Summary
Manuskriptet beskriver de nødvendige trin for at udføre den heterotopisk hjerte transplantation i mus.
Abstract
Det er nu over fyrre år siden, denne teknik først blev rapporteret af Corry, Wynn og Russell. Selv om det tog nogle år, før andre laboratorier til at blive dygtige i og udnytte denne teknik, er det nu almindeligt anvendt af mange laboratorier rundt omkring i verden. En betydelig raffinement til den oprindelige teknik blev udviklet og rapporteret i 2001 af Niimi. Beskrevet her er de teknikker, der har udviklet sig over mere end et årti i hænderne på tre kirurger (Plenter, Grazia, Pietra) i vores center. Disse teknikker bliver nu videre til en yngre generation af kirurger og forskere.
Høj grad baseret på Niimi erfaringer har de anvendte fremgangsmåder udviklet sig i de fine detaljer - detaljer, som vi vil forsøge at relatere her på en sådan måde, at andre kan være i stand til at bruge denne meget nyttig model. Ligesom Niimi, har vi fundet, at en video støtte til læring er en uvurderlig ressource for begynderen.
Introduction
I en tid hvor det er muligt at udføre nyre, lunge, lever og bugspytkirtel transplantation i mus, er hjørnestenen i grundlæggende organtransplantation og immunologi forskning siden 1973 1-4 forbliver den heterotopisk hjerte transplantation model i mus. I de mellemliggende år flere papirer er blevet offentliggjort detaljer forbedringer / justeringer 5,6 til denne procedure.
Som en model af fast organ primært vaskulariseret transplantation denne procedure er second to none. Når mestrer denne procedure egner sig til forskning i allogene afstødningsreaktioner 7, udvikling af kroniske vaskulopatier 8 og mekanismerne i iskæmi reperfusionsskade 9.
Nøglerne til succes lære denne procedure er ligesom enhver anden operation, tålmodighed på den del af instruktør og praktikanten og opmærksomhed på detaljer. Ved begyndelsen af processen den nye kirurg vil finde, at they vil tilbringe mange timer på hver transplantation. Da der indhøstes erfaringer, vil kirurgiske tider, og derfor iskæmi, drastisk at reducere. Opmærksom på detaljerne i hvert skridt, vil før eller senere føre til succes.
Mens instruktøren kan gøre deres bedste for at videregive, og at forudse alle de mulige faldgruber, der kan opstå i løbet af disse operationer, vil den "kreative" praktikant sandsynligvis finde nogle af deres egne!
Det grundlæggende i den procedure, der er som følger. Donoren alfabetisk aortabuen er ende-til-side anastomeres modtageren abdominale aorta og donorens lungepulsåren er ende-til-side anastomeres modtageren abdominal inferior vena cava (IVC). Blod strømmer fra modtageren aorta i retrograd måde gennem donor aorta til kranspulsårerne. Når blodet er strømmet gennem det koronare system er det dræner ind i højre atrium via koronar sinus, pumpes ind i den højre ventrikel ogderefter via lungepulsåren i recipienten IVC. På denne måde koronar Systemet leveres arterielt blod og sinusrytme tilbage til transplantat under 1-2 min reperfusion. Da det venstre kamre i hjertet er i det væsentlige pres under-loaded den venstre ventrikel fri væg vil atrofi over tid.
Protocol
Alle dyr blev opstaldet under patogenfrie forhold på University of Colorado Barbara Davis center Animal Facility under IACUC godkendelse og plejes i henhold til NIH retningslinier.
Anæstesidybden er bedømt af tå knivspids i første omgang og ved overholdelse af respirationsraten når proceduren er begyndt.
1.. Donorhjerte Harvest
- Bedøver donor mus ved injektion af pentobarbital (60 mg / kg IP).
- Immobilisere musen ved 4-vejs begrænsninger og klip pelsen. Tør hud med alkohol.
- Efter at dissekere væk huden, åbne bughulen ved at lave et tværgående snit bare ringere mellemgulvet.
- Skær mellemgulvet posteriort for kystnære indsættelse og løfte den forreste brystvæg fortil og overlegent udsætter hjertet.
