Introduction
确定主机和影响HIV-1发病机理和疾病进展是至关重要的合理的疫苗设计的病毒特征。细胞免疫应答是HIV-1感染人体免疫反应的重要组成部分。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所必需的急性病毒血症的初始控制，并允许主机建立一个稳定的状态（设定点）的病毒载量1,2。这些效应细胞的实验耗尽导致的病毒控制3,4的损失。尽管这样，逃避突变发生在病毒基因组的颠覆CTL识别病毒感染的细胞5-9的范围内。
某些HLA等位基因已低病毒载量和较慢的疾病进展，包括B * 57，B * 27和B * 81 10-15关联。的HLA I类等位基因的保护益处部分可以归因于它们的目标基因组的功能约束区域，例如Gag的事实并选择该减少病毒在体外 16-21复制的能力逃逸突变。虽然从细胞免疫系统逃逸，是在选择中的HLA I类等位基因的上下文中的病毒有益的，这些突变的影响可以具有用于发送时主机差动后果与HLA-错配的个体22,23。因此，了解病毒复制能力传输的HLA相关逃逸突变的影响，以促进我们的早期HIV-1发病机制的理解将是非常重要的。
尽管已经取得了很大的进展，以识别和描述与具体的HLA-I类等位基因24-29相关个人逃逸突变的适应度的缺陷，自然产生的HIV-1毒株的HLA相关基因多态性的独特而复杂的脚印，而产生的人类白细胞抗原可能不同的免疫遗传背景的30介导的免疫压力。在APrevious分析，格普费特等 。结果显示，从88急性感染赞比亚得到的传输加格序列的HLA相关的基因突变的积累与设定点病毒载量的31减少有关。这个建议的有害逃逸突变的传输，特别是在加格，对HLA不匹配的收件人提供临床益处，并且可能是由于减毒病毒复制。展望未来，就必须研究如何复杂的自然产生的菌株中的Gag基因多态性的组合协同工作来定义传播病毒的特性，例如复制能力，以及如何早期复制可能反过来影响HIV-1的临床指标和晚期发病。
布罗克曼等人首次证实GAG-Pro序列的过程中慢性期感染和病毒载量在这两个亚型C和B感染隔离复制能力之间的联系32-35。实验方法在这些研究中提出，虽然适当的审查由慢性感染个体的序列的体外复制能力，有几个技术上的警告和限制，使学习在C亚型HIV-1的复制能力急性感染的个体困难。此方法依赖于种群基于PCR扩增的序列引入B亚型NL4-3原病毒，这是来自部分来自LAV的重组，实验室适于病毒原液36。病毒的产生是完成通过共转染在CEM基于T细胞系37与PCR产物的消化Δ-GAG-亲 NL4-3的DNA。这种方法需要病毒在一段周的向外生长到几个月，这可能歪斜回收的病毒原液的性质有关的病毒准种的体内 ，并因此改变的体外复制能力的测定。这种方法Iš更适合于研究慢性感染的个体，它有效地用于病毒选择具有最高的复制能力，并在那里从大量的慢性感染个体的克隆许多不同的病毒变异体是相当劳力密集的，因此是不可行的。然而，急性感染个体中，有一般一到两个变体存在，并且因此，可以消除通过在体外选择压力偏斜所回收的病毒原液的性质的风险，使得在体外复制能力的更精确的评估。其次，这个方法需要重组C亚型的gag-Pro序列成B亚型来自骨干，并且可以引入骨干不相容偏压入分析。由于这些限制，大量的序列必须以克服引入的任何可能存在的偏差进行分析。
在这里，我们描述了一个另类的实验Appro公司ACH适合学习从C亚型急性感染个体的序列。我们用限制性内切酶克隆策略，引进源自HIV-1 C亚型感染者急性感染时间点进入C亚型前病毒的骨干，MJ4 gag基因。使用MJ4的为其中克隆的gag基因的共同骨架为C亚型的序列的分析至关重要。 MJ4从初级分离38演变而来，因此也不太可能引入偏倚由于骨干网和gag基因的亚型不兼容。另外，使用酶和限制性克隆的方法允许在原病毒构建体直接转染到293T细胞中，并在一个克隆的病毒原液的恢复相同的克隆的gag序列。
下面介绍的方法是一种高通量的方法来评估C亚型的复制能力得出的Gag-MJ4嵌合病毒。转染到293T细胞中是直接的和病毒的回收率只需要三天。 体外复制能力的测定在由布罗克曼等人创建的相同的CEM-CCR5的基于T细胞系37中 ，除了使用所必需的成功复制重要协议的修改的C亚型MJ4嵌合病毒。使用合适的T细胞系，而不是外周血单个核细胞的允许大量的C亚型MJ4-嵌合病毒对以高测定再现性测试。最后，使用放射性标记的逆转录酶测定法对病毒的上清液中定量更具成本比使用市售的p24 ELISA试剂盒有效。这也给了一个更高的动态范围，这是用于检测相同的检测中均不佳，高病毒复制和用于检测菌株之间的细微差别复制很重要。
总之，这里提出的方法允许对从HIV-1 C亚型来源的插科打诨序列的复制能力的深入研究急性赞比亚感染者，并作为书面，也可以扩展到其他学习C亚型病毒感染的人群。观察高度变异在不同的Gag菌株之间的复制能力。此外，我们能够显示发送加格的复制能力和设定点的病毒载量的CD4 +下降之间以及与统计协会在3年的时间39。这样的结果凸显学习如何传播的病毒特征，比如复制能力的重要性，与宿主免疫系统在感染早期，影响发病机制相互作用，将整体开发有效的疫苗干预以及治疗。
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Protocol
1，扩增HIV-1的gag基因从受感染，冰冻血浆
- 提取病毒RNA从140微升使用提取试剂盒解冻的HIV-1感染的血浆。
- 如果可行后提取RNA作为解冻病毒RNA产生最佳的放大效果，立即进行cDNA合成。如果可能的话，建立的PCR master mix首轮DNA扩增和储存在4℃之前，病毒RNA提取。
- 从RNA反转录的cDNA，并使用逆转录酶，并在单步RT-PCR的热稳定DNA聚合酶扩增的第一轮的DNA产物。
- 取的RNA进行的-80℃下冷冻（如果冷冻是必要的），并简单地在室温下解冻，然后放置在冷块。转移5μl的RNA的含有45μl反应混合液每个PCR管中，得到的50微升的最终体积。立即将剩余的RNA样品到-80℃的冰箱中。
- 酶是经过dded到第一轮PCR主混合物（ 表1A），等份加入45μl到每个薄壁PCR扩增管用于所需反应的数量。请务必使用PCR管与个别上限，而不是剥夺上限，以确保样本之间的最小交叉污染。将PCR管在寒冷的块，以保护对温度敏感的逆转录酶和RNA模板。注：样品应一式三份，以充分品尝病毒准种运行。同样重要的是，利用具有高保真DNA聚合酶酶的产物，以减少PCR引入的错误掺入。请参考试剂列表中推荐的产品。
- 后的RNA模板被添加到所有的反应管，转移PCR管，以热循环器使用表1B中描述的循环仪程序扩增。注：本扩增的产品将在第二轮巢式PCR使用。
- 执行嵌套SECOND轮PCR扩增后，使用1μl的第一轮PCR扩增（1.2）作为DNA模板。
- 等分试样49微升二轮PCR主混合物（ 表2A）到每个薄壁PCR管中进行期望的反应的数量。传递来自第一轮PCR扩增到每个反应管加入1μl得到的50微升的最终体积。注意：这将作为模板DNA用于第二轮扩增。同样重要的是，利用DNA聚合酶具有很高的保真度和校对能力，以便最小化的PCR引入的错误掺入。请参考试剂列表中推荐的产品。
