Summary
Tilstedeværelsen af højrisiko-HPV i hoved og hals tumor væv er forbundet med gunstige resultater. Den nyligt udviklede RNA in situ hybridisering teknik kaldet RNAscope giver mulighed for direkte visualisering af HPV E6/E7 mRNA i FFPE vævssnit.
Abstract
Den "gyldne standard" for onkogen HPV opdagelse er demonstration af transkriptionelt aktiv høj-risiko HPV i tumorvæv. Men detektion af E6/E7 mRNA ved kvantitativ revers transkription polymerase chain reaction (qRT-PCR) kræver RNA ekstraktion som ødelægger tumorvæv sammenhæng kritisk for morfologisk korrelation og har været vanskeligt at blive vedtaget i almindelig klinisk praksis. Vores nyligt udviklede RNA in situ hybridisering teknologi, RNAscope, tillader direkte visualisering af RNA i formalin-fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) væv med enkelt molekyle følsomhed og enkelt celle opløsning, hvilket giver meget følsom og specifik analyse in situ af enhver RNA biomarkør i rutinemæssige kliniske prøver. Den RNAscope HPV assay blev designet til at detektere E6/E7 mRNA syv højrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) under anvendelse af en pulje af genotype-specifikke prober. Det har vist fremragende følsomhedog specificitet mod den nuværende "gold standard" metode til påvisning af E6/E7 mRNA ved QRT-PCR. HPV-status bestemmes af RNAscope er stærkt prognostisk af det kliniske resultat i svælg kræftpatienter.
Introduction
Højrisiko-human papillomavirus (HR-HPV) infektion udgør ca 5% af alle kræfttilfælde i hele verden 1. Forekomsten af HPV-associeret svælg kræft er steget i løbet af de seneste årtier, især blandt mænd. HPV-positive oropharyngeal planocellulært karcinom (OPSCC), vil sandsynligvis udgøre et flertal af alle hoved og hals kræft i USA i de næste 20 år 2. Svælg planocellulært karcinom er forårsaget af HPV er forbundet med gunstige overlevelse, og tumor HPV-status er en stærk og uafhængig prognostisk faktor for overlevelse 3.
Beviser for transskriptionsaktivering af de virale onkogener E6 og E7 betragtes som den gyldne standard for tilstedeværelsen af klinisk relevant HPV 4. Men detektion af E6/E7 mRNA fra frisk tumorvæv ved RT-PCR teknik er ikke praktisk i almindelig klinisk praksis og er blevet begrænset til forskningslaboratorier. For nylig har vi HAVe udviklet en ny RNA ISH teknologi kaldet RNAscope, som gør det muligt multiplex opdagelse i individuelle celler med enkelt RNA-molekyle følsomhed i formalin, paraffinindstøbte vævsprøver (FFPE) 5-10. Vi gav tre linjer af beviser for enkelt molekyle detektion 5.. Først RNAscope sonde design og signal forstærkersystem tilladt påvisning af enkelt kopi HER2 genomiske DNA-mål i HeLa-og SK-BR-3-cellelinjer. Sekund, sammenlignet med HER2 genomiske DNA-signaler, fordelingen af de fluorescerende intensiteter af HER2 mRNA signal prikker i HeLa-celler var i overensstemmelse med et molekyle pr prik. For det tredje er antallet af HER2 mRNA signal dots per celle matches nøje HER2 mRNA kopiantallet estimeret ved en opløsning kvantificering assay yderligere støtte enkelt molekyle detektion. Desuden kontrastfarvning af kerner med DAPI i fluorescerende mikroskopi eller med hæmatoxylin i lyse-field mikroskopi tillader visualisering af enkelte kerner, WHich gengæld tillader påvisning og kvantificering af RNA-mål på en enkelt-celle basis 10. Evnen til at analysere genekspression in situ i rutinemæssige kliniske prøver gør RNAscope en lovende platform for diagnostisk patologi, især de FFPE vævssnit assays 10,11. Vi har udviklet en RNAscope baseret HPV-assay til påvisning af E6/E7 mRNA syv højrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) under anvendelse af en pulje af genotype-specifikke prober. Vores seneste undersøgelser i OPSCC har vist, at RNAscope HPV-analysen er meget følsom og specifik bestemme HPV-status på FFPE væv 12-17, og også informerer prognose i OPSCC 12,16.
Princippet i RNAscope teknologi er tidligere blevet beskrevet 5. Her beskriver vi den komplette RNAscope assayprotokollen og demonstrere dens anvendelse i detektion af HR-HPV i FFPE tumor vævssnit.
Protocol
1.. Prøve, Udstyr, og Klargøring af reagens
- Skær vævsprøve i blokke på 3-4 mm i tykkelse, fix i frisk 10% neutral bufferet formalin i 16-32 timer ved stuetemperatur (25 ° C), og integrere i paraffin. Skær FFPE i sektioner af 5 ± 1 mM tykkelse fra FFPE blokke montere afsnittene om dias og lufttørre. Bemærk: De slides kan opbevares ved stuetemperatur under udtørring i op til 3 måneder. De monterede vævsobjektglassene skal bages i en tørres ved 60 ° C i 1 time forud for RNAscope assay.
