Summary
Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.
Abstract
Mammiferi sicuro nel recupero sensoriale e motoria seguente lesione del midollo spinale per mancanza di ricrescita assonale sotto del livello della lesione e l'incapacità di reinizializzare neurogenesi spinale. Tuttavia, alcuni Anamni tra cui il zebrafish Danio rerio mostre sia sensoriali e recupero funzionale anche dopo la completa resezione del midollo spinale. Lo zebrafish adulto è un organismo modello stabilito per studiare la rigenerazione dopo la lesione del midollo spinale, con recupero sensoriale e motorio da 6 settimane post-infortunio. Per usufruire di analisi in vivo del processo rigenerativo disponibile in zebrafish larvale trasparente così come strumenti genetici non accessibile nell'adulto, usiamo il zebrafish larvale di studiare la rigenerazione dopo resezione del midollo spinale. Qui mostriamo un metodo per riproducibile e verificabile sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, dai dati risulta recupero sensoriale inizio a due giorni post-infortunio (dpi), with il movimento di C-bend rilevabile da 3 dpi e la ripresa di nuoto libero da 5 dpi. Così proponiamo zebrafish larvale come strumento guidata al zebrafish adulti per lo studio di recupero dopo lesione del midollo spinale.
Introduction
Grave trauma al midollo spinale umano si traduce spesso in paralisi permanente e perdita di sensibilità al di sotto del livello della lesione, a causa della incapacità di ricrescere assoni o iniziare nuovamente neurogenesi 1,2. In contrasto con i mammiferi, tuttavia, Anamni tra cui salamandre e zebrafish (Danio rerio) mostrano robusta ripresa anche dopo la completa del midollo spinale recisione 3,4.
Lo zebrafish adulto è un modello ben consolidato per studiare il processo di recupero dopo lesione del midollo spinale 5-7. Dopo resezione completa del midollo spinale, ripristino della funzione sensoriale e locomotiva è osservata nel zebrafish adulto per 6 settimane post-infortunio 8. Al fine di esaminare il processo di rigenerazione in vivo, ci siamo rivolti al zebrafish larvale trasparente 9.
Qui vi presentiamo un metodo per transetto midollo spinale di un 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) larvale zebrafish USIng una pipetta microiniezione smussato come un bisturi, modificato da Bhatt, et al. 10 Questo metodo supporta throughput elevato, bassa mortalità e riproducibilità. Con la pratica, 300 larve / h può essere sezionato, e oltre 6 mesi di transections, di cui oltre 3.600 animali, 98,75% ± 0,72% sopravvisse entro 7 giorni post-infortunio (dpi). I nostri dati mostrano un rapido recupero di locomozione sensoriale e così: a 1 dpi, tutti i movimenti dai pesci feriti è guidata da un solo pettorale locomozione pinna. Tuttavia, le larve iniziano a rispondere al tungsteno ago tocco caudale a resezione del 2 dpi, ristabilire il movimento C-bend da 3 dpi, e visualizzare il nuoto predatori del 5 dpi 11. Utilizzando la colorazione anticorpi contro tubulina acetilata, abbiamo confermato che gli assoni sono assenti dal sito di lesione a 1 dpi, ma abbiamo attraversato il sito di lesione da 5 dpi. Crediamo che questo protocollo fornirà una valida tecnica per lo studio di ricrescita assonale e neurogenesi nel midollo spinale dopo la lesione.
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Protocol
Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard; esperimenti sono stati approvati dalla University of Utah Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.
1. Preparazione di piatti Chirurgia
- Fai piastre di chirurgia con 60 millimetri Petri e Sylgard 184 Kit di silicone elastomero, seguendo le istruzioni del produttore. Riempire i piatti non più di mezzo pieno e lasciare polimerizzare. Conservare coperto a temperatura ambiente.
2. Preparazione di Micropipette
- Realizzare micropipette da riscaldamento e tirando a parete sottile tubo borosilicato capillare in un estrattore micropipetta utilizzando le stesse impostazioni per rendere aghi microiniezione.
- Sotto un microscopio dissezione, snap off punta della micropipetta a circa 200 micron di diametro con pinza.
- Smusso bordo spezzato con un microgrinder inizialmente a 35 °, seguita da una seconda smussatura a 25 °. Assicurarsi che la punta è tagliente e SMOOTH. Conservare finito micropipetta smussato in una capsula di Petri su una piccola quantità di argilla.
