Summary
Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.
Abstract
De vraag naar antilichamen die de behoeften van zowel fundamenteel en klinisch onderzoek toepassingen te vervullen is hoog en zal drastisch toenemen in de toekomst. Het is echter duidelijk dat de traditionele monoklonaal technologieën niet alleen aan deze taak. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden om de vraag naar kwalitatief hoogwaardige en duurzame affiniteitsreagentia alle toegankelijke elementen van het proteoom voldoen. Met dit doel hebben high throughput methoden voor het uitvoeren van selecties uit faagweergegeven synthetische antilichaam bibliotheken werden ontwikkeld voor toepassingen in uiteenlopende antigenen en geoptimaliseerd voor snelle productie en succes. Hierin wordt een protocol in detail beschreven dat illustreert met video demonstratie van de parallelle selectie van Fab-faag klonen uit een hoge diversiteit bibliotheken tegen honderden doelen met behulp van een handleiding 96 kanaals vloeibare handler of geautomatiseerde robotica systeem. Met dit protocol kan een enkele gebruiker honderden antigenen genererenselecteer antilichamen om hen parallel en bevestig antilichaambinding binnen 6-8 weken. Gemarkeerd zijn: i) een levensvatbare antigeen formaat, ii) voorselectie antigen karakterisering, iii) kritische stappen die de selectie van specifieke en hoge affiniteit klonen beïnvloeden, en iv) vormen van toezicht selectie doeltreffendheid en jonge antilichaam kloon karakterisatie. Met deze benadering hebben we synthetische antilichaamfragmenten (Fab) verkregen vele doelwitten zoals single-pass membraanreceptoren, gesecreteerd eiwit hormonen en meerdere domeinen intracellulaire eiwitten. Deze fragmenten worden gemakkelijk omgezet in full-length antilichamen en gevalideerd hoge affiniteit en specificiteit vertonen. Verder hebben zij aangetoond functioneel in diverse standaard immunoassays zoals Western blotting, ELISA, cellulaire immunofluorescentie, immunoprecipitatie en aanverwante assays. Deze methodologie zal antilichaam ontdekking te versnellen en uiteindelijk terug te brengen ons dichter bij het realiseren van het doel of opwekking van duurzame, hoogwaardige antilichamen tegen het proteoom.
Introduction
Met het begin van de post-genoom tijdperk, de beschikbaarheid van hoogwaardige bindingreagentia te karakteriseren en moduleren eiwitten is essentieel voor nieuwe onderzoeks- en therapeutische mogelijkheden openen. Antilichamen blijven van cruciaal belang voor zowel de academische en industriële onderzoekers als fundamenteel onderzoek en diagnose-instrumenten en mogelijke therapieën te zijn. Niet verrassend, is er sprake van een indrukwekkende groei van het contract antilichaam-ontwikkeling bedrijven, waarvan de meeste vertrouwen op conventionele hybridoma- technologieën om aangepaste antilichamen te genereren. Niettemin, in vitro selectie met behulp van faagweergegeven antilichaam bibliotheken wordt een krachtig alternatief technologie die unieke voordelen en het succes waar de conventionele technologieën beperkingen 1, 2 kan zien kan bieden.
In het licht van de aanzienlijke vraag naar kwalitatief hoogwaardige antistoffen als research tools, twee primaire uitdagingen voor het opwekken van hernieuwbare antilichamen 1) selectie throughput en 2) antigeen availability. Een aantal groepen zijn nu beschreven in vitro selectie pijpleidingen die gericht zijn op het verhogen van de doorvoer en de mate van identificatie antilichaam. Deze beschrijvingen detail van een verscheidenheid van levensvatbare benaderingen die onder andere het selecteren van een van beide full-length richt 3,4, of structureel verwante domeinen 5,6,7, met op de kraal gebaseerd 6,8 of -plaat-gebaseerde 3,4 antigen immobilisatie regelingen. Bovendien heeft de groeiende interesse gen synthesetechnologieën 9 systematisch antigeen generatie gemaakt, bijzonder geïsoleerde domeinen redelijk kosteneffectief en kan mogelijk de moeilijkheid om voldoende hoeveelheden gezuiverd, full-length antigeen verlichten. Door de twee technologieën samen werd een zelfstandige en schaalbare antigen genereren en antilichaam selectie pijpleiding ingericht, dat parallel isolatie van antilichamen voor grote reeksen uitgedrukt antigeen domeinen mogelijk wordt en de ontwikkeling van reagentia voor cha vergemakkelijkenracterizing hele klassen van structureel of functioneel verwante eiwitten.
Tegen dit doel is een geïntegreerde pijpleiding die paren in silico identificatie van expressie antigen domeinen gensynthese, high-throughput bacteriële expressie van antigenen en schaalbare faagweergegeven antilichaam selecties ontwikkeld. Deze pijpleiding vereist slechts basisinfrastructuur beschikbaar voor de meeste life science laboratoria (waaronder antilichaam bibliotheken die steeds beschikbaar via licentie of inzake overdracht van materiaal zijn), maar is ook vatbaar voor automatisering voor gebruik op industriële schaal. Met dit protocol is het mogelijk om honderden affiniteit gelabeld antigen domeinen genereren en routinematig isoleren zeer specifieke antilichaamfragmenten veel van deze antigenen.
Faag display technologie toont aangetoond compatibiliteit met een breed scala van recombinant affiniteitsreagens formaten zoals Fab, scFv, Fv en autonome domeinen en eengroeiend aantal kleine 'alternatieve frameworks' (ontworpen ankyrin repeat eiwitten (DARPINS), fibronectine (Fn), lipocaline domeinen en meer 10). Discussie beperkt in dit voorbeeld voor de isolatie van Fab antilichaamfragmenten, hoewel wordt aangenomen deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan andere soorten bibliotheken. Met deze technologie Fabs met lage nanomolaire affiniteit voor kleine, gelabeld eiwit domeinen waaronder transcriptie factor domeinen, SH2-domeinen, RNA-bindende eiwitten en anderen succesvol is, waarvan vele binden eiwit van volledige lengte en zijn functioneel in immunoassays zoals immunofluorescentie , immunoprecipitatie en immunohistochemie. Belangrijk recombinante bindende klonen volledig verlengd en kan opnieuw gegenereerd uit expressieconstructen via bacteriële productie aanbieden meer consistentie, reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit, waardoor de kosten van strenge kloon validatie rechtvaardigen.
In dit protocol en bijbehorende video, basismethoden voor antilichaam selectie uit faagweergegeven bibliotheken met behulp van geïmmobiliseerde antigeen domeinen worden aangetoond. Deze specifieke werkwijze maakt GST gemerkt eiwitdomeinen geïmmobiliseerd door passieve adsorptie in microwell platen, alhoewel andere labels 11,12,13 en selectie formats 13,14,2 zijn ook met succes toegepast. Kritische overwegingen voor de opzet en uitvoering van selecties met parallelle monitoring van selectie parameters gericht op het identificeren en isoleren van specifiek verrijkte klonale antilichamen voor validatie zijn gedetailleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antigen Generation
OPMERKING: Antigen domeinen kunnen worden gesynthetiseerd en gekloneerd door een verscheidenheid van commerciële leveranciers in een geschikte IPTG-induceerbare expressie construct.
- Conversie-expressie constructen in chemisch competente, T1-faag bestendig, BL21 E. coli cellen door 10 ng coderende DNA in 20 pl 1X KCM op ijs in een 96 well PCR plaat gevolgd door de toevoeging van 20 liter chemisch competente cellen.
- Incubeer de cel / DNA mengsel op ijs gedurende 20 min bij kamertemperatuur gedurende 10 min en vervolgens op ijs opnieuw gedurende 2 minuten voor het redden met 100 ul voorverwarmde super optimale bouillon met glucose (SOC) media, die met een ademende plaat afdichting en schudden bij 37 ° C gedurende 1 uur bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.