- Bring Hybridisering Ovn til 40 ° C. Placer en befugte papir i fugtighedskontrol bakke. 50 ml dH2O til befugtningsanlæg Paper helt våd det. Sæt den overdækkede bakke ind i ovnen til opvarmning af mindst 30 minutter før brug.
- Lav 700 ml 1x forbehandle 2 Solution (10 nl, pH 6 citrat buffer) ved at fortynde 10x Forbehandling Solution i dH 2 O. Varm 1x forbehandle 2 Løsning til at koge og maintain temperaturen mellem 100-104 ° C og samtidig forhindre over-kogning.
- Lav 3 L 1X vaskebuffer (0,1 x SSC) ved at fortynde forvarmet 50x vaskebuffer i dH 2 O.
- Forbered 2 x 200 ml xylen og 2 x 200 ml 100% EtOH i afparaffineringstrinnet under en emhætte.
- Forbered 50% Hematoxylin farveopløsning og blånelse reagens (0,01% ammoniak vand) til post-farvning under en emhætte.
- Forbered 200 ml xylen, 200 ml 70%, og 2 x 200 ml 100% EtOH for dehydrering under en emhætte.
- Forvarm Skud sonder ved 40 ° C i 10 minutter og bringer RTU Detection Kit reagens til stuetemperatur, herunder RTU AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown, og Amp6-Brown, undtagen DAB Chromogen Brown-A og Brown-B .
2. RNAscope Assay
Afparaffinering og dehydrering
Efter bagningen afparaffiniser vævssnit i xylen i 2 x 5 min med hyppig omrøring, og dehydrerei 100% EtOH i 2 x 3 min med hyppig omrøring. Lufttørre i 5 minutter og trække en hydrofob barriere rundt vævssnittet med en Hydrophobic Barrier Pen.
Forbehandlinger
- Inkuberes vævssnit med forbehandle 1 i 10 minutter ved stuetemperatur i quenching af endogen peroxidaseaktivitet, skylles i dH 2 O.
- Inkuber vævssnit med forbehandle 2 holdes på en kogepunktet i 15 min for RNA hentning, skylles to gange i dH 2 O.
- Inkuber vævssnit med forbehandle 3 i 30 minutter ved 40 ° C i proteinnedbrydning i HybEZ ovn, skylles to gange i dH 2 O.
Target Probe Hybridisering
Skud sonder HPV-HR 7 pool omfatter: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, og 58. Tilføj HPV prober, Ubiquitin C (UBC) og bakterielle gen dapB prober separat på tre hosliggende vævssnit. Hybridisere ved 40 ° C i en ovn i 2hr, og derefter skylles i 1X vaskebuffer for 2 x 2 min ved RT.
Signal Amplification
- Inkuber vævssnit med AMP1 (forstærker) i 30 minutter ved 40 ° C, AMP2 (baggrund reducering) i 15 minutter ved 40 ° C, AMP3 (forstærker) i 30 minutter ved 40 ° C, og AMP4 (mærkeproben) i 15 minutter ved 40 ° C i HybEZ ovnen. Efter hver hybridisering trin, skylles i 1X vaskebuffer for 2 x 2 min ved stuetemperatur.
- Inkuber vævssnit med Amp5 i 30 minutter og Amp6 i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter hver inkubation skylles i 1X vaskebuffer for 2 x 2 min ved stuetemperatur.
Signal Detection
Inkuber vævssnit med 01:01 DAB Blanding ved at blande lige volumen af Brown-A og Brown-B i 10 min ved stuetemperatur, skylles to gange i dH 2 O.
Kontrastfarvning
Slide Montering
Dehydrere vævssnit i 70%, 100% og 100% EtOH i 2 minutter hver, xylen i 5 minutter, monteres med xylen-baserede montage medier.
Representative Results
RNAscope HPV-analysen workflow
Den RNAscope analyse har en yderst strømlinet arbejdsgang, der ligner IHC (figur 1). Den består af fire store trin: forbehandlinger, hybridisering, signal amplifikationer og afsløring. Det anvender en unik sonde design strategi, der sikrer high fidelity signalforstaerkning 5.. I RNAscope HPV assay de syv HR-HPV-probesæt poolet, som er anerkendt af samme signalforstærkning, der er forbundet til peberrodsperoxidase (HRP). Specifikke hybridiseringssignaler detekteres som brune bundfald dannet af HRP-katalyseret kromogene reaktion under anvendelse af DAB som substrat, som let kan visualiseres ved standard lysfeltmikroskopi.
