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Chemistry

गर्भावस्था के दौरान चूहा जिगर ऊतक में फैटी एसिड की compositional परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग करें

Published: March 13, 2014 doi: 10.3791/51445
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Human Development & Health Academic Unit, Faculty of Medicine, University of Southampton

Summary

गर्भावस्था मातृ ऊतकों के फैटी एसिड की संरचना में महत्वपूर्ण परिवर्तन की ओर जाता है. लिपिड प्रोफाइल चूहों के बीच पहचान और व्यक्तिगत लिपिड कक्षाओं में फैटी एसिड की मात्रा का ठहराव गर्भावस्था के दौरान विभिन्न उच्च और कम वसा वाले आहार खिलाया अनुमति देने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है.

Abstract

गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) उच्च सटीकता और उच्च reproducibility के साथ परिणाम उपज, ऊतकों, कोशिकाओं, और प्लाज्मा / सीरम से लिपिड के फैटी एसिड सामग्री की पहचान और यों इस्तेमाल एक बेहद संवेदनशील तरीका है. चयापचय और पोषण के अध्ययन में जीसी अनुमति देता हस्तक्षेप निम्नलिखित फैटी एसिड सांद्रता में या ऐसे गर्भावस्था के रूप में शारीरिक राज्य में परिवर्तन के दौरान परिवर्तन का आकलन. Aminopropyl सिलिका कारतूस का उपयोग ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) की अनुमति देता है triacylglycerols, अलग phospholipids, और cholesteryl एस्टर (सीई) सहित प्रमुख लिपिड कक्षाओं की जुदाई. विशेष के साथ संयुक्त जीसी विभिन्न उच्च और कम वसा वाले आहार खिलाया गया था कि वर्जिन और गर्भवती चूहों के यकृत में CE अंश के फैटी एसिड की संरचना में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. जिगर CE के ओमेगा -3 और ओमेगा -6 फैटी एसिड सामग्री पर महत्वपूर्ण आहार / गर्भावस्था बातचीत प्रभाव गर्भवती महिलाओं के आहार manipulat के लिए एक अलग प्रतिक्रिया है कि यह दर्शाता है, कर रहे हैंसे आयन कुंवारी महिलाओं में देखा जाता है.

Introduction

गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) पूरकता या शारीरिक मोटापा जैसे शर्तों (और मधुमेह जैसे रोगों से संबंधित) या गर्भावस्था 3 के दौरान लिपिड पूल और कोशिका झिल्ली 1,2 में फैटी एसिड के समावेश की पहचान करने और यों इस्तेमाल एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है - 5. यह भी खाद्य पदार्थ में प्रकार और वसा की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. प्रयोगात्मक आहार निस्र्पक, साथ ही खाद्य उद्योग नियमों का अनुपालन सुनिश्चित करना है कि जब यह उपयोगी है. उदाहरण के लिए, जीसी कि लेबलिंग सही है और नियमों 6,7 से पालन सुनिश्चित करने के लिए इस तरह के एक आहार अनुपूरक के रूप में एक उत्पाद के भीतर पहचान और फैटी एसिड की मात्रा की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फैटी एसिड के विश्लेषण के लिए स्वास्थ्य और रोग, आहार परिवर्तन के प्रभाव, और शारीरिक स्थिति 8 में परिवर्तन के प्रभाव में लिपिड चयापचय में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. गर्भावस्था के दौरान नमूनों का अध्ययन करने के लिए जी सी के इस्तेमाल की महत्वपूर्ण प्रदान की गई हैफैटी एसिड और जटिल लिपिड homeostasis 3 में परिवर्तन के बारे में जानकारी.

Chromatographic जुदाई की अग्रिम में, लिपिड आम तौर पर क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के मिश्रण विलायक में लिपिड की घुलनशीलता का उपयोग नमूना से निकाले जाते हैं. सोडियम क्लोराइड चरणों 9,10 युक्त जलीय और जैविक लिपिड में मिश्रण की जुदाई की सुविधा के लिए जोड़ा गया है. ब्याज के परिसर लिपिड कक्षाओं ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) द्वारा कुल लिपिड निकालने से अलग किया जा सकता है. इस जुदाई तकनीक उनके polarity या बंधन आत्मीयता के आधार पर लिपिड कक्षाओं elutes. Triacyglycerols (टैग) और cholesteryl एस्टर (सीई) एक संयुक्त अंश, आगे की कक्षाओं, phosphatidylcholine (पीसी) के रूप में पहला eluted हैं, Phosphatidylethanolamine (पीई), और गैर एस्टरीकृत फैटी एसिड (नेफा) Eluting विलायक के polarity में वृद्धि से eluted हैं . सीई से टैग की जुदाई केवल एक ताजा एसपीई cartri के टैग के बंधन कारनामेडीजीई, CE eluted करने की अनुमति. टैग तो eluting विलायक 9,10 के polarity में वृद्धि से eluted किया जा सकता है. इस विधि की तुलना में अधिक उपज के साथ एक साथ अलग होने की कई नमूने अपेक्षाकृत छोटे आकार के नमूने (जैसे <100 μl प्लाज्मा या सीरम, <100 मिलीग्राम ऊतक) 11,12 विश्लेषण किया जा सकता है जिसका मतलब है कि, पतली परत क्रोमैटोग्राफी साथ हासिल की है की अनुमति देता है.