- Plaat 5 ul van getransformeerde cellen op Luria-Bertani (LB) / agarplaten aangevuld met carbenicilline (100 g / ml) en kweken O / N tot afzonderlijke kolonies voor het verkrijgengenereren van glycerol voorraden.
- Inoculeer 1 ml 2YT / carb media met 5 gl glycerol en kweken gedurende 12 uur bij 37 ° C in een 96 well deep-well blok met schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.
- Inoculeer NZY media15 (aangevuld met 0,05% glucose, 2% lactose en 100 g / ml carbenicilline) met een 1:40 verdunning van deze cultuur, schud gedurende 6-8 uur bij 30 ° C en 200 rpm in een 2,5 cm orbitale shaker.
- Pellet bacteriën en zuiveren antigene eiwitten in high-throughput in een 96-well filterplaat met 100 pl Ni-NTA-hars volgens eerder gepubliceerde protocols16,17.
- Bepaal de concentratie van gezuiverde eiwitten door Bradford kleurstofbindende assay18 en karakteriseren van de grootte en zuiverheid scheiding en visualisatie van 10-50 ug met Coomassie kleuring op een SDS-PAGE gel (zie figuur 2).
Opmerking: In dit stadium eiwitten kunnen verder worden gekarakteriseerd door werkwijzen die eiwitaggregatie 19 beoordelen 20 afhankelijk van de aard van het antigeen en de eisen van de selectie pijpleiding.
2. Voorbereiding en titratie van de faagbibliotheek
- Kies een enkele kolonie van T1 faagresistente E. coli-cellen in 1 ml van 2YT medium aangevuld met 50 ug / ml tetracycline.
- Zodra celgroei visueel vastgesteld verdunnen cultuur in groter volume 2YT aangevuld met 50 ug / ml tetracycline aan een voldoende hoeveelheid cellen voor infectie waarborgen (gewoonlijk 45 pl per verdunning bibliotheek, zie hieronder.).
- Bereid de bibliotheek voor gebruik door precipiteren van het faag van opslagbuffer met 1 / 5de volume van autoclaaf 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) incuberen op ijs gedurende 30 min en pelletiseren neergeslagen faag door centrifugeren bij 12.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer geprecipiteerd faag in een geschikt volume van 1 x PBS pH 7,4, 0,2% BSA en 0,05% Tween (PBT), aanpassing to een geschikte faag concentratie selecties (indien nodig) om voldoende bibliotheek dekking te garanderen. Zie Stap 2.9 en discussie.
- Verdun een 5 pl aliquot faag in 45 pl 1x PBS pH 7,4 in een steriele plaat met meerdere putjes, meng, en een reeks van 10-voudige verdunningen in dezelfde buffer.
- Voeg 5 pi van elke faag verdunning tot 45 pl T1 faagresistente E. coli-cellen in log-fase groei (OD 600 = 0,4-0,8) in een multi- putjesplaat, bedekken met een ademende afdichting en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm gedurende 30 min in een 2,5 cm rondschudapparaat.
- Plaat 5 pl van geïnfecteerde cellen van elk van de putjes op een voorverwarmde agarplaat aangevuld met 100 g / ml carbenicilline en kweken O / N bij 37 ° C totdat kolonies zichtbaar.
- Bereken de totale faag / ml als volgt:
Faag / ml = aantal kolonies op een carbenicilline plaat in de meest verdunde monster x 200 x 10 I (waarbij i = de maximale number verdunningen waarbij kolonies duidelijk). - Om het aantal gecoate antigeen putjes bepalen dekking van de bibliotheek diversiteit te waarborgen, als volgt te berekenen:
Aantal gecoate antigeen putten nodig =
Gewenste voudige dekking * diversiteit bibliotheek
# Fagen per 100 gl
3. Antilichaam Selectie van faag display bibliotheken
3.1) Antigen Immobilisatie
- Om vries-dooi cycli die kunnen beïnvloeden antigeen kwaliteit en verdunningen vergemakkelijken, stelt een stam- eiwit plaat genormaliseerd 100x werkende concentraties (bijvoorbeeld 500 g / ml) en hoeveelheid in niet-bindende 96-well platen voorkomen.
- Bereid-antigeen beklede platen uit voorraad eiwit oplossingen één dag voorafgaand aan elke ronde van selecties door verdunning uit voorraad platen met PBS.
- Coat 96 putjes hoge eiwitbinding polystyreen platen met 100 ul van GST-gelabeld antigeen eiwit of negatieve controle pProtein (GST, BSA, neutravidine, etc.) en 5 ug / ml in PBS. Schudden bij 250 rpm 4 ° CO / N op een microplaat schudinrichting.
- Verwijder proteïneoplossing uit de beklede microplaten, blokkeren de met antigeen beklede en negatieve selectie platen met 200 ui blokkerende buffer (0,2% BSA in 1 x PBS pH 7,4) en schudden bij 250 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
- Na blokkering was de geblokkeerde proteïne beklede platen vier maal met 200 ul van 1 x PBS pH 7,4 met 0,05% Tween (PT) buffer handmatig of middels een geautomatiseerde microplaat wasmachine.
3.2) Bibliotheek Pre-klaring en Antigen-faag Incubation
- Afbreken van de bibliotheek van niet (of tag) specifieke bindende faag gepresenteerde antilichaamfragment klonen door overschrijving van 100 pl (10 12 faag) faag bibliotheek bereid in PBT buffer tot een aantal putjes bekleed met negatieve controle eiwit of vrij affiniteitslabel eiwit (bijvoorbeeld GST) overeenkomt met het aantal doelen en incubeer faagin putjes 1-2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 250 rpm.
OPMERKING: Als een alternatieve of aanvullende middel van negatieve selectie, incubatie kan ook worden in de aanwezigheid van een overmaat (5-25 uM) oplosbaar eiwit affiniteit tag (bijvoorbeeld GST) uitgevoerd om verder te verwijderen-tag bindende klonen en snel herstel van specifieke doelgroepen bindende klonen. - Transfer faag supernatant van negatieve selectie met antigeen beklede platen en incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 250 rpm voor het vangen van specifiek bindende klonen.
- Verwijder ongebonden faag en was putjes van de microplaat 8-15 keer met PT buffer handmatig of met behulp van een microplaat wasmachine. Verwijder overtollig wasbuffer net voor elutie.
3.3) Elutie, Infectie en Fagen Amplification
- Vroeg op de dag van de selecties, kies een enkele kolonie van T1 faagresistente E. coli-cellen in 1 ml van 2YT medium aangevuld met 50 ug / ml tetracycline en groeien bij 37 ° C with schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat of gelijkwaardig.
- Zodra celgroei wordt vastgesteld en kan worden gezien door het oog, het volume van 2YT media aangevuld met 50 ug / ml tetracycline aan een voldoende hoeveelheid cellen voor infectie waarborgen (meestal 100 pl per selectie putje).
- Kweek de cellen tot een OD600 van 0,4-0,8 bereikt (ongeveer 5-7 uur), dan elueerde gebonden faag voeg 100 ul van de cellen gewassen antigeenplaat en schud bij 37 ° C gedurende 30 min.
- Voeg M13K07 helperfaag tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 10 cfu / ml en incuberen bij 37 ° C gedurende 45 min onder schudden bij 200 rpm.
- Overdracht cellen 1,2 ml 2YT aangevuld met 150 ug / ml carbenicilline en 75 ug / ml kanamycine in een 96-well deepwell blok met V-bodem en kweken O / N bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.
