Summary
Наличие ВПЧ высокого риска в головы и шеи опухолевой ткани связано с благоприятными результатами. Недавно разработанная РНК в технике гибридизация называется RNAscope позволяет прямой визуализации ВПЧ Е6/Е7 мРНК в секциях FFPE ткани.
Abstract
«Золотым стандартом» для онкогенных обнаружения ВПЧ является демонстрация транскрипционно активного ВПЧ высокого риска в опухолевой ткани. Тем не менее, обнаружение Е6/Е7 мРНК с помощью количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (Qrt-ПЦР) требует выделения РНК, которая разрушает контекст ткани опухоли решающее значение для морфологической корреляции и был трудно быть приняты в повседневной клинической практике. Наш недавно разработала РНК гибридизация технологии, RNAscope в, позволяет прямой визуализации РНК в фиксированных формалином, парафин (FFPE) ткани с чувствительностью одной молекулы и разрешения одной клетки, что позволяет высокую чувствительность и специфичность на месте анализа любого РНК биомаркеров в обычных клинических образцов. Анализ RNAscope ВПЧ был предназначен для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска ВПЧ генотипов (ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58), используя пул генотипа конкретного зондов. Он продемонстрировал высокую чувствительностьи специфичность в отношении текущего метода 'золотой стандарт' обнаружения мРНК Е6/Е7 по Qrt-PCR. Статус ВПЧ определяется RNAscope сильно прогностическим из клинического исхода в ротоглотки больных раком.
Introduction
Высокого риска вирусом папилломы человека (ВПЧ-ВР) инфекции составляет примерно 5% всех случаев рака во всем мире 1. Заболеваемость ВПЧ-ассоциированных рака ротоглотки увеличилось в течение последних десятилетий, особенно среди мужчин. ВПЧ-положительных ротоглотки плоскоклеточный рак (OPSCC), скорее всего, составляют большинство всех головы и шеи рака в Соединенных Штатах в течение следующих 20 лет 2. Ротоглоточные плоскоклеточный рак, вызванных ВПЧ связаны с благоприятной выживания, и статус опухоли ВПЧ является сильным и независимым прогностическим фактором для выживания 3.
Доказательства активации транскрипции вирусных онкогенов Е6 и Е7 рассматривается как золотой стандарт для присутствии клинически значимых ВПЧ 4. Однако обнаружение мРНК Е6/Е7 из свежей опухолевой ткани с помощью RT-PCR техники не практично в обычной клинической практике и была ограничена научно-исследовательских лабораторий. В последнее время мы ВГАэ разработали новый РНК ISH технологию RNAscope, что позволяет мультиплекс обнаружения в отдельных клетках с чувствительностью одной молекулы РНК в фиксированных формалином и залитых в парафин образцов ткани (FFPE) 5-10. Мы предоставили три линии доказательств для обнаружения отдельных молекул 5. Во-первых, дизайн и сигнал Системы звукоусиления RNAscope зонд позволило выявить одну копию HER2 геномных мишеней ДНК в HeLa и SK-BR-3 клеточных линий. Во-вторых, по сравнению с HER2 геномных ДНК сигналов, распределение флуоресцентных интенсивностей сигналов HER2 мРНК точек в клетках HeLa согласуется с одной молекулой в точку. В-третьих, количество HER2 мРНК сигнала точек на клетки соответствуют тесно количество HER2 мРНК копирования стоимости раствором на основе количественного анализа, что также подтверждает обнаружение одной молекуле. Кроме того, контрастного ядер с DAPI в флуоресцентной микроскопии или с гематоксилином в ярко-микроскопии позволяет визуализировать отдельных ядер, белыйич в свою очередь позволяет обнаружение и количественное определение РНК-мишеней на одноклеточных основе 10. Умение анализировать экспрессию генов на месте в обычных клинических образцов делает RNAscope перспективной платформой для диагностики патологии, особенно те FFPE ткани раздел основе анализов 10,11. Мы разработали RNAscope основе ВПЧ анализа для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска генотипов ВПЧ (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58) с использованием пул генотипа конкретного зондов. Наши недавние исследования в OPSCC показали, что анализ RNAscope ВПЧ является высокой чувствительностью и специфичностью в определении статуса ВПЧ на FFPE тканей 12-17, а также информирует прогноз в OPSCC 12,16.