- 转让第二轮PCR反应混合物，以热循环和表2B描述运行程序。注意：该程序结束后，本反应的产物将在琼脂糖凝胶上运行，以确认生产产物。
- 添加3微升的5X样染料5＆＃181;微升50微升第二轮反应体积中，并在120伏上含有UV-DNA荧光染色在1％琼脂糖TAE凝胶上运行，直到带被解决。可视化在蓝色光照明1.6 kb的条带（ 见图1A）。
- 运行包含的DNA染色1％琼脂糖凝胶TAE，其余45μl反应，并切除适当的波段用干净的刀片。
- 从用凝胶纯化试剂盒凝胶切片中提取DNA，洗脱在无核酸酶的水，结合每个个体三个正反应，并且在-20℃下以供后续使用冷冻产品。
2，准备堵嘴扩增子的克隆通过必要的限购站点简介
- 扩增的长末端重复序列（LTR）的MJ4质粒/ 5'非编码区部分（ 见表3）。
- 可视化1.3 kb的PCR产物在照明，消费积极扩增，凝胶净化，冷冻如前上述（1.4,1.5， 见图1B）。
- 创建通过“剪接重叠延伸”稠MJ4 LTR- 的gag扩增PCR（ 见表4）。
- 可视化，消费税，净化，并冻结了3.2 kb的扩增子在1.4,1.5（参见图1C）。
3，克隆扩增GAG基因导入MJ4，C 亚型，感染性分子克隆
- 消化1.5微克MJ4质粒和1.5μg的纯化LTR- 的gag PCR产物与在50℃下（ 参见表5A）的BclI位（甲基化敏感）限制性内切酶进行1.5小时的。
- 加入1μlNgoMIV到消化反应并在37℃下反应1小时。
- 用于克隆添加5×上样染料，以限制酶消化反应而慢慢electrophorese上含有100伏形象化，附加的DNA凝胶染料1-2 hr的1％琼脂糖TAE凝胶的总体积，并纯化表示频带如先前降序进项税（参见图2）。
- 1插入到载体比例：用纯化LTR- 插科打诨插入和MJ4载体DNA在3准备连接反应。过夜孵育连接反应在4℃下（ 见表5B）。
- 转化JM109化学感受态细菌用连接产物并涂布在LB琼脂平板上以100微克/毫升氨苄青霉素和生长在30℃下为22 +小时。
- 解冻JM109在冰上感受态细胞15分钟。标注的1.5 ml离心管和冰浴。
- 等分50-100微升JM109细胞的预冷的1.5 ml离心管中。添加2.5-5微升连接反应到JM109细胞，轻弹管轻轻混合，并立即返回到冰。孵育感受态细胞用连接产物在冰上30分钟。
- 热休克含有JM109感受态细胞，并在45秒的42℃的热块的连接反应，并返回到冰上至少3分钟的1.5 ml离心管中。
- 加入50微升SOC培养基中，以每个微量离心管和板的整个转化反应到补充有氨苄青霉素的100微克/毫升室温的LB-琼脂平板上。
- 转板至30℃培养箱中培养，并留下了20小时，或直至菌落明显形成。
- 挑分离的菌落并生长在4毫升的LB与100微克/毫升氨苄青霉素，于30℃为22 +小时。
- 降速的文化，在3200×g离心15分钟，倒出汤汁，并提取质粒DNA。
- 为了证实克隆保真度，切带NgoMIV高致病性禽流感限制性内切酶小量DNA的双消化在37℃2小时。在1％琼脂糖TAE凝胶分析（ 见表5C）。
- 序列使用下面的引物每种质粒的LTR-GAG插入区域：GagInnerF1，GagF2，修订版1，Rev3型，和GagR6（ 表6），以确认序列同一性。
- 比较与人口序列DER获得克隆序列从最初的纯化的扩增子ived从1.5.1。注：以最终评估两个独立的克隆的复制能力，以确保任何体外复制的表型不是由于在克隆过程中引入主链的错误是很重要的。
四代复制能力的Gag-MJ4嵌合病毒和滴定
- 所描述的王子等人 39比1 FUGENE高清：通过转1.5微克的嵌合MJ4小量提取质粒DNA导入使用4 293T细胞产生复制能力的病毒。
- 下面记载在王子等人 39滴度收获病毒储存于TZM-BL细胞。
- 板TZM-BL细胞感染病毒前24小时，以便有翌日30-40％汇合单层细胞。这通常可以通过在24孔板中加入5×10 4个细胞，每孔800微升的总体积来实现。
- 加入细胞的井后，轻轻移动24孔板前进和后退，然后一边以有效地分配单元到另一边。从未漩涡 - 这将导致细胞积聚在板的中心。
- 翌日，在DMEM中制备1％FBS;这将用于稀释的DEAE-葡聚糖和稀释的病毒种群。股票DEAE葡聚糖是10毫克/毫升或125X，和80微克/毫升或1个是期望的终浓度。
- 取出病毒原液可以从-80℃冷冻并置于测试在摇床上以在室温下解冻。
- 使用多道移液器，连续稀释病毒储存在一个圆底组织培养处理96孔板盖。这是一个3倍的稀释方案。 见表7的稀释方案。
- 使用真空吸引器，确保不打扰单层细胞接种TZM-BL 24孔板取出介质。一次只能从一个24孔板中取出介质，使细胞做不能干。
- 在DMEM混合物中添加150μl的1倍的DEAE-葡聚糖+ 1％FBS的用1000微升吸管每孔中。不要重复使用吸管，因为这破坏了单层。
- 加入150μl每种病毒稀释至适当的井。添加病毒到孔的中心和漩涡轻轻跨细胞单层均匀分布的病毒。培养感染的细胞2小时在组织培养培养箱中于37℃和5％CO 2。
- 2小时温育后，在DMEM中加入0.5毫升10％FBS至每孔，并返回板到培养箱另外48小时。
- 48小时后，细胞应该是100％汇合。因为MJ4是具有复制能力的病毒，会有一些细胞死亡，但是这是可以预料的。
- 从各取出介质好，加入400微升/孔固定溶液（ 见表8A配方）。在固定的时间只有一个板块。添加使用1000微升吸管固定的解决方案，并让坐5分钟室温。
- 除去固定液，用PBS冲洗3次与钙 /镁离子 。使用喷瓶轻轻的PBS添加到井的一侧，以避免破坏单层。在第三次洗涤后，吸干板干上吸收纸。
- 加入400微升/孔的染色溶液（ 见表8B为配方）到24孔板的每个孔中，并在37℃下进行至少2小时。较长的孵育时间是可以接受的，但温育时间应保持滴定实验之间保持一致。
- 2个洗净，用PBS与钙 /镁离子和得分感染，或加PBS中，并储存在4℃下得分后。板可保持在4℃下进行长达四天，只要该单层保持水合。
- 得分感染，使用永久性标记来划分的24孔板的孔中插入象限。算上所有的蓝色细胞的视场范围内，使用200X的总放大倍率，曾经在每四个象限的阱。
- 计算每微升感染单位如下：[（＃蓝色细胞/ 4）×67] /（微升加病毒）=国际单位/微升。参考表8C为在微升病毒加入到各孔的体积。平均多口井在一起;这些数字应该是准确滴定比较相似。
5，准备文化传媒和GXR25细胞繁殖的体外复制检测
- 准备完全RPMI（cRPMI）为GXR25细胞的繁殖。注：这是文化GXR25细胞的复制计划实验至少4个月前极为重要的（ 见表9）。
- 分裂细胞1时10每周两次，并维持细胞密度细胞/ ml之间的1×10 5〜2×10 6。
6， 在加格-MJ4嵌合体的GXR25（CEM-CCR5-GFP）的体外复制细胞
- 在我以前的日子nfection，分裂细胞的浓度之间的2-3×10 5个细胞/ ml，使它们在对感染的天数增殖。
- 在感染当天，从-80删除病毒的股票℃的冰柜和解冻。计算从每个股票需要病毒的基础上从TZM-BL细胞测定中的国际单位/微升滴度的体积，以便感染5×10 5个GXR25细胞以0.05的感染复数，使用下式：
病毒量感染（微升）= 1μL/ X IU×0.05点¯x500000