3.4) Fagen Voorbereiding en Herhaalde Rondes van Selectie
- Pellet bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Meng gelijke volumes faagsupernatanten uit replicaplaten in een mini-tube 96-well steriele microplate blauwe doos, neutraliseren met 1/10 volume van 10X PBT en meng. Herhaal selectieronden (vanaf stap 3.1.1) voor 3-4 rondes of tot verrijking wordt waargenomen (zie rubriek 4 en 7) in vergelijking met de negatieve controle-eiwit.
OPMERKING: In de eerste ronden van selectie bij significant / detecteerbaar verrijking is niet te verwachten (dwz rondes 1 en 2), kan kwantificering van input en output faag titers (in hoofdstuk 7 en representatieve resultaten weergegeven in figuur 3 beschreven) behulpzaam bij het waarborgen zijn faag concentraties minimum voor een succesvolle selecties (in Discussion beschreven) en zijn meer geschikt dan samengevoegd ELISA's.
4. Karakterisering van gepoolde ELISA
- Coat 96-well hoog eiwit-binding polystyreen platen met 100 ul van GST-gelabeld antigeen eiwit of negatieve controle eiwit (GST, BSA, neutravidine enz.) op 2 ug / ml als per paragraaf 3.1 en schud bij 4 ° CO / N.
- Verwijder overtollig antigeen, blokkeren de plaat met 200 ul blokkeerbuffer onder schudden gedurende 1-2 uur bij KT bij 250 rpm op een microplaat schudinrichting en was vier keer met 200 ul PT buffer met de hand of met geautomatiseerde plaatwasser.
- Breng 100 pi van faag supernatant (verdunning 1: 10-1: 20 in PBT buffer), schudden bij 250 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en was de plaat acht maal met 200 ui buffer PT.
- Voeg 100 ul van anti-M13-HRP (1: 5000 in PBT buffer). Schudden bij 200 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, dan was de plaat zes maal met 200 ui PT-buffer en tweemaal met 200 ui PBS.
- Breng 100 pi van 1: 1 TMB substraat en ontwikkelen gedurende 5-15 minuten (of totdat substantiële kleur heeft ontwikkeld), stop de reactie door toevoeging van 100 ui 1 MH 3 4 en lees de plaat bij 450 nm.
- In het algemeen kan verrijking in faagverzamelingen in rondes 3-4 worden waargenomen als een verhouding van specifiek bindende versus niet-specifieke binding van> 2 (zie figuur 4)
LET OP: Het is informatief om dat hoge absolute bindende signaal op de affiniteitsmerker eiwit mee geeft verrijking van tag-specifieke bindmiddelen (in plaats van doel bindmiddelen), en dat hoge absolute bindende signaal op de negatieve controle eiwit geeft verrijking van niet-specifieke of " sticky "bindmiddelen.
5. Clone Selectie, Sequencing en karakterisering
5.1) Isolatie van Single Fab-faag Clones
- Afzonderlijke klonen voor sequencing en karakterisering te isoleren, infecteren 1/10 volume van het geamplificeerde faag zwembad op T1 faagresistente E. coli-cellen in de log-fase van groei (OD 600 = 0,4-0,8) in een ronde bodem microtiterplaat, dek af met een Breathable plaat afdichting en incubeer onder schudden bij 200 rpm gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Bereid 10-voudige seriële verdunningen in 2YT media en plaat op aparte agarplaten gesupplementeerd met 100 g / ml carbenicilline.
- Pick enkele kolonies in 450 ui 2YT / carb medium aangevuld met 1 x 10 9 M13K07 faag / ml en kweken O / N in een mini-buis 96 putjes steriele microplaat blue box incuberen bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
- Pellet bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Klonale faag supernatant kan worden gebruikt voor het rangschikken van Fab-faag klonen (zoals beschreven in paragraaf 5.4) of klonale directe binding ELISA om specificiteit tegen geïmmobiliseerde antigenen (zoals beschreven in secties 5.3 en 21) die representatieve resultaten worden getoond in Fig 5.
5.2) Expressie van Fab-klonen voor de karakterisering
- Naar aanleiding van het klonen in een passende eXpression vector (zie bespreking), pick enkele E. coli kolonies getransformeerd met expressieconstructen in 1 ml 2YT / carb media in een 96 well deep-well plaat met een steriele tandenstoker of pipetpunt en kweken gedurende 12-16 uur bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Dit kan handmatig of met een geautomatiseerde kolonie picker worden gedaan.
- Breng 40 pl groeiende kweek tot 1,5 ml NZY medium aangevuld met glucose / lactose / glycerol in een 96 well deepwell blok volgens de methodologie van Studier et al. 15
Opmerking: Als alternatief kunnen cellen worden gekweekt gedurende 3-4 uur (OD 0,8-1,0) in niet aangevuld en eiwitexpressie geïnduceerd door toevoeging van 1 mM IPTG. - Bedek de kweek (ken) met een ademende afdichting en drukken Fab klonen gedurende 6-8 uur bij 30 ° C onder schudden bij 200 rpm. Spin platen bij 4000 xg gedurende 15 min om bacteriële cellen te pelleteren, verwijder het supernatant, afdekplaten met een folie afdichting en vries pellets bij -20 ° C tot lysis.
- Bevrijden expressie Fabs uit verzamelde pellets met 100 ul lysis buffer (Tris HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 met 1 mg / ml lysozym en 10 U benzonase / ml kweek en proteaseremmers) en schudden 2 uur bij 4 ° C.
- Verwijder de celresten door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en laat ruw lysaat supernatant voor gebruik in de initiële karakterisering van de specificiteit van ELISA platen (zie paragraaf 5.3).
5.3) Clone Karakterisering door directe binding Klonale Fab ELISA
- Immobiliseer antigenen zoals beschreven in paragraaf 3.1 plaats aliquotting 30 pi van 2 ug / ml antigeen in PBS aan putjes van een plaat met 384 putjes. -Quad gebaseerd antigeen-outs in de plaat kan reagensoverdracht faciliteren bij het gebruik van 96-kanaals gebaseerd doseren hoofden. Wassen en blokkeren ELISA-platen volgens paragraaf 3.1.
- Ontruimd lysaten verzameld uit Sectie 5.2 kan direct worden aangebracht op geïmmobiliseerd antigeen voor evaluatie van binding. Incubeer 30 pl lysaat per putje gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 200 rpm.
OPMERKING: Gezuiverde Fab kloon eiwit kan afwisselend gebruikt worden door verdunnen tot 10 ug / ml in PBT buffer en toepassen 30 pi van elke kloon geblokkeerde putjes met antigeen of negatieve controle-eiwit (GST, BSA) en ontwikkeling op dezelfde wijze beschreven hieronder. Alternatief kunnen Fab-faag worden gebruikt door verdunning 10 ui faag supernatant (beschreven in paragraaf 5.1) in 20 pl PBT buffer (1: 3) en het detecteren met anti-M13-HRP-antilichamen (in stap 4.4 beschreven - 4.5) - Verwijder overtollig lysate en wassen putten handmatig of met behulp van een geautomatiseerd plaat gewassen 8x met 100 ul van PT buffer en verwijder overtollig buffer.
- Incubeer 30 ui van een 1: 5000 verdunning van secundair anti-FLAG antilichaam in PBT buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 200 rpm.
- Wassen, te ontwikkelen en te kwantificeren als per Secties 4,3-4,5.
OPMERKING: Representatieve resultatenillustreren zowel specifieke en niet-specifieke binding klonen zijn weergegeven in figuur 5.
5.4) Clone Sequencing
- Bereid een PCR master mix zoals aangegeven in tabel 2.
- Voeg 2 pi van het geschikte PCR-matrijs (of faag supernatant of geresuspendeerde één faagmide bevattende bacteriële kolonie) 20 pi PCR Master Mix bereid met de geschikte primers in putjes van een PCR-plaat.