जीसी पहले 1950 के दशक में वर्णित एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है, यह तो तरल तरल सिस्टम में मोबाइल चरण वाष्प के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है कि सुझाव दिया गया था. यह शुरू में पेट्रोलियम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन तेजी से इस तरह अमीनो एसिड विश्लेषण और प्रमुख ब्याज की अभी भी है जो लिपिड जैव रसायन, जैसे अन्य क्षेत्रों में विस्तार किया गया था. इस तरह के पहले प्रयोग पैक स्तंभों से केशिका कॉलम के विकास के रूप में जीसी उपकरण और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में अग्रिम फैटी एसिड हो पा रहे हैं, जिसमें हमारी मौजूदा तकनीकों के लिए प्रेरित कियाजीसी नियमित जांच 13 साल की एक विस्तृत श्रृंखला में फैटी एसिड की पहचान करने और यों इस्तेमाल किया जा रहा है जिसके परिणामस्वरूप में कम तापमान पर अधिक कुशलता से अलग कर दिया.

जीसी वे थर्मल अपघटन बिना उचित तापमान पर eluted होने के लिए पर्याप्त रूप से अस्थिर हो सकता है कि आदेश में derivatized होने के लिए फैटी एसिड की आवश्यकता है. यह आमतौर पर विश्लेषण के लिए एस्टर, thioesters या amides के लिए फार्म हाइड्रोजन युक्त एक कार्यात्मक समूह के प्रतिस्थापन शामिल है. मिथाइल एस्टर सामान्यतः मेथिलिकरण द्वारा उत्पादित कर रहे हैं जो डेरिवेटिव, अध्ययन कर रहे हैं. इस पद्धति में जटिल लिपिड में एस्टर बांड फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि) के लिए फार्म transmethylated रहे हैं जो मुक्त फैटी एसिड होता है, रिलीज करने के लिए hydrolyzed कर रहे हैं. जीसी द्वारा निर्धारित प्रसिद्धि के परिणामस्वरूप प्रोफाइल,, फैटी एसिड संरचना के रूप में जाना जाता है और आसानी से अलग प्रयोगात्मक समूहों 9,10 के बीच तुलना की जा सकती है. तकनीक की अनुमति देता है individ के अनुपात दोनोंUAL फैटी एसिड और उनके सांद्रता मापा जाएगा.

पोषण के अध्ययन में और खाद्य उद्योग के भीतर फैटी एसिड का विश्लेषण करने के लिए जी सी के उपयोग के अलावा, तकनीक विश्लेषणात्मक क्षेत्र की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जीसी का उपयोग पर्यावरण विश्लेषण कीटनाशकों और मिट्टी से पानी के प्रदूषण को मापने शामिल chlorobenzene सामग्री को मापने का विश्लेषण करती है. विष विज्ञान में, जीसी भी मूत्र और व्यक्तियों के रक्त के नमूनों में अवैध पदार्थों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जैसे एक खेल प्रदर्शन enhancers 12 और हाइड्रोकार्बन के जटिल मिश्रण को अलग करने की क्षमता पेट्रोकेमिकल विश्लेषण 12 के लिए पेट्रोलियम उद्योग में इस तकनीक को लोकप्रिय बनाता है.

गर्भावस्था विशेष रूप से ओमेगा -3 की सामग्री में मातृ ऊतकों के फैटी एसिड की संरचना में महत्वपूर्ण परिवर्तन, (एन 3) और ओमेगा -6 (एन 6) पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी ACI के साथ जुड़ा हुआ हैडी एस (PUFA) 3. वर्तमान अध्ययन में, हम विभिन्न तेल स्रोतों के साथ कम और उच्च वसा वाले आहार खिलाया कुंवारी और गर्भवती चूहों से लिया जिगर ऊतक के फैटी एसिड की संरचना के विश्लेषण में इसके उपयोग का वर्णन करके फैटी एसिड की माप में जीसी के उपयोग का उदाहरण देना. यहाँ प्रदान की प्रयोगात्मक आहार एक कम वसा वाले सोयाबीन तेल आधारित आहार, एक उच्च वसा वाले सोयाबीन तेल आधारित आहार (130.9 ग्राम कुल वसा / किग्रा कुल वसा) या एक उच्च वसा अलसी तेल आधारित आहार (130.9 ग्राम कुल वसा / किलो थे 20 दिनों के लिए प्रदान की जाती आहार),. इन आहार का पूरा पोषक तत्व और फैटी एसिड संरचना पहले 14 में वर्णित किया गया है. सोयाबीन तेल आहार लिनोलेनिक एसिड (18:02 N-6) में अमीर हैं और अलसी का तेल आहार α-लिनोलेनिक एसिड में समृद्ध है, जबकि कुछ α-लिनोलेनिक एसिड (18:3 n-3) होते हैं. इन उच्च वसा वाले आहार linoleic α-लिनोलेनिक को एसिड (क्रमशः 8:01 और 1:01 के राशन) का अलग राशन का प्रतिनिधित्व करते हैं. व्यक्तिगत लिपिड वर्गों और जीसी द्वारा विश्लेषण के अलगाव के लिए विधि हम हैडालूँगा स्थापित और मान्य है, और पहले 10 लेकिन इस के साथ साथ पाया विस्तृत तकनीकी विवरण के बिना प्रकाशित किया गया है.