注：我们选择0.05的教学语言，因为这会导致对数生长期为所有我们所测试的病毒。它，以便确定最佳的MOI捕获数增殖的病毒进行试验进行初步的实验是非常重要的。 - 稀释病毒cRPMI到100微升的体积（为了达到0.05 MOI），并添加到一个V形底组织培养的良好待遇96孔板。注：同时包括positi已经（MJ4 WT感染）和一负（模拟感染的细胞）控制每一组的复制实验。设置板，使得每隔一列是空白的，以限制孔之间的交叉污染。阳性对照是必要的，因为这将在后面为标准用于标准化复制的斜坡，这是实验重复的复制率的措施。
- 算使用自动细胞计数器GXR25细胞。计算需要的总的所有感染（5×10 5×＃感染）的细胞数。分装至所需体积到50ml锥形管中并离心以沉淀细胞。 25％以上的感染性总是需要计算。
- 小心吸媒体和重悬在cRPMI在5×10 5细胞/ 100微升的浓度。
- 吸取细胞进入无菌槽调匀。使用多道移液器，添加100μl的细胞进入96孔板包含经稀释的病毒的各孔中。弥点¯x彻底。
- 加入2微升的聚凝胺的5毫克/毫升（100倍）的溶液，以每孔中并彻底混合细胞。
- 孵育于37℃在组织培养箱中，用5％CO 2下3小时。
- 为了洗感染的细胞，离心分离96孔V型底板，以沉淀细胞。然后小心地取出150μl的培养基，并用新鲜的150微升cRPMI的更换而不干扰细胞沉淀。重复2次以上（包括离心分离），以充分地洗涤细胞。
- 最后的离心和加入150微升cRPMI后，重悬细胞沉淀用多道移液器，并从各孔中分别以800微升cRPMI在24孔组织的阱加上整个细胞/病毒混合物（约200微升）培养板。
- 地方板在5％CO 2的组织培养箱中于37℃。
- 每两天，从文化的表面除去100微升上清良好，转移到96孔U汉字板和存储冷冻在-80°C，直到运行病毒定量检测。注：在96孔板中的上清液仔细安排将允许培养物上清液中的病毒粒子的定量通过放射标记的逆转录酶（RT）下测定多通道移液器转移。每块板应包含以标准化的实时检测读数板间的变化，从感染的标准样品。
- 后取出，每100微升的样品，拆分单元格1：通过充分重悬细胞2和去除一半的剩余量（450微升）的。通过加入550微升新鲜cRPMI到每个孔中恢复原始体积（1ml）中。
逆转录酶的7分析（RT）在细胞培养上清液中
改编自奥斯特洛夫斯基等 40协议。
- 建立生物安全罩在BSL-3设施与放射性材料的使用。
- 发生在胡胡吸水纸为吸引研发和取代吸气指定的放射性使用。注：所有放射性废物必须按照安全规定妥善处置。
- 加1-2微升[α-33 P] dTTP的10毫居里/毫升和4微升的1M二硫苏糖醇（DTT）以每次1毫升一份RT主混合物（ 参见表10和的Ostrowski 等人 40）。
- 精心搭配RT预混液，DTT和[α-33 P] dTTP与每次1.5 ml离心管1000微升吸并转移到一个无菌的低谷。
- 分配25μl的标记RT的混合进96孔的薄壁PCR板各孔中。注：包括阳性对照（MJ4 WT感染）和阴性对照（模拟感染）的空间。
- 加入5μl的每种上清液含有该RT主混合物的PCR板。
- 密封PCR板用胶粘剂电化铝盖，并在热循环孵育2小时，在37℃。为安全起见，RINSE枪头与Amphyl与处置在小容器中含有的提示Amphyl浪费，这将在后面的放射性废物进行处置。
- 温育后，用200μl的多通道移液器使在箔覆盖的小孔。注意：如果枪头触及液体好，移动到下一列或行前更换提示。
- 混合样品的5倍，并转移5μl的各样品的DE-81上的纸张。空气干燥10分钟。
- 洗涤印迹5倍用1×SSC（氯化钠，柠檬酸钠），然后2倍与90％乙醇中，在每次洗涤5分钟。风干。
- 放置在一个单独的洗涤容器，每一个印迹，如夹层储物盒，补充足够的洗涤缓冲液（1×SSC或90％乙醇），以支付印迹，振摇5分钟。
- 倒掉洗涤缓冲液成单独的容器中，然后重复。注意：第3次洗涤被认为是放射性的，应妥善处理。最后2清洗液会定期处理。
- 一旦干燥，车efully包装印迹的保鲜膜，并暴露在phosphoscreen在一个密封的纸盒在室温下过夜。
- 分析phosphoscreens与phosphorimager和量化放射性成绩单。
- 周围绘制使用OptiQuant软件的每个放射性信号的圆。图中的数字光单元（DLU）值来生成复制曲线。
- 为了生成复制能力分数，DLU值分别记录10 -转化和使用第2天，第4和6的时间点，计算斜率。复制斜坡，然后由WT MJ4的斜率，以产生复制能力的分数分频。重要的是根据从同一RT板得到降低批内变异性的MJ4 WT值正常化。
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Representative Results
为了正确地执行该协议，该协议创建能够组装功能齐全的，传染性的Gag-MJ4嵌合体的前病毒质粒，伟大必须小心，以生成适当的PCR扩增子。确定PCR是否已经生成的适当大小的gag扩增子是关键的。产品应在图1A中所示的大约1700碱基对的扩增子的100个碱基对（bp）。这个片段的确切长度将取决于所研究的gag基因的不同而不同。接着，MJ4分子克隆的5'长末端重复序列（LTR）部分必须被放大，并接合到在gag的扩增子，以使其适合于随后的克隆。该MJ4 LTR扩增应该是1,474 bp的长度。 图1B显示了其正确的波段大小表示代表凝胶图像。后剪接重叠延伸PCR 41，结合LTR- 的gag产品应大约3200 bp的长度，如在图1C中示出。
一旦gag基因已适于克隆融合到5'端LTR从MJ4，其中包含必要的NgoMIV限制性位点，这两个矢量和gag刀片必须被消化的NgoMIV和BclⅠ限制酶和后电泳，从琼脂糖凝胶中切下分离。当务之急是要切除适当的载体和插入乐队。代表性的凝胶显示于图2。的MJ4质粒的载体部分的长度应大约10,000碱基对，而LTR- 的gag刀片应维持在约3000 bp的长度，作为限制位点位于其最外端扩增子。在任何尺寸减小显著会显示一个额外的切口部位所研究的gag基因内。
下面的两个片段连接，细菌改造，第二质粒DNA的分离，所述的Gag-MJ4嵌合体必须通过进行用NgoMIV和的HpaI限制性内切酶双重消化检查合适大小。全长的细菌复制过程中没有发生任何缺失事件应该有一个限制模式相似，在图3中所描绘的，具有大约8700和4300 bp的两条带的Gag-MJ4嵌合体。
该协议的一个重要的区别相比以前的方法，就是利用HIV-1 C亚型感染性分子克隆，MJ4，而不是更常见的实验室适应NL4-3病毒。然而，在上一节中所描述的方法可以被修改为克隆B亚型的gag序列的成pNL4-3。
为了选择显示出多数的测试病毒的对数生长提供了理想的MOI进行感染复数（MOI）的多重性为在随后的实验中使用的优化。图4示出了从三个不同的MOI（0.01，0.05和0.25），用于MJ4（ 图4A）代表复制的曲线，以及用于NL4.3（ 图4B）。 MJ4复制更有效地在GXR25细胞比NL4-3，这是很重要的考虑，因为的MOI适合NL4-3复制可能会太低，检测效率MJ4复制。正如图4A所示 ，为0.05，而不是0.01或0.25的MOI，是理想的选择，因为2-6天之间观察到的MJ4对数生长。对于较低的MOI，0.01，第6天DLU值是几乎检测不到，而我们预期中的Gag-MJ4嵌合病毒，比MJ4复制更低的产生。因此这个教学语言就不会捕获更多的减毒的Gag-MJ4嵌合体，这也可能是生物学上最严重的生长。此外，0.25的MOI并不理想，因为病毒复制的快速动力学杀死了大量的AMOU即使这4天的细胞NT导致复制曲线平台期，并基于曲线在一个斜坡上，如这有可能低估了复制能力。基于用于NL4-3生成，甚至以0.01的MOI曲线，可用细胞目标已明显由天感染后第6排出。总之，为0.05的MOI被认为是最适合的加格-MJ4嵌合病毒，它们都具有多样的Gag序列和不同程度的复制的大面板。
