Summary
De aanwezigheid van hoog-risico HPV in het hoofd en de nek tumorweefsel wordt geassocieerd met gunstige resultaten. De recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie techniek genaamd RNAscope maakt een directe visualisatie van HPV E6/E7 mRNA in FFPE weefsel secties.
Abstract
De 'gouden standaard' voor oncogene HPV-detectie is de demonstratie van transcriptionally actief hoog-risico HPV in tumorweefsel. Echter, detectie van E6/E7 mRNA door middel van kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) vereist RNA-extractie die vernietigt het tumorweefsel context van cruciaal belang voor morfologische correlatie en is moeilijk in de dagelijkse klinische praktijk worden aangenomen. Het recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie technologie, RNAscope, maakt directe visualisatie van RNA in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel molecuul gevoeligheid en enkele cel resolutie, die zeer gevoelig en specifiek in situ analyse van elke RNA biomarker kunnen in routine klinische monsters. De RNAscope HPV-test werd ontworpen om de E6/E7 mRNA zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes detecteren. Het heeft een uitstekende gevoeligheid aangetoonden specificiteit tegen de huidige 'gouden standaard' methode voor het opsporen E6/E7 mRNA door qRT-PCR. HPV-status bepaald door RNAscope is sterk voorspellende van klinische resultaten bij orofaryngeale kankerpatiënten.
Introduction
Hoog-risico humaan papillomavirus (HR-HPV) is goed voor ongeveer 5% van alle kanker wereldwijd 1. De incidentie van HPV-geassocieerde orofarynxcarcinoom is toegenomen in de afgelopen decennia, vooral bij mannen. HPV-positieve orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom (OPSCC) zal waarschijnlijk een meerderheid van alle hoofd-en halskanker in de Verenigde Staten vormen in de komende 20 jaar 2. Orofaryngeale plaveiselcelcarcinomen veroorzaakt door HPV geassocieerd met gunstige overleving en status tumor HPV is een sterke en onafhankelijke prognostische factor voor overleving 3.
Bewijs voor transcriptionele activering van de virale oncogenen E6 en E7 wordt beschouwd als de gouden standaard voor de aanwezigheid van klinisch relevante HPV 4. Maar detectie van E6/E7 mRNA van verse tumorweefsel door RT-PCR techniek is niet praktisch in de dagelijkse klinische praktijk en is beperkt tot de onderzoekslaboratoria. Onlangs hebben we have ontwikkelde een nieuwe RNA ISH technologie genaamd RNAscope, die multiplex detectie mogelijk maakt in individuele cellen met een enkele RNA-molecuul gevoeligheid in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselmonsters (FFPE) 5-10. Wij verzorgden drie lijnen van bewijs voor single molecule detectie 5. Ten eerste, de RNAscope probe-ontwerp en signaalamplificatiesysteem toegestaan detectie van enkele kopie HER2 genome DNA doelen in HeLa-en SK-BR-3-cellijnen. Ten tweede, in vergelijking met HER2 genomisch DNA signalen, de verdeling van de fluorescentie-intensiteiten van HER2 mRNA signaal stippen in HeLa-cellen was consistent met een molecuul per punt. Ten derde, het aantal HER2 mRNA signaal dots per cel nauw bij elkaar aan de HER2 mRNA kopie aantal geschat door een oplossing op basis van kwantificering assay, single molecule detectie verdere ondersteuning. Bovendien tegenkleuring van kernen met DAPI in fluorescentie microscopie of met hematoxyline in bright-field microscopie maakt visualisatie van de individuele kernen, which beurt maakt detectie en kwantificering van RNA doelen op een eencellige basis 10. De mogelijkheid om genexpressie te analyseren in situ in de routine klinische monsters maakt RNAscope een veelbelovend platform voor diagnostische pathologie, vooral die FFPE weefsel-sectie gebaseerde testen 10,11. We hebben een RNAscope-gebaseerde test HPV E6/E7 mRNA te detecteren zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes ontwikkeld. Onze recente studies hebben aangetoond dat OPSCC de RNAscope HPV-test is zeer gevoelig en specifiek het toekennen van HPV op FFPE weefsels 12-17, en ook informeert prognose OPSCC 12,16.
