Summary
Manuskriptet beskriver de steg som krävs för att utföra heterotop hjärttransplantation i mus.
Abstract
Det är nu över fyrtio år sedan denna teknik rapporterades först av Corry, Wynn och Russell. Även om det tog några år för andra labb för att bli skicklig i och utnyttja den här tekniken är det nu ofta används av många laboratorier runt om i världen. En betydande förbättring till den ursprungliga tekniken utvecklades och rapporterades 2001 av Niimi. Beskrivs här är de tekniker som har utvecklats under mer än ett decennium i händerna på tre kirurger (Plenter, Grazia, Pietra) i vårt center. Dessa tekniker är nu vidare till en yngre generation av kirurger och forskare.
Bygger till stor del på Niimi erfarenhet, har de förfaranden som utvecklats i de fina detaljerna - detaljer som vi kommer att sträva efter att relatera här på ett sådant sätt att andra kan ha möjlighet att använda denna mycket användbar modell. Liksom Niimi, har vi funnit att en videostöd för lärande är en ovärderlig resurs för nybörjaren.
Introduction
I en tid när det är möjligt att utföra njure, lunga, lever-och bukspottkörteltransplantationer i möss, en hörnsten i grundorgantransplantation och immunologi forskning sedan 1973 1-4 förblir heterotopisk hjärttransplantation modell i musen. Under åren flera tidningar har publicerat detaljer förbättringar / förfiningar 5,6 till detta förfarande.
Som en modell av organ främst kärltransplantation detta förfarande är oöverträffad. När behärskar detta förfarande lämpar sig för forskning om allogena avvisande svar 7, utveckling av kroniska vaskulopatier 8 och mekanismerna för ischemireperfusionsskada 9.
Nycklarna för att framgångsrikt lära detta förfarande är precis som alla andra kirurgi, tålamod hos instruktören och praktikanten och uppmärksamhet på detaljer. I början av processen det nya kirurg kommer att finna att thej kommer att spendera många timmar på varje transplantation. Som får erfarenheter, kommer kirurgiska tider, och därför ischemi, drastiskt minska. Att uppmärksamma detaljerna i varje steg kommer förr eller senare att leda till framgång.
Medan instruktören kan göra sitt bästa för att förmedla, och att förutse alla möjliga fallgropar som kan uppstå under dessa operationer, kommer den "kreativa" praktikant förmodligen hitta några av sina egna!
Grunderna i förfarandet är följande. Donator stigande aortabågen är ände-mot-sida anastomoseras till mottagarens bukaorta och donatorns lungartär är ände-mot-sida anastomoseras till mottagaren abdominala vena cava inferior (IVC). Blod rinner från mottagaren aorta i retrograd sätt genom donator aorta till kranskärlen. När blodet har strömmat genom kranssystemet det rinner in i det högra förmaket via sinus coronarius, pumpas in i den högra ventrikeln ochsedan via lungartären i mottagaren IVC. På detta sätt är den koronara Systemet matas arteriellt blod och sinusrytmen återvänder till transplantat i 1-2 min av reperfusion. Eftersom vänster kammare i hjärtat är i huvudsak tryck under belastade vänsterkammarens fria väggen kommer atrofi med tiden.
Protocol
Alla djur inhystes i patogenfria förhållanden vid University of Colorado Barbara Davis Center Animal Facility i IACUC godkännande och vårdas enligt NIH riktlinjer.
Djup av anestesi bedöms av tå nypa initialt och med iakttagande av andningsfrekvensen så snart förfarandet har inletts.
1. Donator Heart Harvest
- Söva givaren musen genom att injicera pentobarbital (60 mg / kg IP).
- Immobilisera musen genom begränsningar 4-vägs och klippa pälsen. Torka av huden med alkohol.
- Efter att dissekera bort huden, öppna bukhålan genom att göra en tvärgående snitt bara sämre än membranet.
- Skär membranet posteriort kust insättning och lyft den främre bröstväggen anteriort och fint exponera hjärtat.
- Förläng en full tjocklek skära upp den bakre laterala brösthålan på vänster och höger sida av bröstkorgen.
- Isoleranedre hålvenen (IVC) och placera ett löst 5-0 silkessutur runt IVC intill dess införande i det högra förmaket.
- Injicera 1,0 ml av 4 ° C hepariniserad saltlösning (200 U / cm ^) in i IVC, sedan ligera kärlet med 5-0 silkessutur och dela sig.
- Isolera den högra övre hålvenen (rSVC) på ett liknande sätt och ligera med 5-0 silkessutur och dela sig.
- Rulla försiktigt hjärtat mot djurens högra sida och isolera den vänstra övre hålvenen (lSVC), underbinda med en 5-0 silke sutur och dela utsätta den vänstra lungartären.