OPMERKING: Afzonderlijke mastermengsels nodig zijn voor sequentiebepaling van zowel de zware als lichte keten genen. - Voer de PCR reactie met de in tabel 2 opgesomde parameters - PCR instellingen.
- Controleer succes van de PCR-reactie door het mengen van 5 ul van de voltooide reactie met ladingskleurstof op een 1% agarosegel aangevuld met DNA visualisering vlek en beeldvorming op een 300 nm transilluminator.
- Voeg 2 pi PCR product 10 uit steriel water bevattende 0,2, Pi elk van exonuclease en garnalen alkalische fosfatase en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min gevolgd door enzym inactivatie bij 80 ° C gedurende 10 min om overmaat primers in voorbereiding sequencing verwijderen.
6. Scaling voor Automated Selecties
6.1)-pipet gebaseerd Liquid Handling
- Maak een 1% (w / v) broomfenolblauw in water en verwijder onoplosbare deeltjes met een 0,45 ml filter.
- Om het lineaire bereik van absorptie op de plaatlezer bepalen bereiden een 1: 1000 verdunning van 1% broomfenolblauw-oplossing in water en verder met tweevoudige seriële verdunningen (16 verdunningen totaal).
- Breng 100 pi van elke verdunning tot een vlakke bodem met 96 putjes plaat en lees absorptie bij 590 nm. Perceel absolute absorptie versus verdunningsfactor en kies een verwatering van het midden tot hoge einde van het lineaire bereik voor de volgende testen.
- Broomfenolblauw toevoegen aan water of aan de werkelijke oplossingdie wordt gepipetteerd op basis van de drie platen met 96 putjes geselecteerd in de vorige stap in voldoende volume voor pipetteren verdunning, plus dode volume in het reservoir.
- Kalibreer een single-channel pipet op de proef volume leveren door pipetteren water op een analytische balans (100 ul van water weegt 100 mg bij RT.)
- De gekalibreerde pipet, breng het testvolume van de gekleurde oplossing ten minste drie putjes van een vlakke bodem met 96 putjes plaat en lezen hun absorptie bij 590 nm, in drievoud.
- Weeg drie lege vlakke bodem platen met 96 putjes op een analytische balans en opnemen van hun massa.
- Pipetteer testvolume van reservoir naar elk van de drie platen met 96 putjes en meet de absorptie bij 590 nm, in drievoud.
- Weeg elke plaat en bereken het verschil in massa.
- Evalueer of de absorpties in elk putje uniformiteit binnen het tolerantiebereik (bijv. +/- 5%) en of zij stroken met the extincties verkregen door de hand-pipetteren met de gekalibreerde pipetman. Als bepaalde kanalen zijn steeds over- of leveren (bijvoorbeeld zie figuur 6), te volgen procedures reparatie en herhaal de evaluatie procedure totdat alle kanalen leveren uniforme volumes.
- Ten tweede, zodra alle kanalen worden bevestigd om een uniforme volumes leveren, controleren de juistheid van dat volume door het berekenen van de gemiddelde massa verschil, per putje. Zo zal een perfect gekalibreerd vloeibare handler set voor 100 ul leveren 9,60 g water per plaat, of 0,10 g water per well. Als de werkelijke geleverde volume is constant boven of onder het beoogde volume, dan is een correctiefactor kan worden toegepast, dat wil zeggen, het programmeren van 110 ul om daadwerkelijk leveren 100 pi.
OPMERKING: Voor kleine hoeveelheden, bijvoorbeeld 10 ul gebruikt tienvoudig meer broomfenolblauw in de geverfde oplossing en pre-aliquot 90 pl water aan de platen met 96 putjes met de hand, zodat de absorbances zijn meetbaar en vallen in het lineaire bereik.
6.2) Geautomatiseerde Plate Wassen
- Immobiliseren positieve doel en negatieve controle eiwitten in afzonderlijke putjes van 96 putjes microplaten (twee platen per conditie te testen) zoals beschreven in paragraaf 3.1.
- Blokkeer aspecifieke bindingsplaatsen door incubatie met blokkerende oplossing een uur bij KT.
- Voeg identieke 100 ul aliquots 10 13 cfu / ml targeten-bindende Fab-faag oplossing PBT aan alle putjes in alle platen en geïncubeerd onder zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Was twee platen op basis van elke conditie, één plaat voor infectie en titratie en een plaat voor ELISA.
- Evalueren van de werkzaamheid van de was door directe infectie in bacteriën en titratie (zoals beschreven in paragraaf 3.3 (zonder M13K07 toevoeging) en 7.2.1) of de ontwikkeling van anti-M13-HRP antilichaam en colorimetrische substraat (zoals beschreven in hoofdstuk 4).
- Faag titers frOM specifieke klonen vaak op in het bereik van 10 5 -10 7 faag / ml van een geïmmobiliseerd eiwit waartegen de kloon specifiek bindt. Sommige residuele binding negatieve controle-eiwit (bijvoorbeeld BSA) is te verwachten en algemeen 10 2 -10 5 faag / ml waargenomen, maar zeer lage titers (dwz., <10 1) kan overdreven stringente wassen signaal, die compromis een selectie.
- Voor faag binding bepaald door ELISA vergelijken absolute bindende signalen voor positieve en negatieve controle eiwitten om te bepalen of robot wassen overeenkomt met gevestigde resultaten handen wassen (figuur 7).
6.3) plaatwasser Decontaminatie
- Om te beginnen, voert de sanering protocol te testen.
OPMERKING: Wij raden u aan ten minste het dubbele van de totale line volume, en prime en genieten van de wasmachine hoofd gedurende 5 minuten in 0,5% natriumhypochloriet, vers verdund frOM commercieel bleekmiddel (typisch 6% natriumhypochloriet). - Prime en genieten van de wasmachine hoofd gedurende 5 min in steriele (geautoclaveerd) water en tenslotte, prime het systeem totdat de lijnen zijn vol met lucht.
- Prime de lijnen met steriel water of wassen buffer.
- Was een steriele 96 goed microplate een keer, te verwijderen uit de wasmachine en verzegelen met steriele plaat afdichting. Dit is de pre-contamination control plaat.
- Aliquot 100 pl O / N geamplificeerde faag supernatant aan alle putjes van een plaat met 96 putjes.
- Was de faagbevattende plaat een keer, dan verwijderen uit de wasmachine en verzegelen met een plastic of folie plaat afdichting. Dit is de verontreiniging controle bord.
- Het uitvoeren van de sanering protocol wordt getest. In dit voorbeeld, herhaalt u stap 6.3.1 en 6.3.2.
- Was steriele microplate keer, dan verwijder uit wasmachine en afdichting. Dit is de sanering testplaat.
- Plaat 50 pi logfase E. coli titratie platen; Dit is de pre-infectie controle plaat.
- Ontzegelen pre-verontreiniging, vervuiling en decontaminatie 96 putjes en voeg 100 pl E. coli in de log-fase groei stadium aan alle putjes, met behulp van nieuwe tips voor elk putje.
- Seal en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten bij 200 rpm.
- Plaat 50 ui geïnfecteerde cellen uit drie willekeurige putjes van elke plaat met 96 putjes tot 10 cm 2YT / carb platen en incubeer bij 37 ° CO / N.
- Pipetteer 50 ul van geïnfecteerde cellen uit alle putjes van elke plaat diepe putjes die 1 ml 2YT plus 100 g / ml carbenicilline per putje en groeien O / N bij 37 ° C.
- Herhaal de ontsmetting protocol en laat de wasmachine lijnen drogen.