Принцип технологии RNAscope было описано ранее 5. Здесь мы описываем полный протокол RNAscope анализа и продемонстрировать его использование в обнаружении ВПЧ-ВР в FFPE секциях опухолевой ткани.
Protocol
1. Образец, оборудование, и о подготовке реагентов
- Cut образец ткани на блоки 3-4 мм в толщину, фиксируют в пресной 10% нейтральном забуференном формалине-за 16-32 ч при комнатной температуре (25 ° C) и вставить в парафин. Вырезать FFPE на секции толщиной 5 ± 1 мкм от FFPE блоков, смонтировать разделы, посвященные горками и высохнуть на воздухе. Примечание: Слайды можно хранить при комнатной температуре в атмосфере высыхания до 3 месяцев. Установленные горки ткани должны быть запеченный в сухом над при 60 ° С в течение 1 часа до анализа RNAscope.
- Принесите гибридизации духовку до 40 ° С. Поставьте Увлажнение бумаги в лотке контроля влажности. Добавить 50 мл дН 2 O в Увлажняющий бумаги мочить его полностью. Вставьте покрытый лоток в печь, чтобы prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием.
- Сделать 700 мл 1x предварительной обработки 2 Решение (10 NL, рН 6 цитрат буфер) путем разбавления 10x предварительной обработки раствора в дН 2 O. Нагрейте 1x предварительной обработки 2 решение до кипения и почтаntain температуру между 100-104 ° С, не допуская чрезмерного кипения.
- Сделать 3 L 1x промывочного раствора (0,1 x SSC) путем разбавления нагретого 50x промывочного буфера в дН 2 O.
- Подготовка 2 х 200 мл ксилола и 2 х 200 мл 100% этанола для депарафинизации в вытяжном шкафу.
- Подготовка 50%-ный раствор окраска гематоксилином и расточительность реагента (0,01% водный раствор аммиака) для последующей окраски под вытяжкой.
- Подготовка 200 мл ксилола, 200 мл 70% и 2 х 200 мл 100% этанола для обезвоживания в вытяжном шкафу.
- Prewarm целям зонды при 40 ° С в течение 10 мин и приносят обнаружения RTU набора реагентов до комнатной температуры, в том числе RTU Amp1, AMP2, AMP3, AMP4, Amp 5-Браун, и АМР6-Браун, кроме DAB хромоген Brown-А и Brown-B .
2. RNAscope Анализ
Депарафинирование и обезвоживание
После выпечки deparaffinize срезах тканей в ксилоле в течение 2 х 5 мин при частом помешивании, и обезвоживаютв 100% EtOH в течение 2 х 3 мин при частом помешивании. Воздух сухой в течение 5 мин и нарисуйте гидрофобный барьер вокруг срез ткани с гидрофобный барьер Pen.
Предварительной обработки
- Выдержите срезах тканей с предварительной обработки 1 в течение 10 мин при комнатной температуре для тушения эндогенного активности пероксидазы, промыть в дН 2 O.
- Инкубируйте срезов ткани с предварительной обработки 2 поддерживают при температуре кипения в течение 15 мин для извлечения РНК, промыть дважды в дН 2 O.
- Выдержите ткани секции с предварительной обработки 3 в течение 30 мин при 40 ° С в течение переваривания белков в HybEZ печи, промыть дважды в дН 2 O.
Целевая зонд Гибридизация
Целевые HPV-зонды HR 7 бассейн включают: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58. Добавить ВПЧ зондов, Убиквитин C (UBC) и бактериальных генов dapB зонды отдельно на три секции рядом тканей. Гибридизации при 40 ° С в духовке в течение 2ч, затем промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.