Het principe van de RNAscope technologie is eerder beschreven 5. We beschrijven hier de volledige RNAscope assayprotocol en demonstreren het gebruik ervan in de detectie van HR-HPV in FFPE tumorweefsel secties.
Protocol
1. Sample, Apparatuur, en Bereiding van het reagens
- Snijd weefselmonster in blokken van 3-4 mm dikte, vast in vers 10% neutraal gebufferde formaline voor 16-32 uur bij kamertemperatuur (25 ° C) en verankeren in paraffine. Snijd FFPE in secties van 5 ± 1 micrometer dikte van FFPE blokken, monteren secties op dia's en de lucht drogen. Opmerking: De objectglaasjes kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur onder uitdroging tot 3 maanden. De gemonteerde weefselobjectglaasjes worden gebakken in een droog boven bij 60 ° C gedurende 1 uur vóór de test RNAscope.
- Breng Hybridisatie Oven tot 40 ° C. Plaats een Bevochtigen Papier in de vocht-en klimaatbeheersing lade. Voeg 50 ml dH 2 O om het Bevochtigen Papier om het helemaal nat. Plaats de bedekte lade in de oven te voorverwarmen gedurende ten minste 30 min. vóór gebruik.
- Maak 700 ml 1x voorbehandelen 2 Solution (10 nl, pH 6 citraat buffer) door verdunning van 10x voorbehandelingsoplossing in dH 2 O. Verhit de 1x voorbehandelen 2 Solution aan de kook en maintain de temperatuur tussen 100-104 ° C terwijl het voorkomen van over-koken.
- Maak 3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC) door verdunning voorverwarmde 50x Wash Buffer in dH 2 O.
- Bereid 2 x 200 ml xyleen en 2 x 200 ml 100% EtOH voor deparaffinisatie onder een afzuigkap.
- Bereid 50% Hematoxylin kleuroplossing en blauwen reagens (0.01% ammoniak water) voor post-kleuring onder een afzuigkap.
- Bereid 200 ml xyleen, 200 ml 70% en 2 x 200 ml 100% EtOH om gedroogd onder een afzuigkap.
- Voorverwarmen Target probes bij 40 ° C gedurende 10 min en breng RTU Detection Kit reagens op kamertemperatuur, waaronder RTU Amp1, Amp2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown en AMP6-Brown, behalve DAB chromogeen Brown-A en-B Brown .
2. RNAscope Assay
Deparaffineren en uitdroging
Na het bakken, deparaffinize weefsel secties in xyleen voor 2 x 5 minuten met frequente agitatie, en uitdrogen100% EtOH gedurende 2 x 3 min frequent roeren. Lucht drogen gedurende 5 minuten en trek een hydrofobe barrière rond het weefsel sectie met een hydrofobe Barrier Pen.
Voorbehandelingen
- Incubeer weefselcoupes met voorbehandeling 1 gedurende 10 min bij kamertemperatuur harden van endogene peroxidase activiteit spoelen in dH 2 O.
- Incubeer weefsel secties met voorbehandelen 2 gehandhaafd op een kooktemperatuur 15 min voor RNA ophalen, twee keer spoelen in dH 2 O.
- Incubeer weefsel secties met voorbehandelen 3 gedurende 30 minuten bij 40 ° C voor de vertering van eiwitten in HybEZ oven, twee keer spoelen in dH 2 O.
Target Probe Hybridisatie
Target probes HPV-HR 7 collectief omvatten: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58. Voeg HPV sondes, Ubiquitin C (UBC) en bacterieel gen dapB probes apart op drie naast elkaar coupes. Hybridiseren bij 40 ° C in de oven gedurende 2hr, spoel dan in 1x Wash buffer voor 2 x 2 min bij RT.