共有149急性C亚型Gag的序列得到的Gag-MJ4嵌合病毒已经过测试， 在体外用此法复制。归一化的RC值从0.01不等，以超过350的一些病毒更有效地复制超过100倍，比野生型MJ4， 图5示出了来自九个代表的Gag-MJ4嵌合病毒的复制曲线，与野生型MJ4在红色中所示，并展示了多种复制的capacities观察。因此，单独的gag基因内的序列多样性可以大大影响病毒的体外复制的能力。虽然这是有代表性的，从急性感染赞比亚衍生的Gag-MJ4嵌合病毒，其它C亚型序列还没有被广泛的测试，并且可以表现出不同的复制动力学。因此，极大必须小心，以优化惯性矩，以适应特定的研究的病毒的特异性复制，因为可以有各种各样不同的HIV-1的骨架和Gag的分离之间的复制水平。
一种使用T-细胞系，如GXR25细胞系，它支持MJ4的复制的优点，是可再现性水平观察到的相对于使用刺激的外周血单个核细胞作为靶复制实验。在最初的优化实验，MJ4野生型表现出8.7％的批内变异，各色和NT克隆相同的Gag-MJ4嵌合病毒表现出变异的8.5％复制。由于不同的主混音和phosphoscreen风险可能会在大小略有不同的DLU值，批内变异可以进一步通过运行同一种病毒的标准（在我们的案例中野生型MJ4）在每个RT检测板进行控制。 图6的曲线图DLU值是来自于同一MJ4感染，量化在八个不同的RT平板。归到的病毒是共同的所有RT测定可以有助于减轻诱导的测定法之间的信号幅度这些细微的变化的潜在错误。
批间可变还测试和重复重复在不同的日子有高度相关性。 图7图从执行大约相隔一年两个独立的实验归一化的RC分值。观察高度相关性与缺乏重大异常值（R = 0.873）比较（％）EEN两个独立的重复。
虽然高度相关，有在两个独立实验之间的复制动力学的整体大小的一些变化。这可部分归因于在每个实验中所使用的GXR25细胞种群之间的传代数差。在一般情况下，已传代的一段时间大于6个月以上GXR25细胞种群倾向于支持的Gag-MJ4嵌合体更有效的复制。因此，最好是评估嵌合体的一个月的时间框架内组中的复制能力。当遵循上述步骤紧密结合，该测定法能够产生非常健壮和可重复的结果，这也适用于范围广泛的研究。
图1：典型的凝胶IMAGES描绘的PCR产物的电泳分离。对于所有的PCR产物，将5μl各50μl的反应，用3微升的5×上样染料混合，装入1％琼脂糖TAE凝胶补充有1X SYBR安全DNA凝胶染色，并通过电泳在120伏45分钟分离。 Promega公司1 kb的DNA阶梯（1道）来近似扩增子大小A）gag基因从病毒RNA用巢式PCR的方法扩增。由于插入和删除， 插科打诨扩增可从1,600-1,700 bp的变化及以上的1500 bp的DNA条带标记稍微出现。泳道2-5描绘了成功的gag基因扩增。 乙）MJ4的5'端LTR从野生型MJ4的质粒扩增，并通过电泳分离可视化。泳道2-5描绘了1,474 bp的LTR的产品，这似乎稍低于1,500 bp的DNA条带标记。 三）5R成功扩增17; LTR是来自于野生型MJ4和gag基因从患者血浆扩增是通过剪接重叠延伸PCR融合在一起，并通过电泳分离可视化。泳道2-5描绘成功融合的扩增子的面积约为3200个基点，而这似乎略高于3,000 bp的DNA条带标记。
限制的图2代表凝胶图像描绘电泳分离消化克隆患者的gag基因导入MJ4。野生型MJ4质粒和LTR- 的gag融合产物，在37℃消化的BclⅠ1.5小时，在50℃和NgoMIV 1小时C。载体和插入片段经电泳分离在1％琼脂糖凝胶TAE补充1X SYBR安全的DNA克可视化EL染色在100伏2小时，以减少紫外线引起的DNA损伤采用蓝光照明。适用于随后的克隆步骤的载体和插入片段出现在大约10,000个基点，并分别2,900个基点。
图3代表凝胶图像描绘的纯化的Gag-MJ4嵌合体的质粒DNA的限制性消化的电泳分离。纯化的Gag-MJ4嵌合体的质粒DNA双重消化用NgoMIV和的HpaI限制性内切酶处理2小时，在37℃。限制性消化是通过电泳分离在1％琼脂糖凝胶TAE补充1X SYBR安全DNA琼脂糖凝胶染色，在120伏45分钟可视化。质粒没有大的缺失将解析为两个不同的频段大约8700和4300个基点。
图4复制MJ4和NL4-3中在感染的不同多重性的GXR25细胞系（MOI），分离的HIV-1。如在方法中描述的协议以5倍的增加的MOI为5×10 5 GXR25细胞感染每种病毒的股票。收集上清液，于天2，4，6和8感染后和病毒粒子的生产是通过放射性标记的逆转录酶测定法进行定量。感染已运行一式三份及误差棒表示为三次重复的标准偏差（A）MJ4（B）NL4-3。
图针对不同的Gag-MJ4嵌合体的复制代表性的范围内。 5个GXR25细胞以0.05的MOI感染了野生型MJ4或加格-MJ4嵌合体，收集上清液，两个天间隔感染后，与病毒体产生定量的放射性标记的实时检测。各种C亚型来源GAG基因的插入会对MJ4的复制能力产生重大影响。野生型MJ4复制用红色表示。
通过从单个的野生型MJ4感染在八个不同RT测定绘制同一上清液的DLU值批内变异的放射性标记的反转录酶（RT）的定量测定。图6的比较的曲线图描绘了固有的批内变异板。在曲线的变化反映了信号幅度下注的细微变化吐温板，其可以用于通过运行在每个RT板，其可随后用于标准化的测定在同一平板上的Gag-MJ4嵌合体的斜坡标准进行校正。
图7再现性随着时间的推移，在GXR25细胞系中的复制测定法，同样的Gag-MJ4嵌合病毒用于感染GXR25细胞在两个独立实验进行约一年分开。通过计算对数变换的DLU值的斜率和正火的斜率与野生型MJ4生成复制分数。的gag-MJ4嵌合体的复制效率比野生型MJ4具有复制分数大于1，以及那些复制较少效率比野生型MJ4具有复制的分数小于1，两个独立的测量是强相关（R 2 = 0.87，线性回归），并突出显示在不同的时间，并与细胞在不同的通道进行的测定的可重复性。
一）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） |
| 2X反应混合液（Invitrogen公司） | 25 |
| 无核酸酶H 2 O的 | 17 |
| 正向引物GOF（20微米浓度） | 1 |
| 反向引物VifOR（20微米浓度） | 1 |
| 的Superscript III一步法酶混合物 | 1 |
| RNA模板 | 5 |
| 总成交量 | 50 |
B）
| 周期数 | 时间（小时：分钟：秒） | 温度（℃） |
| 1 | 1:00:00 | 50 |
| 1 | 2:00 | 94 |
| 10 | 0:15 | 94 |
