Summary
El yazması fare heterotopik kalp nakli gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar.
Abstract
Bu tekniği ilk Corry, Wynn ve Russell tarafından bildirilmiştir beri şimdi kırk yıldır. Diğer laboratuvarları yeterliliğine ve bu tekniği kullanmak için biraz yıl sürdü rağmen, artık yaygın olarak dünyada birçok laboratuvar tarafından kullanılmaktadır. Orijinal tekniği önemli bir arıtma geliştirilen ve Niimi tarafından 2001 yılında rapor edilmiştir. Merkezimizde üç cerrah (Plenter, Grazia, Pietra) elinde daha bir on yıl boyunca evrim geçirmiş teknikleri burada anlatılan. Bu teknikler şimdi cerrahlar ve araştırmacı bir genç kuşağa ediliyor.
Ayrıntılar biz diğerleri bu çok kullanışlı modeli kullanmak mümkün olabilir böyle bir şekilde burada anlatmayı çalışacağız - büyük ölçüde Niimi deneyimlerine dayanarak, kullanılan prosedürleri ince ayrıntılar gelişmiştir. Niimi gibi, öğrenme için bir video yardım başlayanlar için paha biçilmez bir kaynak olduğunu bulduk.
Introduction
Farelerde böbrek, akciğer, karaciğer ve pankreas nakli gerçekleştirmek için mümkün olduğu bir dönemde, 1973 yılından bu yana temel organ nakli ve immünoloji araştırma taşı 1-4 fare heterotopik kalp nakli modeli kalır. Aradan geçen yıllarda birçok makale bu prosedüre iyileştirmeler / geliştirmeler 5,6 detay yayınlanmıştır.
Solid organ öncelikle vaskülerize naklinin bir model olarak bu prosedürü bulunmamaktadır. Bir kez hakim bu prosedür allojenik ret yanıtları 7, kronik vaskülopati 8 ve iskemi reperfüzyon hasarı 9 mekanizmalarının geliştirilmesi araştırma için oldukça rahat.
Bu yordamı başarılı öğrenme tuşları tıpkı diğer cerrahi, eğitmen ve detaylara stajyer ve ilgi kısmında sabır gibidir. Sürecin başında, yeni cerrah olduğunu t göreceksinizhey Her nakli uzun saatler geçireceksiniz. Deneyim kazanmış gibi, cerrahi süreleri ve dolayısıyla iskemi, büyük ölçüde azaltacaktır. Her adım ayrıntılara dikkat er ya da geç başarıya götürecek.
Eğitmen geçmek için ellerinden geleni yapabilir, ve bu ameliyatlar sırasında karşılaşılabilecek olası çukur düşme tüm tahmin ederken, "yaratıcı" stajyer olasılıkla kendi bazı bulacaksınız!
Aşağıdaki gibi prosedürün temelleri vardır. Aort arkı artan donör olup uç-yan alıcı abdominal aorta ve donör pulmoner arter anastomoz olan uç-yan alıcı karın inferior vena kava (IVC) anastomoz. Kan koroner arterlere verici aorttan retrograd olarak alıcı aort akar. Kanı koroner sinüs yoluyla sağ atrium içine akıtır koroner sistemi aktıktan sonra, sağ ventrikül içine pompalanır vesonra alıcıya IVC içine pulmoner arter yoluyla. Bu şekilde, koroner arter kan sistemi temin edilir ve sinüs ritmi reperfüzyon 1-2 dakika içinde greft döner. Kalbin sol odaları altında yüklü aslında basınç olduğundan sol ventrikül serbest duvar zamanla atrofiye olur.
Protocol
Tüm hayvanlar IACUC onayı altında Colorado Barbara Davis Center Hayvan Tesisi Üniversitesi'nde patojen içermeyen koşullar altında muhafaza ve NIH talimatlarına göre bakım için.
Prosedür başladıktan sonra anestezi derinliği başlangıçta ayak tutam tarafından ve solunum hızı uyulması tarafından değerlendirilir.
1.. Donör Kalp Hasat
- (60 mg / kg IP) pentobarbital enjekte edilerek verici fare anestezisi.
- 4-yollu koltuk ile fare hareketsiz ve kürk klibi. Alkol ile cildinizi silin.
- Cilt uzak diseksiyon sonra, diyaframa bir enine kesi sadece aşağı yaparak karın boşluğu açmak.
- Kot yerleştirilmesinden diyafram posterior kesin ve anterior ve süperior kalbi açığa ön göğüs duvarını kaldırın.
- Göğüs, sol ve sağ tarafta arka yan göğüs boşluğuna kadar kesilmiş tam bir kalınlığa uzatın.