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Protocol

1. पशु प्रक्रियाओं

  1. सभी जानवर का काम गृह मंत्रालय पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम (1986) के अनुसार किया जाना चाहिए.
  2. एकल प्रजनन द्वारा पुराने 10 सप्ताह की आयु के Wistar चूहों दोस्त है, और एक योनि प्लग की उपस्थिति द्वारा गर्भावस्था की पुष्टि करें. गर्भ के दिन 1 के रूप में इस रिकॉर्ड, और प्रयोगात्मक आहार शुरू. कुंवारी महिलाओं के लिए, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक चूहा हाउस, और प्रयोगात्मक आहार शुरू.
  3. 20 दिनों के लिए प्रयोगात्मक आहार खिलाने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 asphyxiation द्वारा चूहों euthanize.
  4. उदर गुहा बेनकाब और डायाफ्राम के लिए जिगर कनेक्ट जो स्नायुबंधन, पेट के पूर्वकाल दीवार, पेट और ग्रहणी काटने से जिगर उत्पाद शुल्क के लिए विच्छेदन संदंश और कैंची का प्रयोग करें. सेल्सियस -80 पर भंडारण से पहले पीबीएस में जिगर धोएं और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज

2. एक कुल लिपिड की तैयारी निकालें 9

  1. Molecul जोड़ेंएआर sieves 'सूखा' विलायकों बनाने के लिए सभी को सॉल्वैंट्स (विलायक कंटेनर का 1/10 को भरने के लिए). एक धूआं हुड के भीतर सभी विलायक कार्य करते हैं.
  2. लगभग 100 मिलीग्राम जमे हुए जिगर कट और वजन. एक बर्फ बाल्टी में एक ट्यूब में ऊतक प्लेस और 0.8 मिलीलीटर बर्फ ठंड 0.9% NaCl जोड़ें. ऊतक homogenize.
  3. शुष्क क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीग्राम / मिलीग्राम में भंग आंतरिक मानकों जोड़ें: मेथनॉल (2:1, वी / वी) butylated hydroxytoluene (BHT, 50 मिलीग्राम / एल) युक्त एंटी ऑक्सीडेंट के रूप में. चूहा जिगर की 100 मिलीग्राम CE मानक के 100 ग्राम जोड़ने के लिए (cholesteryl 17:00 heptadecanoate) सावधानी:. क्लोरोफॉर्म और BHT खतरनाक हैं.
  4. 5.0 मिलीलीटर शुष्क क्लोरोफॉर्म करें: मेथनॉल (2:1, वी / वी) BHT (50 मिलीग्राम / एल) युक्त.
  5. , 1.0 एमएल 1 एम NaCl जोड़ें मिश्रण वर्दी लग रहा है जब तक vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स. नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  6. 10 मिनट, कमरे के तापमान पर कम ब्रेक के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  7. कम लीजिएकांच पाश्चर पिपेट का उपयोग चरण, 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब और शुष्क करने के लिए स्थानांतरण नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

3. ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा लिपिड वर्गों का पृथक्करण (एसपीई) 10