OPMERKING: Nee O / N groei op platen of in vloeibaar medium moet worden waargenomen op de pre-infectie controle, pre-contaminatie controle of decontaminatie-test platen. Veel kolonies en groei moet worden waargenomen op de contaminatie controle plaat; zo niet geen conclusie over de effectiviteit van dedecontaminatie protocol kan worden gemaakt. Idealiter zal de decontaminatie platen geen kolonies en geen O / N groei van elk van de putten in de O / N platen verkregen. De stringentie van de decontaminatie protocol kan worden verhoogd bij hogere bleekconcentraties, langere uitzettijden en additionele cycli.
7. Input / Output Titraties
7.1) Input Fagen Titraties
- Verdun een 5 pl aliquot van faag 50 pi met steriel gefiltreerd PBS en meng.
- Bereid seriële 10-voudige verdunning in steriel gefiltreerd PBS tot 10 10 met behulp van multi-channel pipet of een 96-kanaal pipet.
- Inoculeer 5 gl verdund faag in 45 ui T1 faagresistente E. coli-cellen in log-fase groei (OD 0.6-0.8) en incubeer bedekt met een ademende afdichting voor 30 min bij 37 ° C.
- Plaat 5 ul van geïnfecteerde cellen op een LB / agarplaat aangevuld met 100 ug / ml carbenicilline en geïncubeerd O / N at 37 ° C.
- De faag concentratie kan worden geschat op basis van de meest verdunde monster waarin kolonies lijken volgens de berekeningen beschreven in paragraaf 2.8.
7.2) Output Fagen Pitrations
- Na elutie van gebonden faag-plaat door toevoeging van E. coli-cellen, verdun een 5 pl aliquot van faag geïnfecteerde cellen 50 ul met geautoclaveerd 2YT media
- Bereid seriële 10-voudige verdunning in een autoclaaf 2YT media tot 10 6 met behulp van een multi-channel pipet of 96 kanaals pipet.
- Plaat 5 ul van geïnfecteerde cellen op een agarplaat aangevuld met 100 ug / ml carbenicilline en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
- De faag concentratie kan worden geschat op basis van de meest verdunde monster waarin kolonies lijken volgens de berekeningen beschreven in paragraaf 2.8.
LET OP: In beide gevallen (dwz, input en output faag titers, vergeleken met kolonie nummers op zowel tetracycline (totaal cell nummer) en kanamycine (hulpfaag titer) kan ook informatief zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Is gebruikt De hierin beschreven protocol antilichaam-fragmenten van verschillende zowel qua structuur en functioneel gerelateerde antigen domeinen van combinatorische faag gepresenteerde Fab databanken parallel. Problemen gerelateerd antigeen beschikbaarheid kan worden omzeild, vaak door in silico identificatie van expressie antigen domeinen die geschikt zijn voor antilichamen selectie 23 zijn. Door het koppelen antigeenexpressie antilichaam selectie binnen hetzelfde laboratorium (figuur 1) wordt het mogelijk om een geïntegreerde pijpleiding, waarbij antigeen kritische parameters om de selectie gemakkelijker worden gecontroleerd construeren. Meestal zorgvuldige bepaling van domeingrenzen maakt de expressie en isolatie van adequate hoeveelheden voldoende zuiver antigeen van high-throughput expressie in 96 of 24 putjes deepwell platen (figuur 2) voor succesvol gebruik in antilichaam selecties. Tijdens de opeenvolgenderonden van het selectieproces kunnen geëlueerde faag concentraties en verrijking van fagen die specifiek antigeen binden worden gecontroleerd door ofwel faag titratie (figuur 3) of met faagverzamelingen in een ELISA assay (figuur 4). Een bindende verhouding (> 2) geeft doorgaans de aanwezigheid van specifieke binding klonen. Omgekeerd kan een lage verhouding (<2) te bepalen van de oorzaak van een storing selectie. Zo kan een verhouding <2 met hoge niet-specifieke OD onvoldoende verwijdering van niet-specifieke klonen (of plakkerig bindmiddelen) en eventueel van verdere optimalisatie van het selectieprotocol rechtvaardigen. Niettemin eenmaal verrijking wordt gedetecteerd, individuele klonen met hoge affiniteit kunnen vervolgens worden geïsoleerd voor sequentie en karakterisering. Clone binding kan worden gekenmerkt door een colorimetrische immunoassay en maakt de vergelijking van binding van de Fab-faag of Fab aan geïmmobiliseerd antigeen versus negatieve controle-eiwit, waardoor een maat van verrijking (verhouding binding aan tarGebruik versus negatieve controle eiwit of affiniteitsmerker eiwit) (Figuur 5).
Tijdens schaalvergroting en automatisering van deze methode, kan de beoordeling van de belangrijkste functies van de liquid handling unit nuttig zijn om de juiste en nauwkeurige bediening met vergelijkbaar met die tijdens de eigenlijke selecties oplossingen zorgen. Het gebruik van absorberende chromoforen in oplossing kan helpen detecteren wanneer specifieke kanalen in de fluïdica (aspiratie of afgifte) ofwel verstopt of afdichting waardoor deelvolume levering verloren zie figuur 6. Kan Automated wassen eenheden ook een bron van variabiliteit en kan aandacht vereisen. Het gebruik van bekende bindende klonen maakt vergelijking van binding tussen doelbeheerstoepassing eiwit dat doelwitbindingsgebied gehandhaafd terwijl achtergrondbinding verwijderd (figuur 7) waarborgen bij wasparameters zoals afgifte snelheid, wassen volumes en het aantal wasbeurten wordt geoptimaliseerd. Volgendhet gebruik van een geautomatiseerde plaatwasser met faag oplossingen, effectieve ontsmetting protocollen noodzakelijk om de afwezigheid van kruiscontaminatie van opeenvolgende ronden van selecties of verschillend selectieprocedures en probleemoplossing / interpretatiegids is opgenomen in tabel 3 te garanderen.
Figuur 1. Overzicht -. High throughput antigeen productie en antilichamen selectie pijpleiding Dit overzicht toont stap voor stap visualisatie van een representatieve antigeen en antilichaam generatie selectie pijpleiding. De in silico identificatie van antigeen domeingrenzen stelt gensynthese, expressie en selectie op domeinen voor eiwitten die slecht kunnen worden gekenmerkt. Uitgedrukt antigen domeinen worden geïmmobiliseerd en gebruikt om pools van specifieke hoge affiniteit antilichaam klonen uit een combinatorial antilichaambibliotheek op het oppervlak van filamenteuze faag. Pools van antilichaam-faag geëlueerd en geamplificeerd individuele antigenen kunnen vervolgens worden bewaakt round-to-round verrijking van specifieke bindende klonen in ELISA-gebaseerde bepalingen vergeleken geïmmobiliseerde doelwit versus negatieve controle eiwit voor isolatie van afzonderlijke bindende klonen voor karakterisering. Zoom klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. SDS-PAGE visualisatie van affiniteit gelabeld antigenen. Een representatieve SDS-PAGE van expressie gebracht en gezuiverd 6X-HIS-GST-gelabeld antigen domeinen (5-10 kDa domein + 26 kDa GST) oorspronkelijk geïdentificeerd door in silico analyse antigen domeingrenzen. Eiwitdomeinen tot expressie gebracht en geïsoleerd door Affischap zuivering worden gekenmerkt door SDS-PAGE voorafgaand aan selecties op maat op basis van identiteit, voldoende opbrengst en zuiverheid te gebruiken in faag-antilichaam selecties mogelijk te waarborgen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Visualisatie van faag productie titers. Faag uitgang titers worden bepaald door uitplaten cellen geïnfecteerd met faag over een 10-voudige verdunningsreeks op agar medium aangevuld met verschillende antibiotica (tetracycline, carbenicilline en kanamycine) bij de laagste verdunning bepalen waarin kolonies kan worden waargenomen en schatten het aantal faag gebonden aan antigen richten en geëlueerd. Klik hier voor een grote fotor versie van deze figuur.