- Yalıtmakinferior vena kava (IVC) ve sağ atrium içine yerleştirilmesi bitişik IVC'da etrafına gevşek 5-0 ipek sütür koyun.
- IVC içine, 4 ° C, heparinize edilmiş tuzlu su (200 U / cc) 1.0 cc enjekte edilir, daha sonra 5-0 ipek dikiş ile bölmek ve damar ligate.
- Benzer şekilde sağ superior vena kava (rSVC) izole ve 5-0 ipek sütür ve bölmek ile ligasyonu.
- Yavaşça hayvanların sağ tarafına doğru kalp rulo ve sol superior vena kava (lSVC) izole, bir 5-0 ipek sütür ile bağlanır ve sol pulmoner arter açığa bölün.
- Timüs uzakta ana pulmoner arter (PA) ve sol ve sağ PA şubelerinden disseke ve aort arkı artan küt iken ıslak bir gazlı bez altında kalp sabitleyin.
- Çevreleyen dokuların aort arkı ücretsiz teşrih künt. Mikro-makas sağ brakiyal-cephalic arterin aorta proksimalinde bölmek için kullanılan, yani kalp ve bölünme arasındaki hiçbir dal olmamalıdırAort noktası.
- Arkus Bu bölümde implant işlemi için arteriyel manşeti oluşturur.
- PA gövde ve PA sağ ve sol dalları maruz inferiorda aort manşet yansıtacak.
- Uzakta mümkün olduğunca kalpten çevre dokulardan sağ ve sol PA dalları teşrih künt. Bu çevre dokulardan PA gövde kolay diseksiyon sağlar.
- Olarak distal onun çatallanmaya mümkün, sadece proksimal olarak PA gövde bölün. Pulmoner arter Bu bölümde implant işlemi için venöz manşeti oluşturur.
- Kalp ve kravat tabanı etrafında bir 5-0 ipek sütür yerleştirin. Bundan sonra, kalp tabanında serbest kesilmiş ve 4 ° C tuzlu su içine yerleştirilir. Toplam hasat süresi yaklaşık. 10-15 dk.
2.. Kalp İmplant Tekniği
- Pentobarbital ile alıcı fareler anestezi (60 mg / kg IP başlangıç dozu, / kg IP ek doz 25 mg gerekirse).
- Kürk Klip ve4-yollu koltuk ile fare hareketsiz ve steril bir şekilde povidon-iyot ve drape ile cildi hazırla.
- 2 cm orta hat dikey karın kesi yapmak ve karın boşluğuna girin.
- Superiorda bağırsak geri çekin ve göğüs üzerinde dışsallaşmış. Dava boyunca steril Nemli gazlı bez (steril serum fizyolojik) sarılı tutun.
- Böbrek damarlarının altındaki abdominal aorta ve vena kava (IVC) izole ve 4-0 pamuk aort etrafındaki bağları ve anastomoz için VKİ üstün sonra aşağı yerleştirin.
- Alanında herhangi bir lomber gemileri tespit ve 10-0 naylon sütür ile lige.
- Pamuk bağları düğüm, birinci alt üstün izledi. Bu şekilde, bir kan aortotomy daha kolay hale aort içinde tutulmaktadır.
- Aort lümeni girmek için bir 30 G iğne ile aortotomy Form. Yaklaşık 2 mm'lik bir uzunluğa ince mikro makas ile kesi uzatın. Bu kesi uzun boyunca düz bir çizgi yapılırGeminin uzanımının oluşturduğu ekseni.
- Aşağıdaki şekilde alıcı aorta verici aort yan anastomoz bir son yapın. Donör aort ve alıcı aort ve kravat kesi alt açısına 10-0 naylon dikiş kalmak dikiş yerleştirin. Donör aort ve abdominal aorta ve kravat kesi üstün köşesinde birinci karşısında ikinci 10-0 naylon yerleştirin.
- Aort yan duvarında üstün inferior için çalışan bir dikiş hattı yapmak ve önceden yerleştirilmiş kalmak ilmek karşı kravat. Eğer dikiş olarak birlikte intimas (damar iç yüzeyi) getirmek için emin olun. Sonra bir koşu moda ve kravat medial tarafını dikin. Her iki tarafında birinci ve son dikiş mümkün kalmak dikiş kadar yakın yerleştirilmelidir. Sonra 5 dikiş yaparak toplamda bu ikisi arasında 3 eşit aralıklı dikiş hedefliyoruz.
- Aşağıdaki şekilde alıcı IVC için verici pulmoner arter yan anastomoz bir son yapın. Puncture 30 G iğne ile IVC'nin ve yakl kesi uzatmak. Ince mikro makas ile 2 mm. Bu kesi kabın uzunlamasına ekseni boyunca düz bir çizgi yapılır.