  1. एक वैक्यूम पंप करने के लिए विशेष टैंक कनेक्ट और टैंक पर aminopropyl सिलिका एसपीई कारतूस जगह है.
  2. पहला अंश एकत्र करने के लिए स्तंभ के तहत टैंक रैक में नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल टैग और CE रखें.
  3. 1.0 मिलीलीटर शुष्क क्लोरोफॉर्म और भंवर में कुल लिपिड निकालने भंग.
  4. एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए कॉलम नमूना लागू करें और गुरुत्वाकर्षण के तहत पेंच टोपी ट्यूब में के माध्यम से ड्रिप करने की अनुमति. आगे नहीं भरी गिरावट, निर्वात द्वारा शेष तरल हटा दें.
  5. शुष्क क्लोरोफॉर्म की 2 एक्स 1.0 मिलीलीटर washes के साथ स्तंभ धो, वैक्यूम के अंतर्गत टैग और CE अंश Elute.
  6. सभी तरल निकाल दिया जाता है, टैग और CE fractio सूखी40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत n नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  7. स्तंभ के तहत टैंक ट्रे में नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल पीसी रखें.
  8. 2 एक्स 1.0 मिलीलीटर शुष्क क्लोरोफॉर्म के अलावा के साथ वैक्यूम के अंतर्गत पीसी अंश Elute: मेथनॉल (60:40, वी / वी) सभी तरल स्तंभ से हटा दिया जाता है जब तक.
  9. 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत निकालें और सूखी पीसी अंश नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  10. टैंक ट्रे में एक नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल पीई प्लेस और वैक्यूम के तहत 1.0 मिलीलीटर शुष्क मेथनॉल के अलावा के साथ पीई अंश elute.
  11. 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत निकालें और सूखी पीई अंश नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  12. टैंक ट्रे में नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल नेफा रखें और सूखी क्लोरोफॉर्म की 2 एक्स 1.0 मिलीलीटर washes के अलावा द्वारा वैक्यूम के अंतर्गत नेफा अंश elute: मेथनॉल: हिमनदों एसिटिक एसिड. (100:2:2, वी / वी / वी) सावधानी: हिमनदों एसिटिक एसिड खतरनाक है.
  13. 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत एकत्र नेफा अंश और सूखी निकालें नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  14. एसपीई टैंक पर एक नई aminopropyl सिलिका एसपीई कारतूस प्लेस और कचरे को इकट्ठा करने के लिए कारतूस के तहत टैंक ट्रे में एक पेंच टोपी ग्लास ट्यूब जगह.
  15. 3 शून्य के नीचे सूखी हेक्सेन के washes और गुरुत्वाकर्षण के तहत फिर एक अंतिम 1.0ml धोने के साथ स्तंभ धो लें. . कारतूस (हेक्सेन स्तर कारतूस मैट्रिक्स करे जब एक बंद की स्थिति को कारतूस स्तंभ चैनलों की बारी) सावधानी सूखी बनने के लिए अनुमति न दें: हेक्सेन खतरनाक है.
  16. नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल CE के साथ बेकार ट्यूब बदलें.
  17. शुष्क हेक्सेन और भंवर के 1.0 मिलीलीटर में (3.6 कदम में तैयार) सूखे टैग और CE अंश भंग. एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर स्तंभ के लिए यह लागू है और जी के तहत के माध्यम से ड्रिप करने की अनुमतिravity.
  18. आगे नहीं भरी गिरावट, वैक्यूम के तहत शेष तरल हटा दें.
  19. वैक्यूम के तहत, 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत CE और सूखी एकत्र अंश elute करने के लिए सूखी हेक्सेन के 2 एक्स 1.0 मिलीलीटर washes के साथ स्तंभ धो नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  20. शुष्क हेक्सेन के 2 एक्स 1.0 मिलीलीटर washes के अलावा के साथ टैंक ट्रे और Elute टैग में नया पेंच टोपी ग्लास ट्यूब लेबल टैग जगह: मेथनॉल: एथिल एसीटेट (100:5:5) शून्य के नीचे.
  21. 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत सूखी एकत्र अंश . नमूने एक सप्ताह तक सावधानी के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है: एथिल एसीटेट खतरनाक है.

4. प्रसिद्धि की तैयारी CE 10 से

  1. . अलग हो सीई अंश (कदम 3.19 में एकत्र) और भंवर सावधानी के लिए सूखी टोल्यूनि के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें: टोल्यूनि खतरनाक है.
  2. 2% (वी के साथ मेथिलिकरण अभिकर्मक तैयार (शुष्क मेथनॉल/ वी) 1.0 मिलीग्राम प्रति नमूना की आवश्यकता है जो की एच 2 एसओ 4),. कांच या ढक्कन के साथ उपयुक्त प्लास्टिक कंटेनर में शुष्क मेथनॉल की मात्रा बांटना और इसलिए 4 dropwise तो सावधानी उलटा द्वारा मिश्रण एच 2 के लिए आवश्यक राशि जोड़ें:. सल्फ्यूरिक एसिड खतरनाक है.
  3. शुष्क टोल्यूनि में भंग नमूने लिए methylating अभिकर्मक के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें, सुरक्षित ट्यूब टोपी, और धीरे मिश्रण.
  4. 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए गर्मी नमूने
  5. 2 घंटे के बाद गर्मी से ट्यूबों निकालें. . पोटेशियम बिकारबोनिट और पोटेशियम कार्बोनेट खतरनाक हैं: एक बार शांत समाधान (0.25 एम KHCO 3 0.5MK 2 सीओ 3) सावधानी निष्क्रिय 1.0 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. 1.0 मिलीलीटर शुष्क हेक्सेन और भंवर जोड़ें.
  7. 2 मिनट, कमरे के तापमान पर कम ब्रेक के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र.
  8. प्रसिद्धि होता है जो ऊपरी चरण, ले लीजिए, और एक नया गैर पेंच टोपी डिस्पोजेबल ग्लास ट्यूब में हस्तांतरण.
  9. के तहत एकत्र प्रसिद्धि से सूखी40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन नमूने एक सप्ताह तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

5. सीई प्रसिद्धि 14 से मुक्त कोलेस्ट्रॉल संदूषण का हटाया

(मुक्त कोलेस्ट्रॉल नमूना दूषित कर सकते हैं, के साथ और मुक्त कोलेस्ट्रॉल को हटाने के बिना उदाहरण chromatograph निशान के लिए चित्रा 1 देखें).

  1. एसपीई टैंक में बर्बादी ट्यूब प्लेस और टैंक पर एक सिलिका जेल विशेष कारतूस जगह है.
  2. वैक्यूम के तहत शुष्क हेक्सेन के 3 एक्स 1 मिलीलीटर washes और गुरुत्वाकर्षण के तहत 1 एक्स 1 एमएल के साथ स्तंभ धो लें.
  3. अपशिष्ट washes निकालें और टैंक में नई बेकार ट्यूब जोड़ें.
  4. 1 मिलीलीटर शुष्क हेक्सेन, भंवर में CE प्रसिद्धि भंग.
  5. एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग स्तंभ पर लागू करें और गुरुत्वाकर्षण के तहत के माध्यम से ड्रिप करने की अनुमति.
  6. वैक्यूम के अंतर्गत हेक्सेन के 3 एक्स 1 मिलीलीटर washes के साथ स्तंभ धो लें.
  7. अपशिष्ट washes निकालें और टैंक लेबल CE प्रसिद्धि में नया गैर पेंच टोपी ट्यूब जगह.
  8. Elute2 एक्स 1 मिलीलीटर शुष्क हेक्सेन के साथ CE फेम: Diethyl ईथर (95:5 वी / वी) washes.
  9. 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन के तहत शुष्क . नमूने एक सप्ताह तक सावधानी के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है: Diethyl ईथर खतरनाक है.