Усиление сигналов
- Инкубируйте срезов ткани с Amp1 (предусилителя) в течение 30 мин при 40 ° С, Amp2 (фон редуктор) в течение 15 мин при 40 ° С, AMP3 (усилитель) в течение 30 мин при 40 ° С и AMP4 (метка зонд) в течение 15 мин при 40 ° С в HybEZ печи. После каждой стадии гибридизации, промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте срезов ткани с AMP5 в течение 30 мин и АМР6 в течение 15 мин при комнатной температуре. После каждой стадии инкубации промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.
Обнаружения сигнала
Инкубируйте срезов ткани с 1:01 DAB смеси путем смешивания равный объем Brown-А и Brown-B в течение 10 мин при комнатной температуре, промыть дважды в дН 2 O.
Контрастного
Презентация монтажа
Дегидрировать срезах тканей в 70%, 100% и 100% этанола в течение 2 мин каждый, ксилол в течение 5 мин, крепление с ксилола на основе монтажных СМИ.
Representative Results
RNAscope ВПЧ анализ рабочего процесса
RNAscope анализ имеет весьма рационализировать рабочий процесс, который похож на IHC (рис. 1). Она состоит из четырех основных этапов: предварительная обработка, гибридизации, сигнальные Амплификации, и обнаружения. Он использует уникальный дизайн стратегию зонда, что обеспечивает высокую точность усиление сигнала 5. В анализе RNAscope HPV, семь HR-HPV зондов наборы объединяют, все признана той же системе амплификации сигнала, связанного с пероксидазой хрена (HRP). Конкретные сигнала гибридизации обнаружен как коричневый осадок, образованные HRP катализируемой реакции с использованием хромогенного DAB в качестве субстрата, который может быть легко визуализировать с помощью стандартного светлом поле микроскопа.
Представитель окрашивание для обнаружения ВПЧ
На рисунке 2 показан пример изображения из цветного FFPE разделах головы и шеи плоскоклеточный рак. В ВПЧ-положительных случае (рис.Юр 2А), в HR-HPV зонды обнаружены сильные сигналы точечные специально в опухолевых клетках. UBC зонд обнаружены многочисленные точечные цитоплазматические сигналов в обоих опухолевых клеток и стромальных клеток (фиг. 2b). Бактериальным геном dapB зонд продемонстрировали чистый фон (рис. 2в). В случае ВПЧ-отрицательных, как зонд ВПЧ-ВР и зонд dapB не обнаружили сигналы (Цифры 2D и 2F), в то время как сильные сигналы были обнаружены с помощью зонда UBC (Рисунок 2E). В этом анализе UBC служит в качестве положительного контроля для оценки качества тканей РНК и dapB в качестве отрицательного контроля для фоновых сигналов. Счет в матче на определении статуса ВПЧ включает изучение всех трех слайды для каждого конкретного случая. Уровень окрашивание на отрицательной контрольной слайда (dapB) слайд используется в качестве отсечки: HPV положительность определяется наличием точечной цитоплазматической и / или атомной окрашивания, которая была выше сигнала на слайде dabpB.