- 10-0 naylon IVC'da kesi alt köşesine donör pulmoner arter kravat. Donör arter ve IVC'da ve kravat kesi üstün köşesinde birinci karşısında ikinci 10-0 naylon yerleştirin.
- Pulmoner arter ve IVC'da ve kravat arasında çalışan bir dikiş hattı yapmak. Her iki tarafında birinci ve son dikiş mümkün kalmak dikiş kadar yakın yerleştirilmelidir. Sonra 7 dikiş yaparak toplamda bu ikisi arasında 5 eşit aralıklı dikiş hedefliyoruz.
- Distal 4-0 pamuk tie yeniden kurulması venöz akışını bırakın.
- Venöz anastomoz hemostaz gözlenmiştir sonra yakın 4-0 pamuk tie yavaş yavaş gevşek ve arteriyel anastomoz hemostaz için görülmektedir. Her iki anastomozlar güvenli olarak kabul edilir zaman, c çıkarınotton fare bağlar.
- Karın bağırsak dönün. Karın duvarı çalışan bir moda 5-0 İpek sütür kullanarak iki kat olarak kapalıdır.
- Kapanması üzerine sıvı tedavisi gibi karın içine steril, ılık normal tuzlu bir 1.0 ml puşe ve normal tuzlu 0.8 ml operasyon sonrası deri altına enjekte edilir. Hiçbir diğer destekleyici tedbirler ameliyat sırasında gereklidir. Bir ısınma battaniye hayvan kurtarın. Toplam implant süresi yaklaşık. Yeni başlayanlar için 90-120 dakika, tecrübesi ile 45-60 dk. Buprenorfin analjezi, 0.05 mg / kg, SC, prosedürün başında 0.1-0.2 ml ve 72 saat sonrası-op için her 6-12 saat yönetmek.
3.. Greft değerlendirme
- Trans-abdominal palpasyonla günlük greft fonksiyonu değerlendirmek.
- Bir intraperitoneal enjeksiyon verilecek sanki fare tutun.
- Yavaşça karın duvarına karşı bir işaret parmağının ucuna basarak ve dayak str tespitgreft ength ve düzenlilik.
- 0 palpasyon Kalitesi 4 arası bir puan (normal genlik ve frekans) Give (non-dayak greft reddetti).
ÖNEMLİ NOTLAR:
Tüm enstrümanlar, sterilize steril eldiven işlem boyunca giyilir ve steril bir alan korunur. Verici ve alıcı ameliyatları, bir operasyon mikroskopunun kullanılması ile gerçekleştirilir. Anastomozlar "temiz" olduğundan emin olun. Bu dikiş yerleştirirken arka duvarları yakalanmış değil olmasıdır. Bu önemli bir daralma felci-uzuv hind başarısız bir greft ve aşırı durumlarda bu olacak daha büyük olasılıkla sonuç akmasına neden olacaktır. Ayrıca tam kalınlıkta damar adventitianın ve dikiş iğnesinin intima elde edilir dahil geçer hayati önem taşımaktadır. Kenarlarının Evertion ayrıca sızdırmazlık ve anastomoz iyileşmesi yardımcıları intima-to-intimada temas, var olmasını sağlar. Bir diğer hayati önemli gerçekveya anastomoz dikiş hatlarının gerilimi de en uygun olduğunu garanti etmektedir. Çok gevşek ve geri döndürülemez sızıntı olacak, çok sıkı ve akış darlık neden olur. Venöz tarafında bir sıkışık kalp neden olur ise, arteriyel tarafında bu, greft düşük perfüzyon neden olacaktır.
Representative Results
Bu cerrahi tekniğin kullanımı basit grefte / ret çalışmaları, ya da oldukça karmaşık deneysel protokollerin ya için yolu açar. Kısaca, aşağıdaki şekilde tarif edilen çalışmada varsa Fas ve / veya CD4 T hücresi aracılı rejeksiyon mekanizmaları olarak perforin arasında, katılımını tanımlamak için aranan. Bu, bugün mevcut olan fare suşlarının olağanüstü dizi ile mümkün olmuştur. Sonuçlar CD4 efektör T hücreleri ile kardiyak allogreftlerin doğrudan greft reddi Fas ifadesi ve T hücresi perforin ifade alternatif katkı gerektirdiğini göstermektedir. Bildiğimiz kadarıyla, bu CD4 T hücreleri tarafından sitolitik aktivitesi canlı primer akut allogreft reddi için zorunlu bir rol oynayabileceği ilk gösteri.