6. जीसी ऑटो पारखी शीशी में प्रसिद्धि का स्थानांतरण

  1. , भंवर नमूना, और एक जीसी ऑटो नमूना शीशी को स्थानांतरित करने के लिए 75 μl ड्राई हेक्सेन जोड़ें.
  2. नमूना भंवर और एक ही जीसी ऑटो नमूना शीशी को स्थानांतरित करने के लिए एक और आगे 75 μl ड्राई हेक्सेन जोड़ें. नमूने एक महीने तक के लिए छाया हुआ है और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

7. गैस chromatograph 14 विश्लेषण का उपयोग

  1. एक गैस chromatograph पर प्रसिद्धि का विश्लेषण करें. उदाहरण स्थापित: 30 एमएक्स x 0.25 मिमी 0.25 माइक्रोन BPX-70 के तापमान प्रोटोकॉल के साथ जुड़े सिलिका केशिका स्तंभ:
    प्रारंभिक तापमान 115 डिग्री सेल्सियस, पकड़ 2 मिनट, रैंप 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट 200 डिग्री सेल्सियस, 245 डिग्री सेल्सियस के लिए 18.5 मिनट, रैंप 60 डिग्री सेल्सियस / मिनट पकड़, जपुराने 4 मिनट.
    स्तंभ: हीलियम गैस, प्रवाह दर 1.0, दबाव 14.6 और वेग 29.
    इंजेक्टर: तापमान = 300 डिग्री सेल्सियस
    डिटेक्टर: हाइड्रोजन प्रवाह 40.0, हवा के तापमान = 300 डिग्री सेल्सियस, 45.0 प्रवाह, गैस हीलियम श्रृंगार, 184.0 प्रवाह
  2. (सीई प्रसिद्धि के विश्लेषण के लिए जैसे 25:1) के रूप में उपयुक्त सेट विभाजन अनुपात.
  3. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक चोटी के तहत क्षेत्र का निर्धारण करते हैं और मानकों के साथ तुलना करके प्रसिद्धि की पहचान. उदाहरण chromatograms के लिए चित्रा 2 देखें.
  4. कुल फैटी एसिड का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्ति फैटी एसिड के योगदान की गणना करने के लिए शिखर डेटा के तहत क्षेत्र का प्रयोग करें.
  5. राशि से आंतरिक मानक के क्षेत्र को विभाजित करके फैटी एसिड का पूर्ण सांद्रता की गणना गयी. इस्तेमाल किया ऊतक की राशि के भीतर प्रत्येक फैटी एसिड का पूर्ण सांद्रता प्राप्त करने के लिए इस परिणाम से प्रत्येक फैटी एसिड के क्षेत्र विभाजित करते हैं.

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Representative Results

इस विधि की सफलता ठीक प्रोटोकॉल का पालन पर और 'शोर' और एक वर्णलेख पर दिखाई दे सकता है कि प्रदूषण को कम करने के लिए आदेश में साफ विलायकों और अभिकर्मकों के प्रयोग पर निर्भर है. दूषित नमूनों वक्र गणना के तहत क्षेत्र की सटीकता को कम करने, विश्लेषण करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण हैं. प्रोटोकॉल स्पष्ट सममित, अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों के साथ और न्यूनतम पृष्ठभूमि शोर के साथ सफलतापूर्वक एक वर्णलेख पीछा किया जाता है, तो 3 चित्र में सचित्र के रूप में प्राप्त किया जाना चाहिए. संदूषण हुई है वर्णलेख अतिरिक्त चोटियों दिखाने के और 4 चित्र में सचित्र के रूप में गैर सममित (विषम) चोटियों दिखा रहे हैं. कोलेस्ट्रॉल निकाल दिया जाता है जब तक कि प्रोटोकॉल 5 में वर्णित है) (चित्रा 1 देखें (सीई से व्युत्पन्न प्रसिद्धि के चलने के दौरान मुक्त कोलेस्ट्रॉल से संदूषण घटित होगा.

एक तैयार अंशांकन मिश्रण का उपयोग वें में प्रसिद्धि की पहचान के लिए अनुमति देता हैई नमूना. अंशांकन मिश्रण वर्णलेख चित्रा 2 में सचित्र के रूप में सही ढंग से उनके प्रतिधारण समय पर आधारित पहचान नमूना और चोटियों की तुलना में किया जा सकता है, ताकि नमूने के रूप में एक ही साधन सेटिंग्स का उपयोग कर चलाया जाता है.