Figuur 4. Binding verhouding van doelstelling om negatieve controle eiwit door gepoolde ELISA. De voortgang van verrijking kan worden geëvalueerd volgende rondes van de selectie door het screenen van individuele versterkt eluenten tegen zowel de specifieke doelstellingen en de negatieve controle eiwitten en / of geïsoleerde affiniteitsmerker. In het diagram zijn de verrijking ratio's voor het binden van 96 individuele faag-antilichaam zwembaden tegen hun 96 respectieve antigenen versus negatieve controle eiwit in parallel. Elke verhouding waarde is afgeleid van twee absorptiemetingen die Quantify binding van de faag pool hetzij doel of negatieve controle-eiwit met een HRP-gefuseerde antilichaam specifiek voor M13 faag manteleiwit. Een verhouding drempel van 2 of hoger (vaak variërend van 2-10 of meer zoals afgebeeld in rood) wordt gebruikt als indicatie van verrijkingen de waarschijnlijke aanwezigheid van specifieke bindende klonen. Mindere verhoudingen kunnen falen van of specifieke problemen met de selectie die verdere optimalisatie van het protocol kunnen rechtvaardigen betekenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Directe binding klonale Fab-faag of Fab ELISA. De binding van afzonderlijke klonen (hetzij Fab-faag of Fab formaat) kan worden geëvalueerd door ELISA gebaseerde bepaling versus geïmmobiliseerd eiwit in 384 putjes. Binding wordt gedetecteerd met behulp van een secundaire HRP-gefuseerde antilichaam tegen de M13 jas eiwit op Fab-faag of een affiniteit tag op de Fab. Ruwe absorptie waarden voor binding van klonale Fab-faag aan antigeen, negatieve controle eiwitten en antigeen affiniteitsmerker (GST) richten zijn afgebeeld illustreren specifieke binders (A01, A04, A06), en plakkerig bindmiddelen (A05).
Figuur 6. Evaluatie van de afgegeven volumes door geautomatiseerde liquid handling unit. Consistente en accurate levering van de beoogde volumes door robotachtige of handmatige 96-wells pipetteren systemen kunnen worden beoordeeld aan de hand geverfd oplossingen en een bord lezer. In dit voorbeeld, 10 pl van een oplossing die broomfenolblauw gepipetteerd achtereenvolgens alle putjes van twee platen met 96 putjes met een tip box. Elk putje bevat 90 pl / putje dH 2 O, analoog aan de toevoeging van helperfaag geïnfecteerd E. coli. extincties Elke plaat bij 590 nm worden gelezen in drievoud, en de volumes worden geïnterpoleerd op grond van een standaard curve bereid met een gekalibreerde enkel kanaal pipetman. Volumes geleverd aan een enkele rij op de eerste en tweede plaat getoond. Merk op dat op het sparrent plaat, goed E04 krijgt geen geverfd oplossing, en op de tweede plaat, is een dubbele volume krijgt. Dit geeft aan dat de tip touch is niet voldoende voor consistente levering, en vereist verdere optimalisatie. 95% betrouwbaarheidsintervallen voor drievoud absorptiemetingen getoond.
Figuur 7. Evaluatie van geautomatiseerde plaat wassen. Effectieve verwijdering van ongebonden faag kan worden bepaald met een ELISA Fab-faag meten binding aan geïmmobiliseerde positieve (anti-FLAG antilichaam) en negatieve (BSA) controle eiwitten onder variatie van de wasomstandigheden. In dit voorbeeld wordt ingevoerd faag analoog aan naïeve bibliotheek (10 13 cfu / ml in PBT) verwijderd met acht of zestien wassen met de hand of met de robot. Resterende faag binding aan BSA gelijk voor alle voorwaarden zoals specifieke binding aan geïmmobiliseerde anti-FLAG antilichaam, indicAting dat bij deze lage stroomsnelheid, beide methoden zijn gelijkwaardig en streng genoeg. 95% betrouwbaarheidsintervallen duplo putjes getoond.
| OPLOSSINGEN | |||
| 2YT media - Voeg water toe tot 1 L, aan te passen pH tot 7,0, en autoclaaf. | gistextract | 10 g | |
| tryptone | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| NZY media (1 L) | NZ Amine | 10 g | |
| gistextract | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 ml | ||
| 20 zout voorraad | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 voorraad suiker (1 L) | glucose | 25 g | |
| lactose | 100 g | ||
| glycerol | 250 ml | ||
| 20x zout voorraad (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH4Cl | 1 M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbenicilline (Carb): | 100 mg / ml in water. Filter-steriliseren. | ||
| Kanamycine (Kan): | 25 mg / ml in water. Filter-steriliseren. | ||
| Tetracycline (Tet): | 10 mg / ml in water. Filter steriliseren. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2.5 M | ||
| 1x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCl | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mm | ||
| KH 2 PO 4 | 1.5 mM | ||
| 1X KCM | KCl | 500 mM | |
| CaCl2 | 150 mM | ||
| MgCl2 | 250 mM | ||
| SOC Media | gistextract | 5 g / l | |
| tryptone | 20 g / l | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| MgSO4 | 20 mM | ||
| Glucose | 20 mM | ||
| Blokkeerbuffer | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| PBT buffer | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| PT buffer | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| Fosforzuur | H 3 P0 4 | 1 M | |
Tabel 1. Media en oplossingen.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Bestanddeel | ul per reactie | ||
| Water | 19.45 | ||
| 10x Taq buffer | 2.5 | ||
| dNTPs (10 mM voorraad) | 0,675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| Taq-enzym | 0,125 | ||
| Forward Primer (100 uM voorraad) | 0.25 | ||
| Reverse primer (100 uM voorraad) | 0.25 | ||
| Heavy Chain sequencingprimers | |||
| M13 Forward primer | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 Reverse primer | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Lichte keten sequencingprimers | |||
| M13 Forward primer | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 Reverse primer | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| PCR-INSTELLINGEN | |||
| Stap 1. | 94 ° C gedurende 3:00 min | ||
| Stap 2. | 94 ° C gedurende 0:30 min | ||
| Stap 3. | 55 ° C gedurende 0:30 min | ||
| Stap 4. | 72 ° C gedurende 1:00 min | ||
| Ga terug naar stap 2 en herhaal 24x | springen naar stap 2 | ||
| Stap 5. | 72 ° C gedurende 7:00 min | ||
| Stap 6. | |||
Tabel 2. PCR Master Mix and Settings.
| Interpretatie van ontsmetting resultaten | |||
| Plaat | Verwachte carbénicilline titer | Als niet? | |
| Pre-infectie onder controle | 0 | Cellen werden pre-geïnfecteerd; niets kan uit het experiment worden gesloten. | |
| Contaminatie controle | gazon | Onvoldoende verontreiniging kunnen werkzaamheid van een decontaminatie beoordelen; overwegen onderdompelen verdeelstuk faagoplossing plaats aspireren het. | |
| Decontaminatie-test | 0 | Ontsmetting niet voltooien; verhogen inweektijd, bleekwater Concentratie of probeer SDS en EtOH wast in plaats daarvan. | |
Tabel 3. Evaluatie van wasmachine decontaminatie. Om de werkzaamheid van decontaminatie bepalen, moet worden aangetoond dat wasmachine werd verontreinigd met faag, en dat de decontaminatie protocol succes geëlimineerd dat verontreiniging. Met behulp van faag dat verlenen carbénicilline verzet, worden de verwachte resultaten van een dergelijke test genoteerd, samen met suggesties moet de echte uitkomst afwijken van de verwachte uitkomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het uitvoeren van in vitro antilichaam selecties, de twee belangrijkste determinanten van selectie succesvol zijn 1) het isoleren van goed gevouwen antigene doelen voor het selecteren op en 2) de beschikbaarheid van een hoge functionele diversiteit antilichaambibliotheek. In veel gevallen kan de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden goed gevouwen, full-length eiwit beperkend. Een benadering voor het overwinnen van deze beperking is om domeinen geïdentificeerd van bioinformatica analyse 22 en gesynthetiseerd voor het inbrengen te gebruiken in een bacteriële expressievector met een passende affiniteitsmerker.