3. Preparazione di Zebrafish larve
- 7 giorni prima della chirurgia, istituito serbatoi di accoppiamento di zebrafish maschile e femminile.
- Raccogliere gli embrioni la mattina seguente, 3 ore dopo che le luci si accendono per garantire la massima resa. Se si utilizza una linea giornalista transgenica come Tg (elevl3: eGFP) knu3, embrioni fecondati liste 100/100 mm Piastra in 25 ml di E3 a 28,5 ° C. In caso di utilizzo di tipo selvatico, specie fecondato embrioni mm piastra 25/100 in 25 ml di E3 a 28,5 ° C.
- Se si utilizza una linea di giornalista, lo screening degli embrioni per l'espressione fluorescente a 48 HPF. Lasciare embrioni individuati a maturare ad una densità di mm piastra 25/100 in 25 ml di E3 a 28,5 ° C.
- Quando le larve sono 5 dpf, preparare piastra chirurgia coprendo Sylgard con E2 + 10 mg / L Gentamicina solfato (GS) + Tricaine.
- Preparare piatto di recupero con l'aggiunta di 25 ml E2 + GS ad un 100 millimetri dis Petrih.
- Preparare bisturi con nastro adesivo insieme tre tamponi. Questo sarà un utensile triangolare con tre scanalature.
- Montare una micropipetta preparato sui tamponi con nastro adesivo in una delle scanalature.
- In caso di riutilizzo micropipette, a filo fino chiari con E2 + GS utilizzando una siringa da 1 ml e un ago G 27 prima del montaggio su tamponi.
4. Chirurgia
- Anestetizzare 1 piatto di larve in un momento (25 pesci) con Tricaine. I pesci sono sufficientemente anestetizzati quando si mostrano più risposta al tocco. È importante che i pesci sono completamente anestetizzati prima dell'intervento, altrimenti si contrarsi quando il bisturi li tocca. La chirurgia è eseguita al microscopio di dissezione.
- Trasferimento larve piastra intervento chirurgico.
- Sotto massimo ingrandimento, ruotare una larva alla volta in modo che giace su un fianco con la schiena più vicino alla mano che tiene il bisturi.
- Posizione pinza in modo che essi appoggiano sul Sylgard,angolata tutta la larghezza della larva.
- Rinforzo il bisturi vetro contro uno dei bracci della pinza, tagliate a faccia laterale dorsale della larva a livello del poro anale, assicurandosi di non tagliare oltre il bordo ventrale della notocorda. Ruotare il bisturi per recidere il midollo spinale.
- Ripetere l'operazione con il restante larve.
Nota: se una larva sanguina, ma non si riprenderà dalla chirurgia. Rimuovere immediatamente la larva dalla piastra chirurgia e eutanasia tramite overdose Tricaine.
- Dopo l'intervento chirurgico sul lotto di larve è completa, trasferimento ferito animali alla piastra recupero. Questo è sostenere la compensazione di anestesia.
- Attenzione: quando si raccolgono le larve feriti per il trasferimento, assicurarsi che siano raccolti capo né coda prima: non sottolineare il sito di lesione piegando le larve.
Nota: Tutti i dispositivi usati per la chirurgia possono essere riutilizzati, compresi i micropipette.
- Attenzione: quando si raccolgono le larve feriti per il trasferimento, assicurarsi che siano raccolti capo né coda prima: non sottolineare il sito di lesione piegando le larve.
5. Recovery
- Transfer ferito larve dalla piastra recupero a 100 lastre mm riempite con 25 ml E2 + GS con una densità di 25/plate. Permette di recuperare in un incubatore 28,5 ° C.
- Controllare piatti ogni giorno, eliminando gli animali malati o morti. Non cambiare il supporto fino Coleps (acqua dolce protozoi) sono visibili nei media. Quando si cambia il supporto, non trasferire il pesce ad una nuova piastra; invece, rimuovere quanto più mezzi di comunicazione possibile e inondare la stessa piastra con i nuovi media. Ripetere se necessario per ridurre la popolazione Coleps.
- Alimentare ogni giorno con una piccola quantità di cibo avannotti in polvere.