Signaalversterking
- Incubeer weefselcoupes met Amp1 (voorversterker) gedurende 30 min bij 40 ° C, Amp2 (achtergrond verloopstuk) gedurende 15 min bij 40 ° C, AMP3 (versterker) gedurende 30 min bij 40 ° C en AMP4 (labelprobe) gedurende 15 min bij 40 ° C in HybEZ oven. Na elke hybridisatiestap, spoelen met 1 x wasbuffer gedurende 2 x 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer weefselcoupes met AMP5 gedurende 30 min en AMP6 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na elke incubatiestap spoelen met 1 x wasbuffer gedurende 2 x 2 minuten bij kamertemperatuur.
Signal Detection
Incubeer weefselcoupes met 1:1 DAB Mengsel door gelijke volume Brown-A en bruin-B gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur twee keer spoelen in dH 2 O.
Tegenkleuring
Dia bevestiging
Dehydrateer weefselcoupes in 70%, 100% en 100% EtOH gedurende 2 minuten elk, xyleen gedurende 5 minuten, zet met xyleen gebaseerde afdekmiddel.
Representative Results
RNAscope HPV test workflow
De RNAscope test heeft een sterk gestroomlijnde werkstroom die vergelijkbaar IHC (figuur 1). Het bestaat uit vier belangrijke stappen: voorbehandelingen, hybridisatie signaal versterkingen, en detectie. Het maakt gebruik van een unieke probe-ontwerp strategie die high fidelity signaalversterking 5 zorgt. In de RNAscope HPV test worden de zeven HR-HPV probe sets samengevoegd, alle erkende door dezelfde signaalamplificatiesysteem gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP). Specifieke hybridisatie signalen worden gedetecteerd als bruine precipitaten gevormd door HRP gekatalyseerde chromogene reactie met DAB als substraat, dat gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door standaard helderveld microscopie.
Vertegenwoordiger kleuring voor HPV-detectie
Figuur 2 toont bijvoorbeeld beelden van gebrandschilderd FFPE delen van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Bij de HPV-positieve geval (Figure 2A), de HR-HPV-probes gedetecteerd sterke puntvormige signalen specifiek de tumorcellen. De UBC probe gedetecteerd talrijke punctata cytoplasmatische signalen in zowel tumorcellen en stromale cellen (Figuur 2B). Het bacterieel gen dapB probe toonde een schone achtergrond (figuur 2C). Bij de HPV-negatieve geval zowel de HR-HPV-sonde en de dapB sonde gedetecteerd geen signalen (figuren 2D en 2F), terwijl sterke signalen werden gedetecteerd met de UBC sonde (figuur 2E). In deze assay, UBC dient als positieve controle weefsel RNA kwaliteit en dapB beoordeelt negatieve controle voor achtergrond signalen. De score voor de HPV-status bepaling impliceert onderzoek van alle drie dia's voor elk geval. De kleuring niveau op negatieve regelschuif (dapB) dia als cutoff: HPV positiviteit wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van cytoplasmatische punctata en / of nucleaire kleuring die boven het signaal op de dabpB dia.
Figuur 1. Stroomschema van RNAscope assay. Illustratie van RNAscope assay workflow. De RNAscope test bestaat uit 4 grote stappen, voorbehandelingen, doel probe hybridisatie, signaalversterking en signaal detectie. De gehele test procedure kan in 8 uur worden afgerond. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Voorbeeld afbeeldingen van RNAscope-gekleurde coupes. FFPE secties gekleurd met probes voor HR-HPV, UBC (positieve controle) en dapB (negatieve controle)van twee SCCHH gevallen. AC. HPV-positieve zaak. A, HR-HPV E6/E7 mRNA expressie in tumorcellen. Bijvoegsel, 40X vergroting punctata signalen tonen. B en C) aangrenzend weefsel secties met positieve kleuring UBC (B) en negatief voor dapB (C) resp. DF) HPV-negatieve case. D) geen kleuring voor HPV E6/E7 mRNA , vergelijkbaar met de dapB negatieve controle (F). E) UBC positieve kleuring. Klik hier voor grotere afbeelding.