Рисунок 1. Блок-схема RNAscope анализа. Иллюстрация RNAscope анализа рабочего процесса. RNAscope анализ содержит 4 основных шагов, предварительной обработки, цель зонда гибридизации, усиление сигнала и обнаружение сигнала. Вся процедура анализа может быть завершена в 8 часов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Пример изображения RNAscope окрашенных слайды. FFPE срезах, окрашенных зондов для ВПЧ-ВР, UBC (положительный контроль) и dapB (отрицательный контроль)от двух случаях ПРГШ. переменного тока. ВПЧ-положительных случай. , ВПЧ-ВР Е6/Е7 экспрессии мРНК в клетках опухоли. Вставка, 40-кратном увеличении, чтобы показать точечные сигналы. В и С) смежные секции ткани не показывая положительный UBC окрашивание (В) и отрицательным для dapB (С), соответственно. DF) ВПЧ-негативных случай. D) не окрашивание на ВПЧ Е6/Е7 мРНК , похож на отрицательного контроля dapB (F). Е) UBC положительное окрашивание. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Discussion
Анализ RNAscope ВПЧ позволила прямой визуализации Е6/Е7 мРНК на месте в ВПЧ-ассоциированных головы и шеи плоскоклеточный рак. RNAscope анализ полностью совместим с фиксированной регулярно опухолевой ткани и сохраняет ткани морфологию для гистопатологическими корреляций (рис. 2). Ключевым преимуществом RNAscope анализа по сравнению с традиционными методами CISH том, что он специально усиливает сигналов гибридизации (рис. 2В и 2E) без усиления фонового шума (рис. 2C и 2F).
На практике процедура анализа RNAscope ВПЧ может быть завершена в течение 8 ч или удобно разделить в течение двух дней. Анализ RNAscope HPV был использован для определения состояния HPV в головы и шеи плоскоклеточного рака 12-16, демонстрируя 97% чувствительность и 93% специфичность с использованием Qrt-ПЦР в качестве опорного метода 16. Обычные CHRomogenic ISH для HR-ДНК ВПЧ обладает высокой специфичностью, но имеет чувствительность ~ 80% 12. Иммуногистохимический (IHC) окрашивание на клеточном суррогатным маркером p16 демонстрирует превосходную чувствительность, но может генерировать ложные положительные результаты 15,18, особенно в nonoropharyngeal головы и шеи рака 15. Текущий метод "золотым стандартом" Qrt-ПЦР для HPV Е6/Е7 обнаружения мРНК требуется свежезамороженной ткани для достижения оптимальных результатов и является технически сложной, что ограничивает его применение только научно-исследовательской лаборатории. Кроме того, он требует экстракции РНК что делает невозможным соотнести выражение HR-HPV мРНК Е6/Е7 с гистопатологией.
Есть несколько важных факторов для успеха анализа RNAscope. Во-первых, для получения лучших результатов, ткани должны быть зафиксированы в свежем 10% нейтральном забуференном формалине при комнатной температуре в течение 16-32 ч в соответствии с ASCO / CAP принципов 19. Во-вторых, печь HybEZ настоятельно рекомендуется, так как это позволиты оптимальное управление температурой и влажностью для гибридизации зонда и стадий амплификации сигнала. В-третьих, важно, чтобы удалить лишние остаточные буферы перед каждым шагом, но по-прежнему держать срезы ткани от высыхания во время любой из этих шагов.
Ручная процедура RNAscope описано здесь был полностью автоматизирован на слайд системы коммерческого авто-окрашивания 10. Это должно значительно облегчить стандартизацию условий анализа и экономя драгоценное ручного труда в клинических лабораториях патологии. Кроме того, программное обеспечение, предназначенное для анализа изображений была разработана 10 для автоматической идентификации клеток и окрашивания сигналы на цифровом слайд, который должен помочь устранить субъективность и улучшить воспроизводимость в выигрыше.
Таким образом, анализ RNAscope ВПЧ обнаруживает присутствие ВПЧ-ВР Е6/Е7 транскриптов мРНК на месте в FFPE тканей. Он имеет рабочий процесс, знакомый клинической патологии лабораторнойтории по позволяя непосредственно визуализацию их в срезах тканей. Он предлагает идеальную платформу для изучения (FFPE) образцов ткани, и может быть легко принят диагностических лабораториях патологии.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками и самостоятельно складе в Advanced Cell Диагностика, Inc
Acknowledgments
Частично поддержана NIH грант (R43/44CA122444) и DOD BRCP гранта (W81XWH-06-1-0682) до Ю.Л..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