- Udvid en fuld tykkelse skåret op den bageste laterale brysthulen på venstre og højre side af brystet.
- Isolerinferior vena cava (IVC), og placere en løs 5-0 silkesutur omkring IVC støder op til dens indføring i det højre atrium.
- Injicer 1,0 cc 4 ° C hepariniseret saltvand (200 u / cc) i IVC derefter ligere beholderen med 5-0 silkesutur og kløft.
- Isoler højre vena cava superior (rSVC) på lignende måde og liger med 5-0 silke sutur og kløft.
- Rul forsigtigt hjerte mod dyrene højrekant og isolere den venstre vena cava superior (lSVC), liger med en 5-0 silkesutur og dividerer udsætte venstre lungepulsåren.
- Fastgør hjertet under en våd gaze mens thymus er sløv dissekeres væk fra de vigtigste lungepulsåren (PA), og venstre og højre PA grene og opstigende aortabuen.
- Stumpt dissekere aortabuen fri af omgivende væv. Micro-saks bruges til at opdele aorta proksimalt til højre brachiale-cephalic arterie, dvs der skal være nogen grene mellem hjertet og divisionpunkt i aorta.
- Dette afsnit af aortabuen danner arteriel manchet implantatet processen.
- Afspejler aorta manchet inferiorly at blotlægge PA stammen og venstre og højre grene af PA.
- Blunt dissekere venstre og højre PA grene væk fra de omgivende væv, som langt fra hjertet som muligt. Dette giver mulighed for nem dissektion af PA stammen fra omgivende væv.
- Opdel PA stammen som distalt som muligt, bare proksimalt til dets tvedeling. Dette afsnit af lungepulsåren danner venøs manchet implantatet processen.
- Placer en 5-0 silke sutur rundt i bunden af hjertet og slips. Hjertet skæres derefter fri forneden, og anbringes i 4 ° C saltvand. Samlet høst tid er ca. 10-15 min.
2.. Heart Implantat Teknik
- Bedøver de recipientmus med pentobarbital (60 mg / kg IP initialdosis, 25 mg / kg IP supplerende dosis hvis påkrævet).
- Klip pelsen ogimmobilisere musen ved 4-vejs begrænsninger, og prep huden med povidon-jod og drapering i en steril måde.
- Lav en 2 cm midterlinjen lodret abdominal incision og indtast bughulen.
- Træk tarmen overlegent og eksternaliseres på brystet. Hold pakket i steril fugtig gaze (sterilt saltvand) i hele sagen.
- Isoler den abdominale aorta og vena cava inferior (IVC) under de renale skibe og placere 4-0 bomuld bånd rundt om aorta og IVC overlegen derefter ringere end anastomosis site.
- Identificere eventuelle lænde fartøjer inden for området og liger med 10-0 nylonsutur.
- Knot bomulds bånd, først den ringere, efterfulgt af den overlegne. På denne måde noget blod tilbageholdes i aorta gør aortotomy lettere.
- Form aortotomy med en 30 G nål ind i lumen af aorta. Udvide snittet med fine mikro saks til en længde på cirka 2 mm. Dette snit er lavet i en lige linje langs den langeitudinal beholderens akse.
- Foretag en ende-til-side anastomose donor aorta til modtageren aorta på følgende måde. Placer en 10-0 nylonsutur ophold sting i donor aorta og den ringere vinkel snit i modtagerens aorta og slips. Placer en anden 10-0 nylon modsat den første i donor aorta og den overlegne hjørne af snit i den abdominale aorta og slips.
- Lav en kørende sutur linje fra overlegen ringere i den laterale væg af aorta og slips mod tidligere placeret ophold søm. Vær sikker på at bringe INTIMAS (indre beholder overflade) sammen som du syr. Så sutur den mediale side i et kørende mode og slips. Den første og sidste maske på hver side bør placeres så tæt på ophold sømme som muligt. Så tilstræber at have 3 jævnt fordelte masker mellem disse to gør alt 5 sting.
- Gør en ende på anastomose af donor lungepulsåren til modtageren IVC på følgende måde. PunctURE IVC med en 30 G kanyle og udvide snittet i ca. 2 mm med fine mikro saks. Dette snit er lavet i en lige linie langs den langsgående akse af fartøjet.