Nota: cibo vivo (ad esempio, paramecia o rotiferi), non possono essere alimentati da larve ferito solo dopo aver recuperato locomozione. In caso contrario, il cibo vivo sarà colonizzare il sito di lesione e uccidere le larve.
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Representative Results
Per ridurre la gravità dei danni ai tessuti circostanti il sito di lesione, la corretta smussatura della micropipetta è critica. Figura 1A mostra una punta smussata correttamente. Utilizzando una punta che è troppo ampia (Figura 1B) tende a provocare incidenti mortali più elevate a causa della maggiore probabilità di intaccare l'aorta dorsale, mentre una punta che è troppo stretto (Figura 1C) tende a colpo d'occhio fuori la pelle piuttosto che il taglio dei tessuti.
Per praticare questa tecnica, è vantaggioso utilizzare una linea giornalista come Tg (elevl3: eGFP) knu3 visualizzare il midollo spinale Figura 2A mostra un midollo spinale completamente sezionato di un live Tg (elevl3: eGFP). Zebrafish a 1 dpi, . mentre la Figura 2B mostra lo stesso pesce vivo al 3DPI Figure 2C e 2D mostrano ingrandimenti superiori del sito di lesione alle 3 dpi in Tg fisso (dbx1a: eGFP) pesci che hanno complete (Figura 2C) o incompleto (Figura 2D) recisione del midollo spinale. Nota la regione contigua di etichettatura neurone lungo il bordo ventrale del midollo spinale (freccia gialla).
Figura 1. Confronto dei bordi bisturi. A mostra una punta micropipetta smussata corretto e adatto per un intervento chirurgico. Questa dimensione è facilmente pulito per il riutilizzo. B mostra una punta micropipetta smussata troppo ampio per un intervento chirurgico su una larva 5 dpf. C è un esempio di una punta che è troppo stretta. Questa dimensione è molto difficile da pulire per il riutilizzo, e tende a promuovere l'azione di taglio di recisione, invece di tagliare D:. Cartone animato del gruppo di utensile lesione. Tre tamponi 6 "sono annidati in un pyramidal forma e nastro insieme. Il bisturi riposa in una delle scanalature formate dai tre tamponi, ed è registrato in posto.
.. Figura 2 Verifica completa recisione microscopia confocale a fluorescenza è stato usato per immagine inquadrata Tg (elavl3: eGFP) pesce in vivo a 1 dpi (A) e 3DPI (B). Per confermare la completa resezione, queste pile di immagini sono stati elaborati in ImageJ (rsbweb.nih.gov) per generare proiezioni intensità massima (MaxZ) come mostrato in A - B C - D proiezioni mostrano MaxZ di Huc / D etichettati Tg (dbx1a.: eGFP) pesce 3 dpi con completa sezione spinale (C) o resezione incompleta (D).Frecce gialle identificano sito di lesione, D = dorsale, R = rostrale. Barra della scala = 100 micron.
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Discussion
Quando inizialmente imparare questa tecnica, si consiglia di tentare non più di 50-100 transections in una singola sessione. Dopo aver imparato questa tecnica, siamo in grado di transetto fino a 300 embrioni per ora; Tuttavia, questo livello di velocità richiede pochi mesi di pratica settimanale. Consigliamo inoltre praticare con una linea giornalista e la verifica completa resezione finché l'incidenza di incompleta recisione del midollo spinale è ridotto a meno dell'1%.
Recisione del midollo spinale in zebrafish adulto è una tecnica ben consolidata e robusto per studiare la ricrescita assonale e neurogenesi dopo l'infortunio. Spostando l'analisi nell'organismo larvale, siamo in grado di esaminare il recupero in vivo. Inoltre, siamo anche in grado di utilizzare strumenti genetici non disponibili nel zebrafish adulto per esaminare i ruoli dei vari geni nel processo rigenerativo, ad esempio, Tcf7l1a 12.
Originariamente developed studiare neurogenesi seguente transezione del midollo spinale, questa tecnica può anche essere utilizzato per esaminare il recupero della funzione sensoriale: animali feriti mostrano una risposta a toccare caudalmente al sito di lesione da 2 dpi, e assoni hanno attraversato il sito di lesione da 5 dpi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo in debito con l'impianto University of Utah zebrafish per la zootecnia. RID è stato sostenuto da NIH R56NS053897, e LKB era un tirocinante predoctoral supportato dall'iniziativa HHMI Med-Into-Grad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
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