Repræsentant farvning for HPV-detektion
Figur 2 viser eksempel billeder fra farvede FFPE dele af hoved og hals pladecellekræft. I den HPV-positive tilfælde (fig.ure 2A), HR-HPV-prober detekteret stærke punktformig signaler specifikt i tumorcellerne. UBC proben talrige punktformig cytoplasmiske signaler i både tumorceller og stromaceller (Figur 2B). Den bakterielt gen dapB probe viste en ren baggrund (figur 2C). I HPV-negative tilfælde, både HR-HPV sonde og dapB sonde fundet nogen signaler (figur 2D og 2F), mens stærke signaler blev påvist ved hjælp af UBC sonde (Figur 2E). I dette assay UBC tjener som positiv kontrol for at vurdere væv RNA kvalitet og dapB som negativ kontrol for baggrunds-signaler. Den scoring for HPV status bestemmelse handler om at undersøge alle tre dias for hvert enkelt tilfælde. Farvningen niveau på diaset negativ kontrol (dapB) slide anvendes som cutoff: HPV-positivitet er defineret ved tilstedeværelsen af punktformet cytoplasmisk og / eller nukleare farvning, der var over signalet på dabpB dias.
Figur 1. Flowchart af RNAscope analysen. Illustration af RNAscope assay workflow. Den RNAscope Analysen indeholder 4 store skridt, forbehandlinger, target probehybridisering, signal forstærkning og afsløring signal. Hele analysen kan afsluttes i 8 timer. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Eksempel billeder af RNAscope-farvede objektglas. FFPE sektioner farvet med sonder til HR-HPV, UBC (positiv kontrol) og dapB (negativ kontrol)fra to HNSCC tilfælde. AC. HPV-positive tilfælde. A, HR-HPV E6/E7 mRNA-ekspression i tumorceller. Inset, 40X forstørrelse viser punktformig signaler. B og C) hosliggende vævssnit viser positiv UBC farvning (B) og negativ for dapB (C), hhv. DF) HPV-negative tilfælde. D) ingen farvning for HPV E6/E7 mRNA , svarende til dapB negativ kontrol (F). E) UBC positiv farvning. Klik her for at se større billede.
Discussion
Den RNAscope HPV-analysen er tilladt direkte visualisering af E6/E7 mRNA in situ i HPV-associeret hoved og hals pladecellekræft. Den RNAscope analysen er fuldt kompatibel med rutinemæssigt fast tumorvæv og bevarer vævsmorfologi for histopatologiske korrelationer (figur 2). En vigtig fordel ved RNAscope analysen i forhold til konventionelle CISH metoder er, at det er specielt forstærker hybridiseringssignalerne (figur 2B og 2E), uden at forstærke baggrundsstøjen (figur 2C og 2F).
I praksis kan det RNAscope HPV assayproceduren være afsluttet inden for 8 timer eller bekvemt fordelt over to dage. Den RNAscope HPV-analysen er blevet brugt til at bestemme HPV-status i hoved og hals planocellulært karcinom 12-16, viser 97% sensitivitet og 93% specificitet ved hjælp qRT-PCR som referencemetode 16. Konventionel chromogenic ISH for HR-HPV-DNA er meget specifik, men har en følsomhed på ~ 80% 12. Immunhistokemisk (IHC) farvning for den cellulære surrogat markør P16 demonstrerer fremragende følsomhed, men kan generere falske positive resultater 15,18, især i nonoropharyngeal hoved og hals kræft 15. Den nuværende "gold standard" metode til qRT-PCR for HPV E6/E7 mRNA detektion kræver frisk frosset væv for optimale resultater og er teknisk kompliceret, som begrænser brugen til forskningen eneste laboratorium. Desuden kræver det RNA-ekstraktion, som gør det umuligt at korrelere HR-HPV E6/E7 mRNA-ekspression med histopatologi.
Der er flere kritiske faktorer for succes RNAscope analysen. Først, for de bedste resultater, bør der fastsættes væv i frisk 10% neutral bufferet formalin ved stuetemperatur i 16-32 hr efter ASCO / CAP retningslinjer 19. For det andet er HybEZ ovnen stærkt anbefales, da det gør det muligts optimal styring af temperatur og luftfugtighed for probehybridisering og signal amplifikationstrinnene. For det tredje er det vigtigt at fjerne overskydende resterende buffere før hvert trin, men stadig holde vævssnittet fra tørring under nogle af disse trin.
Den manuelle RNAscope beskrevet her har været fuldt automatiseret på et kommercielt slide auto-farvning systemet 10. Dette skulle i høj grad lette standardisering af assay betingelser og spare kostbar manuel arbejdskraft i kliniske patologi laboratorier. Derudover har dedikeret billede analyse software er udviklet 10 til automatisk at identificere de celler og farvningsteknikker signaler på en digitaliseret dias, som skal bidrage til at fjerne subjektivitet og forbedre reproducerbarhed i scoring.
Sammenfattende RNAscope HPV-analysen detekterer tilstedeværelsen af HR-HPV E6/E7 mRNA udskrifter in situ i FFPE væv. Det har en arbejdsgang, der er velkendt for klinisk patologi laborarier ved at tillade direkte visualisering af disse i vævssnit. Det giver en ideel platform for behandlingen (FFPE) vævsprøver, og kan let vedtaget af diagnostiske patologi laboratorier.
Disclosures
Alle forfattere er ansat af og egen bestand i Advanced Cell Diagnostics, Inc.
Acknowledgments
Delvist understøttet af NIH tilskud (R43/44CA122444) og DOD BRCP tilskud (W81XWH-06-1-0682) til YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