- Bind donor lungepulsåren til den ringere hjørne af snit i IVC med 10-0 nylon. Placer en anden 10-0 nylon modsat den første i donor arterie og den overlegne hjørne af snit i IVC og slips.
- Lav en kørende sutur linie mellem lungepulsåren og IVC og slips. Den første og sidste maske på hver side bør placeres så tæt på ophold sømme som muligt. Så tilstræber at have 5 jævnt fordelte sting mellem disse to gør alt 7 sting.
- Slip distale 4-0 bomuld tie om genindførelse venøse flow.
- Når hæmostase i venøs anastomose er blevet iagttaget proximale 4-0 bomuld slips gradvist løsnet og arteriel anastomose observeret for hæmostase. Når begge anastomoser betragtes sikkert, fjernes cotton binder fra musen.
- Retur tarmen til maven. Bugvæggen er lukket i to lag ved hjælp af 5-0 silkesutur i et kørende måde.
- Administrere en 1,0 ml bolus af steril, varm normalt saltvand i maven som væske genoplivning ved lukning, og 0,8 ml normalt saltvand injiceres subkutant postoperativt. Ingen andre støttende foranstaltninger er påkrævet under operationen. Recover dyret på et varmetæppe. Samlet implantat er ca. 90-120 min for begyndere, 45-60 min med erfaring. Indgiv buprenorphin analgesi, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml i begyndelsen af proceduren og hver 6-12 time i 72 timer efter operationen.
3.. Graft vurdering
- Vurdere transplantatfunktion dagligt af trans-abdominal palpation.
- Hold musen, som om det var gives en intraperitoneal injektion.
- Tryk forsigtigt spidsen af en pegefinger mod bugvæggen og konstatere det bankende strength og regelmæssighed graft.
- Giv palpation kvalitet en score fra 4 (normal amplitude og frekvens) til 0 (non-prygl afvist graft).
VIGTIGE BEMÆRKNINGER:
Alle instrumenter steriliseres, sterile handsker bæres under hele proceduren, og et sterilt felt opretholdes. Donor og modtager operationer er udført med brug af et operativsystem mikroskop. Sørg for, at anastomoser er "ren". Det vil sige, at bagvægge ikke bliver fanget, når du placerer sting. Dette vil medføre en betydelig indsnævring til at flyde, der vil mere end sandsynligt resultat i et mislykket graft og i ekstreme tilfælde at hind-lemmer lammelse. Det er også meget vigtigt, at den fulde tykkelse passerer herunder vaskulære adventitia og intima af Suturnåle nås. Evertion af kanterne sikrer også, at der er intima-til-intima kontakt, som hjælper med tætning og heling af anastomoser. En anden afgørende vigtigt faktumeller at sikre, at spændingen af de anastomotiske syningslinjerne er også optimal. For løs, og der vil være uoprettelige lækker, alt for stram og forsnævring at flyde vil medføre. Hvis på den arterielle side dette vil resultere i dårlig perfusion af transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet hjerte vil medføre.
Representative Results
Udnyttelsen af denne kirurgiske teknik baner vej for enten simple graft overlevelse / forkaste undersøgelser, eller ganske komplekse forsøgsprotokoller. I undersøgelsen kort beskrevet i nedenstående figur, vi forsøgt at definere involvering, om nogen, af Fas-og / eller perforin som mekanismer af CD4 T-celle medieret cardiac afvisning. Dette blev gjort muligt af den ekstraordinære vifte af musestammer, der er tilgængelige i dag. Resultaterne viser, at den direkte afvisning af hjerteallografter CD4 effektor T-celler kræver alternativ bidrag graft Fas ekspression og T-celle perforin ekspression. Til vores viden, er dette den første påvisning af, at cytolytisk aktivitet af CD4 T-celler kan spille en obligat rolle for primær akut afstødning in vivo.