Er zijn een verscheidenheid van labels die gebruikt worden in biotech toepassingen oplosbaarheid verhogen, zuivering vergemakkelijken en onstabiele domeinen stabiliseren. 11 De mogelijkheid om bijna synthetiseren iedere gewenste insert sequentie maakt een zeer veelzijdige antigeen generatieplatform. Hoewel de-GST gelabeld formaat is gebruikelijk, hebben succesvolle resultaten eerder geweestverkregen met hexahistidine, Fc, Halo, maltose bindend eiwit en plaatsspecifieke biotinylering labels en aangenomen wordt dat talloze andere affiniteitsmerkers kunnen worden geoptimaliseerd voor gebruik in een vergelijkbare platform. Echter, kan affiniteitsmerkers zowel gunstige als onbedoelde negatieve gevolgen hebben in de downstream-toepassingen 11 en moeten grondig worden onderzocht voordat tot vaststelling van een pijpleiding op basis van een bepaald formaat.
Vaak nieuwe gebruikers zal de vraag hoe de kwaliteit van een antilichaam bibliotheek beoordelen vormen en al is er geen duidelijk antwoord, moet men proberen om een aantal belangrijke functies te beoordelen (natuurlijke of synthetische), inclusief door de algemene diversiteit, relatieve weergave niveaus, de aard van en de omvang van randomisatie (dwz, bibliotheek ontwerp versus bibliotheek inhoud bepaald door sequencing) en de fysisch-chemische eigenschappen van het antilichaam tegen de beoogde toepassing. Hoewel buiten het bestek van dit protocol, een meer gedetailleerde treatment van deze functies en hoe ze kunnen de selectie van antilichamen van invloed kunnen hier 2,23 gevonden worden. Kennis bibliotheek diversiteit name van belang dat voldoende dekking van de diversiteit garanderen tijdens selecties. Typisch, een faag concentratie die 100-1000 kopieën van elke faagkloon in de bibliotheek biedt is wenselijk en moet ervoor zorgen dat elke ware positieve bindmiddelen aanwezig in de bibliotheek kan worden teruggewonnen. Echter, niet-specifieke binding van faag op oppervlakken drastisch boven 10 13 faag / ml en bij zeer uiteenlopende bibliotheken microplaat, meer dan een enkel putje per antigen nodig zijn om voldoende dekking te garanderen. Aan de andere kant, als het input-bibliotheek te verdund is, de absolute concentratie van ware positieve binders zal zo ver onder de KD (typisch nM) zij niet worden hersteld. Gezien deze beperkingen moet faagbibliotheken algemeen geresuspendeerd tot 12-13 oktober faag / ml voor de eerste selectie.0; Bij deze concentratie 100 L hoeveelheid faag is een 1,000-100 voudige dekking van een 10 9 -10 10 diversiteit bibliotheek kan routinematig bindende klonen geven aan verschillende antigenen. Bij lagere concentraties, of verhoogde diversiteit, kan het noodzakelijk zijn het aantal putjes van antigeen gekozen die in de eerste ronde verhogen (zie paragraaf 2.9). Na ronde 1, maar de meeste van de niet-bindende diversiteit van de bibliotheek is verwijderd; overtollige dekking van de ronde 1 uitgang diversiteit is meestal gemakkelijk haalbaar met behulp van een enkele goed. In geval van parallelle selecties in 96 putjesplaten kan dit het aantal antigeenspecifieke selectieplaten verplicht één, na de eerste ronde verminderen.
Tijdens werkelijke selecties kunnen faag titratie objectieve metingen te karakteriseren en de voortgang bieden, terwijl tegelijkertijd aandachtsgebieden name in de eerste ronden van selectie identificeren waar verrijking is niet voldoendegedetecteerd. Dit kan vooral handig tijdens het schalen van de selecties voor het protocol te bepalen. In het algemeen ingang faag titers (dwz naïeve bibliotheek of post-amplificatie van geëlueerd faag) moet relatief constant (10 12 -10 13 faag / ml) tussen de rondes blijven, met een slechte celgroei / faag titer laag aangeeft mogelijke besmetting en / of slechte output van de vorige ronde. Hoewel uitgang faag titers worden verwacht in verrijking toenemen in latere ronden van selectie, wordt een reeks van 10 3 -10 5 cfu / ml in de eerste twee ronden verwacht. Afwijking van deze reeks kunnen mogelijke problemen met de selectie, zoals vervuiling of overtollige wasstringentie geven. In latere rondes van de selectie (dat wil zeggen, rondt 3 en 4), kan de verrijking van klonen die het doelwit antigeen specifiek binden via gepoolde ELISA's die maatregel binding van de faag zwembad tegen zowel doelantigen als negatief worden beoordeeldcontrole-eiwit (zie hoofdstuk 4).
Na 3-4 selectieronden (: negatieve controle eiwit signaal verhouding van 2: of eenmaal verrijking doelwit eiwit een doelantigeen bereikt 1 of hoger in vergelijking met de achtergrond eiwit), worden geïnfecteerde bacteriële cellen uitgeplaat enkelvoudige faagmide kolonies sequencing isoleren initiële karakterisering en klonering indien nodig. Op dit moment is het zeer raadzaam om Fab-faag converteren naar Fab bevrijden voordat aanvullende karakterisering. Hoewel Fab-faag kan worden gebruikt voor initiële karakterisering door verdunning 10 ui faag supernatant (beschreven in paragraaf 5.1) in 20 pl PBT buffer en detectie met anti-M13-HRP-antilichamen (in stap 4.4 beschreven - 4,5), in onze ervaring, bindende eigenschappen kunnen belangrijke wijzigingen in overal van 5-20% van de klonen op bevrijding van de faag deeltje en vervroegde conversie problemen met valse positieven kunnen ondervangen. De specifieke methode voor conversie zal afhangen van de unique architectuur van het faagmide en bijgevolg niet behandeld expliciet hier. In de meest gebruikte vectoren, kan doorgaans worden uitgevoerd door 1) omzetting van gezuiverde faagmide (of faagmide zwembad) in een competente niet-suppressor E. coli stam HB2151 zoals of 55.244 als een amber (TAG) codon grijpt de Fab en pIII eiwit, 2) het inbrengen van een amber stopcodon tussen de Fab en pIII eiwitten tot expressie van oplosbare antilichaamfragmenten mogelijk in een niet-suppressor stam of 3) door het kloneren van immunoglobuline genen (van afzonderlijke faagmide of faagmide zwembad) in een geschikte expressievector. Om selectie en karakterisering verdere stroomlijning kunnen samengevoegd kloneringsmethoden effectief middel bieden voor het omzetten bindende klonen massaal in expressie constructen, waardoor zowel de kans op vals-positieve binding van Fab-faag partikels en waarbij expressie lysaten worden gebruikt voor de vroege karakterisatie, zelfs de kosten en inspanningen van de zuiveringkan in eerste instantie worden vermeden.