पीक क्षेत्र में कुल भीतर विशिष्ट फैटी एसिड के प्रतिशत की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. डेटा एकत्र किया गया है एक बार, यह चित्रा 5 में दिखाया गया है outliers के लिए उन्हें का निरीक्षण करने के लिए उपयोगी है. ग़ैर नमूने तो आगे की जांच की जा सकती है और यदि आवश्यक हो तो निष्कर्षण और / या विश्लेषण दोहराया.

(प्रोटोकॉल 2.3 कदम में वर्णित है) नमूने के लिए एक आंतरिक मानक जोड़ना आंतरिक मानक शिखर ब्याज के चोटी के क्षेत्र के सापेक्ष, और की ज्ञात मात्रा के क्षेत्र का उपयोग कर की गणना के द्वारा नमूना के भीतर फैटी एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए समायोजित की अनुमति देता है मूल नमूना मात्रा या वजन. तालिका 1 में, चूहा जिगर CE भीतर प्रसिद्धि एक के रूप में वर्णित हैंजिगर CE के भीतर कुल फैटी एसिड (g/100 जी कुल फैटी एसिड) का प्रतिशत. इन आंकड़ों तीन अलग भोजन में से एक पर 20 दिनों के लिए तंग आ कुंवारी या गर्भवती चूहों के यकृत में CE फैटी एसिड का वर्णन. दो कारक एनोवा (कारक: आहार, गर्भवती वर्जिन बनाम) का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण कई फैटी एसिड का अनुपात है, साथ ही महत्वपूर्ण आहार एक्स गर्भावस्था बातचीत (1 टेबल) पर आहार और गर्भावस्था की महत्वपूर्ण प्रभाव का पता चलता है. गर्भवती चूहों में जिगर CE की सामग्री अधिक कुंवारी महिलाओं की तुलना में आहार से प्रभावित है, एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 6 arachidonic एसिड (20:04 N-6 एए) दिखाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. चूहा जिगर ऊतक में मुक्त कोलेस्ट्रॉल को हटाने के महत्व को दर्शाता हुआ समान नमूनों का तुलनात्मक गैस chromatograms. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
एक तैयार अंशांकन मिश्रण का उपयोग चूहा जिगर ऊतक से नमूना CE प्रसिद्धि की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का चित्रा 2. उदाहरण. एक पीआरepared अंशांकन मिश्रण chromatograms नमूना भीतर फैटी एसिड की पहचान करने के लिए तुलना की जा सकती है, ताकि नमूने के रूप में एक ही साधन सेटिंग्स का उपयोग कर चलाया जाता है. अंशांकन मिश्रण के लिए साथ वर्णलेख मिश्रण में प्रसिद्धि लेबल की अनुमति देता है. इस लेबल ट्रेस तो आसानी से पहचाना बड़ी चोटियों तो उचित लेबल अंशांकन मिश्रण पर उन लोगों के लिए उनके अवधारण समय से तुलना की जा सकती है, जहां नमूना से वर्णलेख की तुलना में किया जा सकता है. उदाहरण के लिए ट्रेस पर प्रकाश डाला. 16:00 फैटी एसिड की सही लेबलिंग की अनुमति नीचे नमूना ट्रेस में फैटी एसिड के लिए ऊपर अंशांकन मिश्रण से प्रतिधारण बार की तुलना वर्णन करने के लिए. है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
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चित्रा 4
चित्रा 4. मानव प्लाज्मा से प्राप्त एक दूषित नेफा गैस वर्णलेख का उदाहरण है. वास्तविक चोटियों के एकीकरण को प्रभावित कर सकते हैं जो नमूना की शुरुआत में परिक्रमा के रूप में कई अप्रत्याशित चोटियों, कर रहे हैं. towar के रूप में देखा चोटियों बाधित और अपरिभाषित हैं परिक्रमा के रूप में नमूना के अंत डी एस और sloped बन गए हैं. यह वक्र गणना और इन फैटी एसिड की मात्रा का ठहराव के तहत क्षेत्र की सटीकता को प्रभावित करेगा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. वर्जिन चूहों में जिगर CE के फैटी एसिड की संरचना के बीच ग़ैर डेटा की पहचान एक उच्च वसा वाले सोयाबीन तेल आहार (एन = 6). इस विश्लेषण किया फैटी एसिड का प्रतिशत डेटा अस्पष्ट परिणाम निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाता है कि कैसे खिलाया. इन आंकड़ों नमूना 125 एक ग़ैर हो सकता है कि संकेत मिलता है, और आगे की जांच पड़ताल की आवश्यकता है. CE के भीतर पांच प्रमुख फैटी एसिड (16:00, 18:00, 18:01 N-9, 18:02 N-6, 20:04 N-6) नहीं दिखाया जाता है.. जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. वर्जिन और गर्भवती चूहों के बीच जिगर CE के arachidonic एसिड सामग्री, मान एसडी ± साधन हैं. प्रयोगात्मक आहार खिलाया एन = 6. एक आम पत्र के बिना मतलब है, पी <0.05 भिन्न होते हैं. * मेल हुआ आहार समूह, पी 0.05 <भीतर कुंवारी महिलाओं से अलग. यह उन्हीं आहार खिलाया गर्भवती चूहों की तुलना में विभिन्न आहार खिलाया वर्जिन चूहों के यकृत CE सामग्री में मतभेद दिखा तालिका 1 से परिणाम के एक दृश्य प्रतिनिधित्व है. मतभेद कुंवारी और गर्भवती चूहों के बीच प्रत्येक आहार समूह में देखा जा सकता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.