| 0点30分 | 56 | |
| 5:00 | 68 | |
| 40 | 0:15 | 94 |
| 0:30 | 56 | |
| 5:00 +5秒/循环 | 68 | |
| 1 | 12:00 | 68 |
| 1 | ∞ | 4 |
| 结束 |
表1。）主混音和B） 插科打诨放大。 *注：GOF引物序列：5'-ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA-3'。 VifOR引物序列：5'-TTCTACGGAGACTCCATGACCC-3'。
一）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） |
| 无核酸酶H 2 O的 | 35.5 |
| 5倍的Phusion HF缓冲液 | 10 |
| 的dNTP（40 mM的脱氧核苷酸） | 1 |
| 正向引物GagInnerF1（20微米浓度） | 1 |
| 反向引物BclIDegRev2（20微米浓度） | 1 |
| 的Phusion热启动II聚合酶 | 0.5 |
| 第一轮PCR的模板 | 1 |
| 总成交量 | 50 |
B）
| 周期数 | 时间（小时：分钟：秒） | 温度（℃） |
| 1 | 0:30 | 98 |
| 29 | 0:10 | 98 |
| 0:30 | 53 | |
| 1:00 | 72 | |
| 1 | 10:00 | 72 |
| 1 | ∞ | 4 |
| 结束 |
表2中）预混液和B）热循环条件嵌套第二轮插科打诨放大。 * NOTE：GagInnerF1引物序列：5'-AGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3'。 BclIDegRev2引物序列：5'-AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR-3'。
一）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） |
| 无核酸酶H 2 O的 | 35.5 |
| 5倍的Phusion HF缓冲液 | 10 |
| 的dNTP（40 mM的脱氧核苷酸） | 1 |
| 正向引物MJ4For1b（20微米浓度） | 1 |
| 反向引物MJ4Rev（20微米浓度） | 1 |
| 的Phusion热启动II聚合酶 | 0.5 |
| MJ4质粒为模板（10纳克/微升） | 1 |
| 总成交量 | 50 |
B）
| 周期数 | 时间（小时：分钟：秒） | 温度（℃） |
| 1 | 0:30 | 98 |
| 29 | 0:10 | 98 |
| 0:30 | 58 | |
| 0:45 | 72 | |
| 1 | 10:00 | 72 |
| 1 | ∞ | 4 |
| 结束 |
表3。）主混音和B）热循环条件5“MJ4 LTR放大。 *注：MJ4For1b引物序列：5'-CGAAATCGGCAAAATCCC-3'。 MJ4Rev引物序列：5'-CCCATCTCTCTCCTTCTAGC-3'。
一）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） |
| 无核酸酶H 2 O的 | 34.5 |
| 5倍的Phusion HF缓冲液 | 10 |
| 的dNTP（40 mM的脱氧核苷酸） | 1 |
| 正向引物MJ4For1b（20微米浓度） | 1 |
| 反向引物BclIRev（20微米浓度） | 1 |
| MJ4 LTR 1.3 kb的扩增（凝胶纯化，〜50毫微克） | 1 |
| 的Phusion热启动II聚合酶 | 0.5 |
| Gag的扩增子（凝胶纯化，〜100纳克） | 1 |
| 总成交量 | 50 |
B）
| 周期数 | 时间（小时：分钟：秒） | 温度（℃） |
| 1 | 0:30 | 98 |
| 29 | 0:10 | 98 |
| 0:30 | 58 | |
| 1:30 | 72 | |
| 1 | 10:00 | 72 |
| 1 | ∞ | 4 |
| 结束 |
表4中）预混液和B）热循环条件拼接重叠延伸PCR产生LTR- 插科打诨插入。 *注：BclIRev引物序列：5'-TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT-3'
一）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） | 孵化时间（小时） | 孵化温度（°C） |
| 1.5 3 KB LTR- 插科打诨的扩增或 MJ4质粒微克 | 点¯x微升1.5微克 | ||
| NEB CutSmart缓冲区（以前NEB缓冲＃4） | 2 | ||
| BclⅠ限制酶 | 1 | ||
| 无核酸酶H 2 O的 | 点¯x | ||
| 总成交量 | 19 | 1.5 | 50 |
| NgoMIV限制性内切酶 | 1 | ||
| 总成交量 | 20 | 1 | 37 |
B）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） | 孵化时间（小时） | 孵化温度（°C） |
| 50纳克切MJ4质粒载体 | 点¯x微升50纳克 | ||
| 45纳克切LTR- GAG插入（3:1比例） | 点¯x微升45纳克 | ||
| 罗氏10X连接酶缓冲液 | 2 | ||
| 罗氏T4 DNA连接酶（5 U /μL） | 1 | ||
| 无核酸酶H 2 O的 | |||
| 总成交量 | 20 | 18岁以上（过夜） | 4 |
C）
| 试剂 | 在1X反应体积（微升） | 孵化时间（小时） | 孵化温度（°C） |
| 450纳克的Gag-MJ4质粒 | 点¯x微升为450纳克 | ||
| NEB CutSmart缓冲区（以前NEB缓冲＃4） | 2 | ||
| NgoMIV限制性内切酶 | 0.5 | ||
| 的HpaI限制性内切酶 | 0.5 | ||
| 无核酸酶H 2 O的 | 点¯x | ||
| 总成交量 | 20 | 2 | 37 |
表5。）限制性酶切预混液和B），用于生成的Gag-MJ4嵌合前病毒。 三）诊断酶切，以确保加格-MJ4克隆保真连接反应。
| 底漆名称 | 核苷酸序列（5' - 3'） |
| GagInnerF1 | AGGCTAGAAGGAGAGAGATG |
| GagF2 | GGGACATCAAGCAGCCAT |
| For3 | CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG |
| GagR6 | CTGTATCATCTGCTCCTG |
| REV3 | GACAGGGCTATACATTCTTACTAT |
| 修订版1 | AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA |
表6列出了需要确认的Gag-MJ4嵌合前病毒5'端LTR和gag序列同源序列的引物。