Voor klonen direct geïsoleerd uit bibliotheek F (24 beschreven), kan antilichaam variabele domeinen worden gesequenced met 1-2 pi faag supernatant als matrijs voor PCR amplificeren complementariteit bepalende gebieden (CDR's) (zie tabel 2 van materialen naar bibliotheek F gerichte primers ). Met behulp van deze primers wordt de variabele gebieden van zware en lichte keten leveren producten van -700 en -500 bp, respectievelijk voor de drie CDR's. Primers omvatten annealing plaatsen voor M13-primers zodanig dat producten kunnen worden gesequenced na cleanup (zoals beschreven in paragraaf 5.4.5) met standaard primers in de meeste sequencing kernfaciliteiten. Alternatief wordt Fab-faag zwembaden die zijn gekloneerd in een expressievector en getransformeerd direct in E. coli voor expressie, kunnen afzonderlijke kolonies worden geïsoleerd en geresuspendeerd in 15 ui 2YT en 1-2 pi van de celsuspensie rechtstreeks gebruikt als template voor enkele Colony PCR met geschikte primers.
Het automatiseren van selecties zullen optimalisatie en validatie van een aantal belangrijke robotachtige functies vereisen. In het algemeen moet-pipet gebaseerd vloeistofverwerkende accuraat en consistent in alle 96 kanalen te zijn, moet de plaat wassen ongebonden faag efficiënt te verwijderen zonder het strippen geadsorbeerd antigeen of gebonden Fab-faag uit de selectie plaat. Effectieve ontsmetting van de plaat wasmachine is ook nodig tussen de rondes om verrijking en effectieve contra-selectie, en tussen opeenvolgende selecties om kruisbesmetting te voorkomen. Om het high-throughput selectieprocedure optimaliseren, zijn eenvoudige benaderingen gaan deze functies eerder gebruikt en worden hieronder gedetailleerd beschreven en in het protocol.
Om de samenhang van de volumes van alle kanalen van een vloeistof doseren / aspiratie hoofd afgeleverd evalueren, wordt een gekleurde oplossing gepipetteerd naar een vlakke bodem 96 well plaat en de absorbance in elk putje gemeten op een bord lezer. Een chromofoor zoals broomfenolblauw is nuttig voor het verven oplossingen vergelijkbaar met die gebruikt voor real over naar de effecten van verschillende oppervlaktespanning en cohesie eigenschappen volumes die worden geleverd evalueren. Na bevestiging dat alle kanalen afgeven gelijkblijvende volumes, kan de nauwkeurigheid van de totale geleverde volume wordt bepaald door de massa vloeibaar overgebracht naar elke plaat.
Automatisering van de plaat wassen om ongebonden klonen verwijderen primair vereist optimalisering van de snelheid waarmee wasbuffer wordt afgegeven en het aantal wassingen worden toegepast. Een redelijke methode evalueren deze parameter stelt positieve controles (specifieke Fab-faag bindende klonen) het effect van het variëren van de afgiftesnelheid en / of het aantal wassingen te bepalen of 1) geadsorbeerd antigeen of gebonden faag beoordelen wordt verwijderd door overdreven strenge wassen of 2) niet-specifieke binding aan niet-verwante eiwitten buitensporig due aan voorwaarden die niet streng genoeg te wassen. Residuele / gebonden faag kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd, hetzij door infectie in bacteriën en plating voor enkele kolonie telt, of door middel van ELISA met behulp van secundaire antilichamen specifiek voor antilichaam affiniteitsmerkers of faagmantel eiwitten. Negatieve controles worden gebruikt om resterende niveaus van niet-bindende Fab-faag beoordelen eiwitten of specifiek bindende Fab-faag targeten niet cognate / achtergrond eiwitten, die hoog zijn als wassen onvoldoende streng. In dit geval gebruikten we geïmmobiliseerde BSA als controle voor aspecifieke binding en een anti-FLAG antilichaam dat een FLAG epitoop tag op het Fab-faag als een positieve controle herkent. We vergeleken de acht en zestien wasbeurten met behulp van de robot versus wassen met de hand, op een gemiddelde debiet, om te laten zien dat deze technieken waren gelijkwaardig. Afwisselend, het meten van input en output faag titers (zie hoofdstuk 7) tijdens het lopende selecties kan ook helpen om fijne aanpassingen in de was parameters te maken. Ten slotte moet de ontsmetting van de plaat ringen gebruikt voor selecties effectief om versleping van fagen uit eerdere selecties te elimineren. In onze ervaring, vers verdund 0,5% natriumhypochloriet is snel, effectief en goedkoop. Detergentia zoals SDS zijn ook effectief, maar vereisen veel meer uitgebreid wassen te verwijderen uit het systeem. Reagens controleren compatibiliteit voor het systeem voorafgaand aan de test. Om decontaminatie beoordelen, testen we de aanwezigheid van residuele faag in oplossing behandeld door het fluïdica systeem en interpreteren resultaten volgens tabel 3.
Kortom, dit protocol biedt een schaalbare methode voor het isoleren van Fabs van combinatorische bibliotheken door parallel in vitro selecties tegen eiwit domeinen en biedt technieken voor het valideren van een geautomatiseerd faagselectie systeem. Kosten en infrastructuur barrières die uitgebreide dier faciliteiten kunnen opleveren worden beperkt omdat deze methode niet opnieuwly op de immunisatie van dieren. Verder, door de integratie van antigeen generatie met antilichaam-faag selectie, kwaliteit factoren die selectie succes van invloed zijn gemakkelijker gecontroleerd en aangepast. Wanneer de tijd van antigeen expressie selecteren en eerste karakterisering in de orde van 6-8 weken, kan een ontvankelijker productiesysteem gerealiseerd. Antilichamen geïsoleerd van in vitro selecties zijn ook beide eenvoudig worden aangepast (als gevolg van genotype-fenotype koppeling) en hernieuwbare, waarvoor slechts opgeslagen DNA van de expressieconstruct herhaaldelijk en reproduceerbaar opnieuw genereren antilichaam. Eindelijk door te laten zien dat dit protocol kan worden uitgevoerd met behulp van een quasi-handleiding of volledig geautomatiseerde aanpak die een op maat ontworpen, robotachtige selectie systeem gebruikt, kan de doorvoer schaalbaar en toegankelijk is voor kleine academische en industriële laboratoria gelijk.
Met behulp van de high-throughput methoden hierboven beschreven en de bibliotheek F synthetische antilichaambibliotheek 24 in vitro - en in situ -expressed eiwitten. Hoewel succespercentages voor een bepaalde keuze hangt af van zowel de kwaliteit (zuiverheid, foldedness, mono-dispersiteit etc.) van het antigen targets alsmede de kwaliteit en diversiteit van het antilichaam bibliotheek is waargenomen die overal 25-80 % van antigenen bindmiddelen opleveren voor een high throughput selectie. Belangrijk is het vermeldenswaard dat klonen met de mogelijkheid om doelfunctie moduleren kan vaak worden geselecteerd. Deze bibliotheek wordt geconstrueerd met een volledig menselijk raamwerk dat deze antilichamen vatbaar potentiële therapeutische toepassing 25 maakt Dit onderstreept het belang van deze pijpleiding als een alternatieve benadering voor het genereren van affiniteitsreagentia met bredewaarde.
Samengevat zal de robuustheid en veelzijdigheid van de in dit protocol benadering verder helpen bij de optimalisatie industrialisatie en uiteindelijk wijdverbreide gebruik van deze technologie als een goed middel om de doelstelling van het genereren affiniteitsreagentia vrijwel alle leden van langdurige het menselijk proteoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen graag de NIH Gemeenschappelijk Fonds erkennen - Eiwit invangreagentia Programma voor de financiering van de ontwikkeling van het recombinant antilichaam Network antilichaam selectie en karakterisering pijplijn en de Canadese Stichting voor Innovatie voor financiering bij de aankoop van de robot selectie platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