1.jpg "/>
. Figur 1 Perforin og Fas repræsentere obligate og parallelle veje CD4 T-cellemedieret hjerteafstødelse B6 B6 PFPKO (perforin knock-out), og B6 gld (Fas-ligand deficiente) CD4 T-celler blev anvendt til at rekonstituere B6 rag - / - modtagere af C3H vildtype eller Fas-mangel C3H lpr hjerteallografter. Fjernelse af Fas alene (♦, p = NS vs kontrol Wt C3H + B6 CD4 T-celler) fra donor hjerter eller fjernelse eller perforin alene fra CD4 T-celler (■, p = NS vs kontrol Wt C3H + B6 CD4 T celler) ikke ophæver afvisning. Interessant, fjernelse af FasL fra effektor-CD4-T-celler gjorde forsinkelse afvisning signifikant (●, p <0,02 vs Wt C3H + B6 CD4 T-celler, p <0,01 vs Wt C3H + B6 PFPKO CD4 T-celler, og p <0,01 vs . C3H lpr + B6 CD4 T-celler). Imidlertid blev de fleste allotransplantater stadig afvist (4 af 5). Betydeligt, samtidig fjernelse af både donor-Fas-og CD4-T-celle perforinfuldstændigt ophævet afstødning (○, p <0,002 over for kontrol Wt C3H + B6 CD4 T-celler, Wt C3H + B6 PFPKO CD4 T-celler og C3H lpr + B6 CD4 T-celler). Denne ophævelse var betydeligt mere robust end de enkelte fjernelse af CD4 T-celle FasL (○, p <0,003 vs kontrol Wt C3H + B6 GLD CD4 T-celler). Fra Grazia et al 10. Genoptrykt med tilladelse.
Discussion
Denne kirurgiske teknik er ikke let at mestre, men når beherskes er en kraftfuld forskning værktøj. Forskeren / kirurg er belønnet med konsekvens af teknik og med sans for detaljer. Tålmodighed under indlæringsfasen er nøglen. Som offentliggjort af Niimi 3, ved hjælp af en video baseret læring værktøj, det tager i gennemsnit 11 forsøg på at opnå den første vellykkede procedure og 78 forsøg på at opnå en succesrate på 90%. Videoer er blevet et vigtigt pædagogisk redskab i kirurgi 11,12.
Fejlfinding
Blødning fra anastomoser kan forekomme, og dette skyldes sandsynligvis enten mangel på korrekte spænding i suturerne, eller for få suturer. Mens en evne til at størkne induktionsmiddel såsom Gelfoam kan være nyttig til at reducere lækager, anbefaler vi, at kirurgen skal stole på god teknik. Overbelastede non-bankende hjerte er mest almindeligt på grund af anastomoser, der er for stram, især på den venøse side. En ikke-beating, er ikke-perfunderet graft ofte forårsaget af en luftboble, der har rejst i en af kranspulsårerne. Det er vigtigt at opretholde en fugtig-til-vådt område for at undgå optagelse af bobler i karrene.
Begrænsninger af Teknik
Denne teknik er ikke egnet, hvis en forsker ønsker at undersøge virkningerne på et fuldt fungerende hjerte. Det ville kræve en ortotopisk transplantation teknik, som til dato har vist sig umuligt at udføre.
Betydning forhold til det eksisterende metoder
Hvis man ønsker at studere virkningerne på et fuldt vaskulariseret, organtransplantation i musen, så hjertet model er formentlig den enkleste at mestre. Musemodeller af lunge-, nyre-og levertransplantation findes, men er meget sværere at lære og perfekt.
Kritiske trin i protokollen
Det er afgørende vigtigt, at fuld tykkelse pæsler herunder vaskulære adventitia og intima suturnål er opnået. Evertion af kanterne sikrer også, at der er intima-til-intima kontakt, som hjælper med tætning og heling af anastomoser. En anden afgørende vigtig faktor er at sikre, at spændingen af de anastomotiske syningslinjerne er også optimal. For løs, og der vil være uoprettelige lækker, alt for stram og forsnævring at flyde vil medføre. Hvis på den arterielle side dette vil resultere i dårlig perfusion af transplantatet, hvis på den venøse side en overbelastet hjerte vil medføre.
Frem for alt vil gentagelse, konsistens procedure og løbende opmærksomhed for detaljer give store resultater og kan finansieres og publicerbare data.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Biagio Pietra for sit tidligere arbejde i vores laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