तालिका 1. वर्जिन और गर्भवती चूहों की चूहा जिगर cholesteryl एस्टर की संरचना फैटी एसिड, मान साधन (एसडी) कर रहे हैं. प्रयोगात्मक आहार खिलाया एन = 6. एनडी (<0.1% मतलब है) का पता नहीं इंगित करता है. वर्जिन या गर्भवती महिलाओं के भीतर एक आम पत्र के बिना मतलब है, पी <0.05 भिन्न होते हैं. * मेल हुआ आहार समूह, पी 0.05 <भीतर कुंवारी महिलाओं से अलग. इस तालिका में कुंवारी और गर्भवती चूहों खिलाया जब कम और अलग उच्च वसा वाले आहार के जिगर के ऊतकों में उपस्थित N-3 और एन -6 फैटी एसिड का मतलब मूल्यों को दर्शाता है. परिणामों के सांख्यिकीय पी का एक महत्व स्तर <कुंवारी और गर्भवती चूहों के बीच मतभेद के लिए 0.05 के साथ विचरण (एनोवा) के विश्लेषण का उपयोग विश्लेषण किया गया, आहार और आहार एक्स गर्भावस्था बातचीत के प्रकार. एनोवा परिणाम कुंवारी और मीटर के दायरे में गर्भवती चूहों के बीच arachidonic एसिड के स्तर में काफी अंतर (20:04 N-6) कर रहे हैं का सुझावatched आहार समूहों.

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Discussion

गैस क्रोमैटोग्राफी फैटी एसिड के विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए एक सटीक तकनीक है, और इसकी उच्च reproducibility नैदानिक ​​विश्लेषण के लिए उपयुक्त इस तकनीक समझे. उचित जीसी कॉलम उपलब्ध कॉलम स्थिर चरण, स्तंभ लंबाई और आंतरिक व्यास के polarity में बदलाव होने के साथ, ब्याज के फैटी एसिड की पहचान कर सकें करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. विश्लेषण की इस पद्धति में जुड़े सिलिका केशिका स्तंभ का उपयोग अच्छा थर्मल स्थिरता और इसकी उच्च सतह जड़ता और अच्छा प्रस्ताव 8 के कारण प्रतिधारण टाइम्स की उच्च reproducibility प्रदान करता है.

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निचले और ऊपरी चरण संग्रह कदम (प्रोटोकॉल 2.7 और 4.8 कदम) शामिल हैं. यह सही चरण के रूप में ज्यादा अवांछित चरण से किसी के साथ संदूषण के बिना संभव के रूप में एकत्र किया जाता है कि महत्वपूर्ण है. एक नमूने में contaminants की उपस्थिति एक अवांछनीय chromatographic उत्पादन में परिणाम होगा, चित्रा 2 में सचित्र के रूप में. एसपीई दौरान CE एकत्रित करते समय यह कारतूस कॉलम नमूना टैग से CE के सफल जुदाई अनुमति देने के लिए कॉलम प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए हेक्सेन के साथ washes निम्नलिखित विलायक (कदम 3.15) के साथ संतृप्त रखा जाता है कि आवश्यक है. मुक्त कोलेस्ट्रॉल को हटाने के लिए CE के आगे जुदाई चित्र 1 में सचित्र रूप chromatograph निशान पर दिखाई दे संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. यह शून्य के नीचे तरल को हटाने की आवश्यकता कदमों सभी तरल पूरी तरह से अच्छी पैदावार सुनिश्चित करने के लिए स्तंभ से निकाल दिया जाता है ठीक तो पीछा कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.

जीसी के मुख्य सीमा ऐसी phospholipids और triacyglycerols के रूप में जटिल लिपिड विश्लेषण करने से पहले प्रसिद्धि के लिए फार्म derivitization करने से पहले saponified किया जाना है, इसलिए इन लिपिड और फैटी एसिड के विशिष्ट संयोजन की विशिष्ट संरचनाओं पर जानकारी 10 खो दिया है कि जरूरत है. सभी चरणोंइस प्रोटोकॉल इस विधि इस विधि के अंदर किया जा सकता है परिवेश की उपयुक्तता जो सीमा विलायकों, के प्रयोग की वजह से एक धूआं हुड में बाहर किया जाना चाहिए यह भी नमूने की एक छोटी संख्या का विश्लेषण करने के लिए समय लग सकता है, आम तौर पर दो दिनों के काम ले रही है पूरी तरह से स्वचालित प्रक्रिया किया जाता है, जब तक कि डेटा उत्पादन के लिए ब्याज की नमूना से प्राप्त करने के लिए. नमूनों की बड़ी संख्या प्रसंस्करण हालांकि, जब प्रत्येक चरण के अन्य उपयोगकर्ताओं के लिए उपकरणों की इस तकनीक और उपलब्धता की समय प्रभावशीलता को अधिकतम करने के लिए बैचों में किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के भीतर कुछ तकनीकों समस्याग्रस्त जोड़ों के साथ लोगों को या जो दोहराव आंदोलनों के नकारात्मक प्रभावों से ग्रस्त हैं के लिए एक समस्या हो सकती है, जो (2.7 और 4.8 कदम) इस तरह के ऊपरी और निचले चरण एक्सट्रेक्शन के रूप में अभ्यास और मैनुअल निपुणता की आवश्यकता होती है.