| A井 | 在DMEM 8微升病毒+ 232微升1％胎牛血清 |
| B井 | 从井A + 160微升1％胎牛血清的DMEM 80微升 |
| C井 | 井B + 160微升1％胎牛血清的DMEM 80微升 |
| D井 | 井C + 160微升1％胎牛血清的DMEM 80微升 |
| E井中 | 井D + 160微升1％胎牛血清的DMEM 80微升 |
| 以及˚F | 井E + 160微升1％胎牛血清的DMEM 80微升 |
表7稀释方案（3倍），对TZM-BL细胞滴定感染病毒。
一）
| 试剂 | 成交量 |
| PBS无钙或镁离子 | 500毫升 |
| 戊二醛 | 4毫升 |
| 甲醛 | 11毫升 |
*注：储存在4℃。
B）
| 试剂 | 成交量 |
| PBS无钙或镁离子 | 4.75毫升 |
| 铁氰化钾（0.2M） | 100微升 |
| 亚铁氰化钾（0.2M） | 100微升 |
| 氯化镁（1μM） | 20微升 |
| 型X-Gal（50毫克/毫升） | 40微升 |
*注：请清新的光分开存放备用。
C。
| 原来稀释好 | á | 乙 | ç | ð | Ë | ˚F |
| 病毒（微升）的量加入到24孔板行的孔中 | 5 | 1.6667 | 0.5556 | 0.1852 | 0.06173 | 0.02057 |
表8。） B）固定解决方案，对TZM-BL指示细胞系，C）的病毒，每孔加入计算传染性单位/μL的体积的Gag-MJ4嵌合病毒滴定。
| 试剂 | 成交量 |
| 胎牛血清（FBS），其定义 | 55毫升 |
| 青霉素，链霉素，谷氨酰胺（100×） | 6毫升 |
| HEPES缓冲液（1 M） | 6毫升 |
表9的配方完全RPMI培养基GXR25细胞的繁殖。
| 试剂 | 体积（ml） |
| 核酸-free H 2 O的 | 419.5 |
| 三 - 氯，pH值7.8（1μM） | 30 |
| 氯化钾（1μM） | 37.5 |
| 氯化镁（1μM） | 2.5 |
| 诺乃洗涤剂P-40（10％） | 5 |
| EDTA（0.5M） | 1.02 |
| 多腺苷酸，钾盐（2毫克/毫升） | 1.25 |
| 寡脱氧胸苷酸引物（25微克/毫升） | 3.25 |
| 总成交量 | 500 |
表10食谱放射性逆转录酶检测预混液。 *注：存储为1毫升分装在-20℃。
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Discussion
由于长度和这个协议的技术性质，有几个步骤，这对嵌合的Gag-MJ4质粒均构建成功以及对病毒复制的能力的定量的关键。虽然限制性内切酶克隆的策略引进国外GAG基因导入MJ4本协议所列拥有超过以前使用重组为基础的方法具有许多优点，该协议可以是技术上的挑战，如果不采取关键步骤精确。
首先，这是绝对必要的使用已在主管菌株缺乏DCM和大坝的DNA甲基化酶生成MJ4质粒DNA。这是必要的，因为BclⅠ限制核酸内切酶，它是用于克隆的gag基因导入MJ4骨干的酶活性，是水坝/ DCM甲基化敏感性。该JM110和SCS110（一恩达负JM110衍生物） 大肠杆菌大肠杆菌菌株重新适于产生非甲基化MJ4质粒DNA。此外，对于载体和插入带的切除，强烈建议在蓝光照射可用于可视化。这将减少紫外线波长依赖性的DNA损伤，并大幅度提高克隆效率。如果蓝光照明不可用，克隆效率可以通过可视化的DNA以SYBR Safe DNA琼脂糖凝胶染色代替溴化乙锭，并尽量减少紫外线照射的时间最大化。
最后，分子克隆与大（> 10kb的）和/或反转录病毒质粒，如MJ4历来是困难的原因有多种。大质粒减少的主管细菌菌株42变换效率，同时逆转录病毒插入，其包含长末端重复序列（LTR）序列，减少了质粒DNA的细菌宿主导致逆转录病毒基因组43的缺失中的质粒和妥协的复制保真度的稳定性大肠杆菌时MJ4质粒的复制是更稳定的大肠杆菌菌株在DH5α菌株，在我们的手中。由于该质粒的不稳定性质，纯化的质粒制品应始终检查用于通过限制性内切酶消化正确质粒的大小;这里，用NgoMIV和的HpaI限制性内切酶双重消化在37℃下搅拌2小时。
一旦成功产生嵌合的Gag-MJ4的质粒已经完成，病毒经由2转染产生的93T细胞，滴定上的指示细胞系，TZM-BL细胞和复制能力是使用CEM-基于T细胞系进行测量。用于这些重复研究的CEM基GXR25细胞系是能够支持对HIV-1的CCR5嗜菌条目和复制的数建立的T细胞系中的一个。这已经实现了通过逆转录病毒转导，以允许人CCR5 37的稳定表达。该细胞系天然表达CXCR4和支持CXCR4-嗜性HIV-1中，复制诸如实验室适应株NL4-3。然而，为了支持CCR5嗜菌有效的复制，如MJ4的GXR25细胞必须传播为不少于4个月前感染。正确的传代培养甚至可以传代长达1年后支持复制。仔细监测CCR5嗜复制整个传代是成功的实验是必不可少的。
正如任何技术，也有局限性亲母育酚是必须考虑的。由于在MJ4质粒的限制性位点的位置，以及保守的限制性位点的天然存在的HIV-1分离物的可用性，在3'末端的限制性位点，BclI位，位于从在gag终止密码子的137个核苷酸。虽然这会产生一种嵌合蛋白酶基因，这一地区是96.5％，保守这个世代，我们没有观察到死亡或有缺陷的嵌合病毒丰盈。
一种使用具有C亚型的序列的MJ4 C亚型感染性分子克隆的一个优点是，它降低了的gag基因和不同亚型的骨干矢量之间不理想的基因配对的风险。然而，存在一定量的范围内，分支的多样性，即使同一亚型31内发现就证明了HIV-1的序列聚类国家或地区。这可能会导致不理想的配对之间的插科打诨基因明镜从急性感染赞比亚和MJ4感染的分子克隆骨干，这是来源于慢性感染的个体从博茨瓦纳38 ived。不过，大多数分析的结构所产生的感染性子代病毒。由于不同的HIV-1 C亚型感染性分子克隆的越来越广泛，通过克隆这些HIV-1的分支çGAG基因植入其他骨干网，以确保有介绍，由于最小的偏见，以进一步验证这一系统将是重要的骨干不兼容。
该GXR25细胞系是一种独特的细胞系，特别是由于其同时支持CXCR4和CCR5的嗜菌和其HIV-1诱导的GFP报告37的能力。然而，一些限制存在，应该使用这种细胞系改编自该协议实验前要慎重考虑。该GXR25细胞系似乎并不支持多数亚型C或A，CCR5嗜，公关入境imary隔离，我们已经测试了。比Jurkat细胞44此外，父CEM细胞系从该GXR25细胞系衍生出高层次亲环素A的，高达2至4倍的表达。由于高水平的亲环素A的，复制缺陷通常与经典的HLA-B * 57相关联的逃逸突变，T242N，这归因于病毒衣壳的能力下降结合亲环素A相关联，不能很容易地在这个特定的细胞系检测25。因此CEM基GXR25细胞系是不理想的学习用的HIV-1衣壳亲环蛋白结合环的突变相关联的复制缺陷。
最后，尽管该协议是理想的，用于分析从急性时间点导出的gag序列的复制能力，必须修改，以研究作呕基因从慢性感染的个体衍生的复制能力进行。该协议涉及到凌晨急性时点人口序列plification（中间值45，天后估计感染的日期为准），当病毒的多样性是有限的。从各嵌合体的gag基因的测序和比较，初始种群的PCR扩增子，以确保克隆的保真度。由于在急性时间点有限的序列多样性，从人口PCR产物克隆是可能的。然而，序列多样性存在慢性感染者的病毒准种之内;因此，为了准确地评估慢性准种的复制能力，单基因组扩增，必须采用以捕获几个有代表性的变体。然后每个这些变体，必须测定其在体外复制。