- Säkra hjärtat i en våt gasväv medan bräss är slö dissekeras bort från huvudlungartären (PA) och vänster och höger PA grenar och stigande aortabågen.
- Blunt dissekera aortabågen fria från de omgivande vävnaderna. Mikro sax används för att dela stora kroppspulsådern proximalt rätt brachial-cephalic artär, dvs det får inte finnas några grenar mellan hjärtat och divisionenpunkt i aorta.
- Den här delen av aortabågen bildar arteriell manschetten för implantatprocessen.
- Reflektera aorta manschetten inferiorly att exponera PA bålen och vänster och höger grenar av PA.
- Blunt dissekera de vänstra och högra PA grenar bort från de omgivande vävnaderna så långt från hjärtat som möjligt. Detta medger enkel dissektion av PA-stammen från omgivande vävnader.
- Dela upp PA stammen så distalt som möjligt, bara proximalt till dess bifurkation. Denna del av lungpulsådern bildar venösa manschetten för implantatprocessen.
- Placera en 5-0 silke sutur runt basen av hjärtat och slips. Hjärtat skärs sedan fria vid basen, och placerades i 4 ° C saltlösning. Total skördetid är ca. 10 till 15 min.
2. Heart Implantatteknik
- Söva mottagaren möss med pentobarbital (60 mg / kg IP initial dos, 25 mg / kg IP extra dos om det behövs).
- Klipp pälsen ochimmobilisera musen genom begränsningar 4-vägs och prep huden med povidon-jod och drapering på ett sterilt sätt.
- Gör en 2 cm mittlinje vertikal buksnitt och in i bukhålan.
- Dra tarmen fint och externaliserats till bröstet. Förvara insvept i steril fuktig gasväv (steril koksaltlösning) under hela fallet.
- Isolera bukaorta och sämre hålvenen (IVC) under njurkärlen och placera 4-0 bomullsband runt aorta och IVC överlägsen sedan underlägsna anastomosen platsen.
- Identifiera eventuella ländryggen fartyg inom området och ligate med 10-0 nylon sutur.
- Knyt bomullsband, först det sämre, följt av den överlägsna. På detta sätt kan en del blod blir kvar i den aorta göra aortotomy lättare.
- Forma aortotomy med en 30 G nål för att komma in i lumen i aorta. Förläng snittet med fina mikro sax till en längd av ca 2 mm. Detta snitt görs i en rak linje längs den långaitudinal axeln hos kärlet.
- Gör ett slut på sida anastomos av donatorns aorta till mottagarens aorta på följande sätt. Placera en 10-0 nylonsutur vistelse stygn i givar aorta och sämre vinkel snittet i mottagarens aorta och slips. Placera en andra 10-0 nylon motsatt den första i givar aorta och den överlägsna hörnet av snittet i bukaorta och slips.
- Gör en löpande sutur linje från överlägsen underlägsen i sidovägg av aorta och slips mot den tidigare placerade vistelsen stygn. Glöm inte att ta med intimas (inre kärl yta) tillsammans som du syr. Sedan sutur den mediala sidan på ett löpande sätt och slips. Den första och sista maskan på varje sida bör placeras så nära vistelse stygn som möjligt. Rikta därefter att ha tre jämnt fördelade stygn mellan dessa två gör totalt 5 stygn.
- Gör ett slut på sida anastomos av donatorns lungartär till mottagarens IVC på följande sätt. Puncture IVC med en 30 G nål och förlänga snittet för ca. 2 mm med fina mikro sax. Detta snitt görs i en rak linje längs den längsgående axeln hos kärlet.
- Knyt givaren lungartären till det sämre hörn snitt i IVC med 10-0 nylon. Placera en andra 10-0 nylon motsatt den första i givar artär och överlägsen hörnet av snittet i IVC och slips.
- Gör en löpande sutur linje mellan lungartären och IVC och slips. Den första och sista maskan på varje sida bör placeras så nära vistelse stygn som möjligt. Rikta därefter att ha 5 jämnt fördelade stygn mellan dessa två gör totalt 7 stygn.
- Släpp distala 4-0 bomull slips återupprätta venösa flödet.
- När hemostas av venös anastomos har observerats proximala 4-0 bomull slips gradvis lossas och arteriella anastomos observerats för hemostas. När båda anastomoser anses vara säker, ta bort cotton slipsar från musen.
- Återgå tarmen till buken. Bukväggen är stängd i två lager med hjälp av 5-0 silke sutur i en kör sätt.
- Administrera en 1,0 ml bolus av steril, varm normal saltlösning in i buken såsom vätsketillförsel vid stängning, och 0,8 ml fysiologisk koksaltlösning injiceras subkutant postoperativt. Inga andra stödjande åtgärder krävs under operationen. Åter djuret på en värmande filt. Total implantat tid är ca. 90-120 min för nybörjare, 45-60 min med erfarenhet. Administrera buprenorfin smärtlindring, 0,05 mg / kg, SC, från 0,1 till 0,2 ml i början av förfarandet och var 6-12 timme för 72 timmar post-op.