1.jpg "/>
. Şekil 1 Perforin ve Fas (Fas-ligand eksik) CD4 T hücreleri B6 bez sulandırmak için kullanılmıştır zorunlu ve CD4 T hücre-aracılı Kardiyak Reddi B6, B6 PFPKO (perforin knock-out), ve B6 gld Paralel Pathways Temsil - / - Kalp Allograftlardaki Ipr C3H vahşi tip veya Fas-eksik C3H alıcıları. Yalnız Fas çıkarılması (♦, p = NS kontrol Wt C3H vs + B6 CD4 T hücreleri) donör kalplerin veya CD4 T hücreleri (çıkarılması veya tek başına perforin gelen ■, p = NS kontrol Wt C3H vs + B6 CD4 T hücreleri) reddetme iptal değildi. İlginç bir şekilde, efektör T hücrelerinden CD4 FasL kaldırılmasıdır vs <●, p <Wt C3H + B6 CD4 T hücreleri vs 0.02, p <Wt C3H + B6 PFPKO CD4 T hücreleri vs 0.01, p ve (anlamlı ve önemli bir gecikme 0.01 ret mi . C3H lpr + B6 CD4 T hücreleri). Ancak, çoğu allogreftler hala (5 4) reddedildi. Önemli bir şekilde, hem verici Fas ve CD4 T hücre perforin eşzamanlı olarak çıkarılmasıtamamen iptal reddi (○, p <0.002 kontrol Wt C3H genel + B6 CD4 T hücreleri, Wt C3H + B6 PFPKO CD4 T hücreleri ve C3H lpr + B6 CD4 T hücreleri). Bu iptal önemli ölçüde daha güçlü bir CD4 T hücresi FasL münferit kaldırma fazla oldu (○, p <0.003 vs kontrol Wt C3H + B6 gld CD4 T hücreleri). Grazia ve ark 10. Izni ile yayımlanmaktadır.
Discussion
Bu cerrahi teknik usta kolay değil, ama bir kez hakim güçlü bir araştırma aracıdır. Araştırmacı / cerrah tekniği tutarlılık tarafından ve detaylara dikkat tarafından ödüllendirilir. Öğrenme aşamasında Sabır anahtarıdır. , Bu ilk başarılı prosedürü ve% 90 başarı oranı elde etmek için 78 girişimleri ulaşmak için 11 girişimleri ortalama alır video tabanlı öğrenme aracı yardımıyla Niimi 3 tarafından yayınlanmaktadır. Videolar cerrahi 11,12 önemli bir eğitim aracı haline gelmiştir.
Sorun giderme
Anastomozlar kanama meydana gelir ve bu durum sütür doğru gerginlik eksikliği, ya da çok az dikişler ya muhtemeldir olabilir. Böyle Gelfoam gibi ajan içeren bir pıhtılaşma kaçağının azaltılmasında yararlı olabilir, biz cerrah iyi bir teknik güvenmek gerektiğini öneriyoruz. Sıkışık olmayan kalpte nedeniyle özellikle venöz tarafında çok sıkı anastomoz, en yaygın olarak. A non-beating, perfüze olmayan greft genellikle koroner arterlerin birine gitti bir hava kabarcığı neden olur. Bu kaplara kabarcıkların girişini önlemek için, nemli-to-ıslak alanı korumak için önemlidir.
Tekniğin Sınırlamalar
Bir araştırmacı tam işleyen bir kalp üzerinde etkilerini araştırmak istiyorsa bu teknik uygun değildir. Yani bugüne kadar gerçekleştirmek imkansız kanıtlamıştır ortotopik nakli tekniği gerektirir.
Varolan Yöntemleri Açısından Önemi
Bir fare tam vaskülarize, solid organ nakli üzerine etkilerini incelemek isterse, o zaman kalp model muhtemelen master için basit olduğunu. Akciğer, böbrek ve karaciğer nakli fare modelleri var, ama çok öğrenmek zor ve mükemmel yok.
Protokol kapsamında kritik adım
Bu hayati önemli olduğunu tam kalınlıkta pvasküler adventisya ve dikiş iğnesinin da dahil olmak üzere intima eşek elde edilir. Kenarlarının Evertion ayrıca sızdırmazlık ve anastomoz iyileşmesi yardımcıları intima-to-intimada temas, var olmasını sağlar. Bir diğer hayati önemli faktör anastomoz sütür hatlarının gerilim de optimal sağlamaktır. Çok gevşek ve geri döndürülemez sızıntı olacak, çok sıkı ve akış darlık neden olur. Venöz tarafında bir sıkışık kalp neden olur ise, arteriyel tarafında bu, greft düşük perfüzyon neden olacaktır.
Her şeyden önce, tekrarlama, prosedür ve detaylara sürekli dikkat tutarlılık mükemmel sonuçlar ve fundable ve yayınlanabilir veri verecektir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar laboratuarımızda onun daha önceki çalışmaları için Dr Biagio Pietra teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