这种技术具有一些更广泛的应用，其优点与现有方法相比其茎。由于这个过程导致了克隆复制能力的载体，它使用简单的结构，以获得更多米utagenesis研究，这可以帮助阐明特定残基的病毒复制的贡献。此外，通过从纵向时间点的gag基因的克隆，人们可以评估的病毒复制的能力的随时间的演进，以及这些变化可能影响发病机制中的HIV-1感染的个体。
该技术可以以扩大其效用为不同的应用进行修改。额外的HIV-1病毒蛋白可被改造成MJ4的质粒，以评估对病毒复制或它们与宿主蛋白相互作用的影响。这可通过引入沉默核苷酸变化中的基因组工程的其他限制位点在所需区域来完成。然而，特殊的考虑，必须工程新的限制性位点引入尽可能多的辅助蛋白进行编码候补阅读框的HIV-1基因组的3'一半，并且在一个无声的变化时，应考虑蛋白可能导致在另一氨基酸取代。在该实例中，限制位点独立克隆的方法，例如那些由达德利等人讨论。45可以克服这种限制。来自不同种群衍生的病毒序列可以具有不同的复制能力范围内，与教学语言可以相应地，为了在其对数生长期的相位捕获大部分病毒分离株的调整。最后，GXR25细胞系已经稳定转染了下一个LTR驱动的，达诱导型启动子的GFP和病毒传播可以被测量为GFP阳性细胞通过流式细胞仪37的功能如这里的或描述的替代RT测定传统的ELISA检测P24。
总之，该协议提供了一种有效和强大的技术用于评估作为赋予由gag基因，其编码的保守结构蛋白所必需的合适的病毒粒子的形成的HIV-1病毒的复制，萌芽，成熟和拆卸46-48。此外，这种技术产生具有复制能力的克隆的质粒，这是理想的诱变研究，因此，提供了一种方法，阐明病毒的适用性的特定氨基酸的决定因素。研究，如这些都必须以提高免疫驱动的病毒进化如何影响发病和疾病进展中的HIV-1感染个体的理解。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Reagents | |||
| GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25 nmol, standard desalt |
| CoolRack PCR 96 XT | Biocision | BCS-529 | |
| CoolRack M15 | Biocision | BCS-125 | |
| Nuclease free water | Fisher | SH30538FS | Manufactured by Hyclone |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
| Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap) | Daigger | EF3647BX | |
| SuperScript III one-step RT-PCR system | Life Technologies/Invitrogen | 12574035 | |
| Phusion Hot-start II DNA polymerase | Fisher | F-549L | |
| PCR Nucleotide Mix | Roche | 4638956001 | |
| Agarose, high gel strength | Fisher | 50-213-128 | |
| TAE 10X | Life Technologies/Invitrogen | AM9869 | |
| Promega 1 kb DNA ladder | Fisher | PRG5711 | Manufactured by Promega |
| Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x | Life Technologies/Invitrogen | S33102 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Razor blades, single-edged | Fisher | 12-640 | Manufactured by Surgical Design |
| Thermocycler, PTC-200 | MJ Research | ||
| Microbiology & Cloning Reagents | |||
| LB Agar, Miller | Fisher | BP1425-2 | |
| LB Broth, Lennox | Fisher | BP1427-2 | |
| Sterile 100 x 15 mm polystyrene Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| Falcon 14 ml Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| NgoMIV restriction endonuclease | New England BioLabs | R0564L | |
| BclI restriction endonuclease | New England BioLabs | R0160L | |
| HpaI restriction endonuclease | New England BioLabs | R0105L | |
| T4 DNA Ligase, 5 U/μl | Roche | 10799009001 | |
| JM109 competent cells, >108 cfu/μg | Promega | L2001 | |
| PureYield plasmid miniprep system | Promega | A1222 | |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Amphyl cleaner/disinfectant | Fisher | 22-030-394 | |
| Fugene HD, 1 ml | VWR | PAE2311 | Manufactured by Promega |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| Costar Plates, 6-well, flat | Fisher | 07-200-83 | Manufactured by Corning Life |
| Costar Plates, 24-well, flat | Fisher | 07-200-84 | Manufactured by Corning Life |
| Costar Plates, 96-well, round | Fisher | 07-200-95 | Manufactured by Corning Life |
| Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2 | Fisher | 10-126-37 | |
| Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2 | Fisher | 10-126-34 | Manufactured by Corning Life |
| Conical Tubes, 50 ml, blue cap | Fisher | 14-432-22 | Manufactured by BD Biosciences |
| Conical Tubes, 15 ml, blue cap | Fisher | 14-959-70C | Manufactured by BD Biosciences |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CI | Manufactured by Mediatech |
| RPMI, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11875-119 | |
| DMEM, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11965-118 | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100x | Life Technologies/Invitrogen | 10378-016 | |
| PBS with magnesium and calcium, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 14040-133 | |
| PBS without magnesium and calcium | Life Technologies/Invitrogen | 20012-050 | |
| Sarstedt tubes, assorted colors | Sarstedt | 72.694.996 | |
| Reservoir Trays for Multichannel, 55 ml | Fisher | 13-681-501 | |
| DEAE-Dextran | Fisher | NC9691007 | |
| Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate | Fisher | 07-200-96 | Manufactured by Corning Life |
| HEPES, 1 M Buffer Solution | Life Technologies/Invitrogen | 15630-080 | |
| FBS, Defined, 500 ml | Fisher | SH30070 03 | |
| X-gal | VWR | PAV3941 | Manufactured by Promega |
| Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| 1 M Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5% | Sigma-Aldrich | F8775-500ML | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387-100G | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | P8131-100G | |
| Allegra X15-R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 1450001 | |
| VistaVision inverted microscope | VWR | ||
| Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents | |||
| dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi | Perkin-Elmer | NEG605H001MC | |
| 1 M Tris-Cl, pH 8.0 | Life Technologies/Invitrogen | 15568025 | Must be adjusted to pH 7.8 with KOH |
| 2 M Potassium chloride (KCl) | Life Technologies/Invitrogen | AM9640G | Adjust to 1 M solution |
| 0.5 M EDTA | Life Technologies/Invitrogen | 15575-020 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11333941103 | |
| Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt | Midland Reagent Co. | P-3001 | |
| Oligo d(T) primer | Life Technologies/Invitrogen | 18418-012 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815-1G | |
| SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small | Perkin-Elmer | 7001485 | |
| Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) Polycarbonate | Fisher | 07-200-245 | Manufactured by Corning Life |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Fisher | 07-200-684 | Manufactured by Corning Life |
| DE-81 anion exchange paper | Whatman | 3658-915 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-1KG | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FB-CA-810 | |
| Cyclone storage phoshpor screen | Packard | ||
References
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