Discussion
De RNAscope HPV test toegestaan directe visualisatie van E6/E7 mRNA in situ in HPV-geassocieerde hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. De RNAscope test is volledig compatibel met routinematig vaste tumorweefsel en behoudt weefselmorfologie voor histopathologisch correlaties (figuur 2). Een belangrijk voordeel van de RNAscope test ten opzichte van conventionele CISH methoden is dat het specifiek versterkt de hybridisatiesignalen (figuren 2B en 2E) zonder het versterken van de achtergrond ruis (figuren 2C en 2F).
In de praktijk kan de RNAscope HPV test procedure worden afgerond binnen 8 uur of handig verdeeld over twee dagen. De RNAscope HPV-test is gebruikt om HPV-status in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom 12-16 bepalen, waaruit 97% sensitiviteit en specificiteit van 93% met qRT-PCR als referentiemethode 16. Conventionele chromogenic ISH voor HR-HPV-DNA is zeer specifiek, maar heeft een sensitiviteit van ~ 80% 12. Immunohistochemische (IHC) kleuring voor de cellulaire surrogaatmarker p16 werd een uitstekende gevoeligheid, maar kan vals-positieve resultaten 15,18, vooral in nonoropharyngeal hoofd-halskanker 15 genereren. De huidige "gouden standaard" methode qRT-PCR voor HPV E6/E7 mRNA detectie vereist bevroren weefsel voor optimale resultaten en technisch complex, die het gebruik ervan beperkt tot alleen het onderzoekslaboratorium. Bovendien vereist RNA-extractie waardoor het onmogelijk HR-HPV E6/E7 mRNA correleert met histopathologie.
Er zijn verschillende kritische factoren voor het succes van de RNAscope assay. Eerste, voor de beste resultaten, weefsels moeten worden in vers 10% neutraal gebufferde formaline gefixeerde bij kamertemperatuur gedurende 16-32 uur volgens ASCO / CAP richtlijnen 19. Ten tweede wordt de HybEZ oven sterk aanbevolen omdat inschakelens optimale controle van temperatuur en vochtigheid voor probe hybridisatie en signaalversterking stappen. Ten derde is het belangrijk om overtollig resterende buffers verwijderen voor elke stap, maar nog steeds de weefselsectie van droging bij een van deze stappen.
De hier beschreven handmatige RNAscope procedure is volledig geautomatiseerd op commerciële dia auto-kleuring 10. Dit zou aanzienlijk vergemakkelijken standaardisatie van testomstandigheden en bespaart kostbare handenarbeid in klinische pathologie laboratoria. Daarnaast heeft speciale software voor beeldanalyse ontwikkeld 10 om de cellen en vlekken signalen op een gedigitaliseerde dia, die moeten helpen subjectiviteit te leggen en de reproduceerbaarheid noteren automatisch identificeren.
Samengevat, de RNAscope HPV-test detecteert de aanwezigheid van HR-HPV E6/E7 mRNA transcripten in situ in FFPE weefsels. Het heeft een workflow die vertrouwd is bij klinische pathologie laboratoriaTories doordat zij de direct visualisatie van deze in weefsel secties. Het biedt een ideaal platform voor de behandeling van (FFPE) weefselmonsters, en kan gemakkelijk door diagnostische pathologie laboratoria worden aangenomen.
Disclosures
Alle auteurs zijn in dienst van en eigen voorraad in Advanced Cell Diagnostics, Inc
Acknowledgments
Mede ondersteund door NIH-subsidie (R43/44CA122444) en DOD BRCP subsidie (W81XWH-06-1-0682) naar YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
