूप से पृष्ठभूमि शोर (आंकड़े -2 सी और 2 एफ) amplifying बिना संकरण संकेतों (आंकड़े 2 बी और 2 ई) amplifies है.
अभ्यास में, RNAscope एचपीवी परख प्रक्रिया 8 घंटा के भीतर पूरा किया जा सकता है या सुविधापूर्वक दो दिनों में विभाजित. RNAscope एचपीवी परख संदर्भ विधि के रूप में 16 QRT-पीसीआर का उपयोग कर 97% संवेदनशीलता और 93% विशिष्टता का प्रदर्शन, सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा 12-16 में एचपीवी स्थिति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. परम्परागत CHRमानव संसाधन एचपीवी डीएनए के लिए omogenic ISH अत्यधिक विशिष्ट है, लेकिन 80% 12 ~ की संवेदनशीलता है. सेलुलर किराए मार्कर p16 के लिए immunohistochemical (आईएचसी) धुंधला उत्कृष्ट संवेदनशीलता को दर्शाता है, लेकिन विशेष रूप से nonoropharyngeal सिर और गर्दन के कैंसर के 15 में झूठी सकारात्मक परिणाम 15,18, उत्पन्न हो सकता है. एचपीवी E6/E7 mRNA का पता लगाने के लिए QRT-पीसीआर की वर्तमान "सोने के मानक 'विधि केवल अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए इसके उपयोग की सीमा है, जो इष्टतम परिणामों के लिए ताजा जमे हुए ऊतकों की आवश्यकता है और तकनीकी रूप से जटिल है. इसके अलावा, यह यह असंभव ऊतकविकृतिविज्ञानी के साथ मानव संसाधन एचपीवी E6/E7 mRNA अभिव्यक्ति सहसंबंधी बनाता है जो शाही सेना निकासी की आवश्यकता है.
RNAscope परख की सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण कारक हैं. सबसे पहले, सबसे अच्छे परिणाम के लिए, ऊतकों ASCO / कैप दिशा निर्देशों 19 के अनुसार 16-32 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ताजा 10% तटस्थ बफर formalin में तय की जानी चाहिए. इसे सक्षम के बाद दूसरा, HybEZ ओवन अत्यधिक की सिफारिश की हैजांच संकरण और संकेत प्रवर्धन कदम के लिए तापमान और आर्द्रता का अधिकतम नियंत्रण है. तीसरा, यह हर कदम से पहले अतिरिक्त अवशिष्ट बफ़र्स हटाने, लेकिन अभी भी इन चरणों में से किसी के दौरान सूखने से ऊतक अनुभाग रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
यहाँ वर्णित पुस्तिका RNAscope प्रक्रिया पूरी तरह से एक वाणिज्यिक स्लाइड ऑटो धुंधला प्रणाली 10 पर स्वचालित किया गया है. यह बहुत परख की स्थिति और क्लीनिकल पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में बचत कीमती शारीरिक श्रम के मानकीकरण की सुविधा चाहिए. इसके अलावा, समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से आत्मीयता खत्म करने और स्कोरिंग में reproducibility में सुधार के लिए मदद करनी चाहिए जो एक digitalized स्लाइड, पर कोशिकाओं और धुंधला संकेतों की पहचान करने के लिए 10 विकसित किया गया है.
संक्षेप में, RNAscope एचपीवी परख FFPE ऊतकों में बगल में मानव संसाधन एचपीवी E6/E7 mRNA टेप की उपस्थिति का पता लगाता है. यह क्लीनिकल पैथोलॉजी प्रयोगशाला से परिचित है कि एक कार्यप्रवाह हैऊतक वर्गों में इनमें से सीधे दृश्य की अनुमति से Tories. यह (FFPE) ऊतकों के नमूनों की जांच के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है, और आसानी से नैदानिक विकृति विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया जा सकता है.
Disclosures
सभी लेखकों उन्नत सेल निदान, Inc में स्टॉक से और स्वयं कार्यरत हैं
Acknowledgments
YL लिए एनआईएच अनुदान (R43/44CA122444) और डीओडी BRCP अनुदान (W81XWH-06-1-0682) द्वारा समर्थित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
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