इस विधि के भीतर कदम आसानी से नमूना की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जोड़ा या विभिन्न भागों का संग्रह की सुविधा के लिए हटाया जा सकता हैएस, प्लाज्मा विश्लेषण करते समय उदाहरण के लिए, पीई संग्रह आवश्यकता नहीं किया जा सकता है, लेकिन सेल और ऊतकों के नमूनों 10 में ब्याज की है. यह विधि भी अगर वांछित विशेष कदम छोड़ा जा सकता है, जहां कुल लिपिड अर्क, की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए संशोधित किया जा सकता है. ऐसा ही एक भिन्नता कुल लिपिड निष्कर्षण कदम को छोड़ देता है और साथ ही एसपीई 15 कदम जो लाल रक्त कोशिकाओं, के लिए वर्णित है. मौजूदा प्रोटोकॉल के विपरीत, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया विधि एक methylating अभिकर्मक के 250 μl 250 हेक्सेन के μl और 100 ˚ सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्म के साथ लाल कोशिकाओं को सीधे जोड़ा जाता है जो (14% बोरान trifluoride), का उपयोग करता है बेअसर कदम छोड़ दिया जाता है और इसके बजाय पानी और हेक्सेन जुड़ जाते हैं; नमूना तो centrifuged है और हेक्सेन ऊपरी चरण एकत्र की है और एक जीसी ऑटो पारखी शीशी में सीधे हस्तांतरित नाइट्रोजन के तहत सुखाने के बिना और हेक्सेन में फिर से भंग.

जीसी एक बहुमुखी विधि है और रिलायंस एनर्जी प्रदान करता हैउपलब्ध संशोधनों 15 और की एक श्रृंखला के साथ iable परिणाम नमूनों की एक विस्तृत विविधता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परमाणु जन विरोध के रूप में यह लेबलिंग के लिए अवधारण समय का उपयोग करता है के रूप में यह structurally समान फैटी एसिड के बीच अंतर करने में सक्षम है के रूप में N-6 और n-3 फैटी एसिड चयापचय विश्लेषण करते समय यह मास स्पेक्ट्रोमेट्री से अधिक लाभ (एमएस) है. एमएस एक नमूना भीतर फैटी एसिड की पहचान करने में सक्षम है, लेकिन stereoisomers में डबल बांड पदों भेद करने में असमर्थ है और अलग कुछ फैटी एसिड होता है बताने के लिए इसलिए असमर्थ है. यदि आवश्यक हो, दोनों तरीकों जीसी एमएस 16 से मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक को लिपिड चयापचय और lipidomics के क्षेत्र में समारोह की जांच के दौरान कार्यरत है. यह जीसी में विभिन्न स्थिर चरणों के इस्तेमाल से फैटी एसिड पहचान के हेरफेर फैटी एसिड के बीच भेदभाव करने की अनुमति देता है के रूप में एमएस के साथ मिलकर में जीसी का उपयोग काफी प्रगति हुई है अकेले एमएस नहीं कर सकते हैं. जीसी भी इलेक्ट्रॉन प्रभाव मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता हैवे ऐसे picolinyl एस्टर के रूप में वैकल्पिक रासायनिक डेरिवेटिव के साथ संयुक्त कर रहे हैं जब फैटी एसिड की पहचान के लिए अनुमति देता है (ईआइ एमएस),. इस तकनीक का उपयोग चौड़ी और इस तरह शरीर क्रिया विज्ञान, नैदानिक ​​biomarker पता लगाने, और विकृति है, साथ ही लिपिड जैव रसायन के रूप में 17 क्षेत्रों में से एक रेंज में एक शोध पद्धति के रूप में लिपिड रूपरेखा में सुधार जारी है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों चूहे अध्ययन करने Meritxell Romeu-नडाल के योगदान को स्वीकार करना होगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol Fisher Scientific M/4056/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform Fisher Scientific C/4966/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT Sigma- Aldrich W218405 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl Sigma- Aldrich S9888 Anhydrous
Hexane Fisher Scientific H/0406/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid Sigma- Aldrich 695084 'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid Sigma- Aldrich 339741 'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate Sigma- Aldrich 209619 99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate Sigma- Aldrich 237205 99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10204340 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene Fisher Scientific T/2300/15 'CAUTION' Fumes
Diethyl ether Sigma- Aldrich 309966 'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder BOC 44-w 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges Agilent 12102014 Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges Agilent 14102010 Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives Sigma- Aldrich 334324 Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes Fisher Scientific FB50251

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References

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रसायन विज्ञान अंक 85 गैस क्रोमैटोग्राफी फैटी एसिड गर्भावस्था cholesteryl एस्टर ठोस चरण निष्कर्षण पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड
गर्भावस्था के दौरान चूहा जिगर ऊतक में फैटी एसिड की compositional परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग करें
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Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. … More

Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. E., Burdge, G. C., Calder, P. C. The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy. J. Vis. Exp. (85), e51445, doi:10.3791/51445 (2014).

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