3. Graft bedömning
- Bedöma transplantatfunktion dagligen av trans-abdominal palpation.
- Håll musen som om det skulle ges en intraperitoneal injektion.
- Tryck försiktigt på spetsen av ett pekfinger mot bukväggen och fastställa stryk strängd och korrekthet transplantatet.
- Ge palpation kvalitet en poäng från 4 (normal amplitud och frekvens) till 0 (icke-stryk avvisade graft).
VIKTIGT:
Alla instrument är steriliserade, sterila handskar bärs under hela förfarandet och ett sterilt område bibehålls. Givare och mottagare operationer utförs med användning av ett operationsmikroskop. Se till att anastomoser är "ren". Det vill säga, att de bakre väggarna inte fastnar när du placerar stygn. Detta kommer att orsaka en betydande sammandragning att flöda som kommer högst sannolikt resultera i en misslyckad transplantat och i extrema fall att hind-lem förlamning. Det är också mycket viktigt att full tjocklek passerar inklusive kärl adventitia och intima suturnålen uppnås. Evertion av kanterna säkerställer också att det finns intima-to-intima kontakt, som hjälper till vid förslutning och läkning av anastomoser. Ett annat mycket viktigt faktumeller är att se till att spänningen i anastomotic sutur linjer är också optimal. För löst och det kommer att bli oåterkallelig läcker, för hårt och striktur flöda kommer att resultera. Om den arteriella sidan kommer detta att resultera i dålig genomblödning av transplantatet, om den venösa sidan en överbelastade hjärta kommer att resultera.
Representative Results
Utnyttjandet av denna kirurgiska teknik öppnar för antingen enkla graftöverlevnad / underkänna studier, eller ganska komplexa experimentella protokoll. I studien beskrivs kortfattat i figuren nedan, sökte vi att definiera delaktighet, om någon, av Fas-och / eller perforin som mekanismer för CD4 T-cellmedierade hjärtavstötning. Detta blev möjligt genom den extraordinära samling av mus-stammar som finns tillgängliga idag. Resultaten visar att den direkta avstötning av hjärt-allograft från CD4-effektor-T-celler kräver alternative bidraget av transplantat Fas-expression och T-cell perforin expression. Såvitt vi vet är detta den första demonstrationen som cytolytisk aktivitet av CD4 T-celler kan spela en obligat roll för primär akut avstötning in vivo.
1.jpg "/>
. Figur 1 Perforin och Fas Föreställ Obligat och parallella vägar av CD4 T-cell-medierad hjärtavstötning B6 B6 PFPKO (perforin knock-out), och B6 gld (Fas-ligand-deficienta) CD4-T-celler användes för att rekonstituera B6 rag - / - mottagare av C3H vildtyp eller Fas-brist C3H lpr hjärt allograft. Borttagning av Fas ensam (♦, p = NS vs kontroll Wt C3H + B6 CD4 T-celler) från givar hjärtan eller borttagande eller ensam perforin från CD4 T-celler (■, p = NS vs kontroll Wt C3H + B6 CD4 T celler) inte upphäva avslaget. Interestingly avlägsnandet av FasL från effektorceller CD4-T-celler gjorde fördröjningsavstötning signifikant (●, p <0,02 vs Wt C3H + B6 CD4-T-celler, p <0,01 vs Wt C3H + B6 PFPKO CD4-T-celler, och p <0,01 vs . C3H lpr + B6 CD4 T-celler). Dock var de flesta organtransplantationer fortfarande avvisas (4 av 5). Betecknande samtidigt avlägsnande av både givare Fas och CD4 T-cell perforinfullständigt upphävde avstötning (○, p <0,002 jämfört med kontroll Wt C3H + B6 CD4-T-celler, Wt C3H + B6 PFPKO CD4-T-celler, och C3H lpr B6 + CD4 T-celler). Denna upphävdes var betydligt mer robust än den enskilda borttagning av CD4 T-cell FasL (○, p <0,003 vs kontroll Wt C3H + B6 gld CD4 T-celler). Från Grace et al 10. Återges med tillstånd.
Discussion
Detta kirurgiska teknik är inte lätt att bemästra, men när bemästrat är ett kraftfullt forskningsverktyg. Forskaren / kirurg belönas genom konsekvens av teknik och känsla för detaljer. Patience under inlärningsfasen är nyckeln. Som publiceras av Niimi 3, med hjälp av en videobaserad inlärningsverktyg det tar i genomsnitt 11 försök att uppnå det första framgångsrika förfarandet och 78 försök att uppnå en 90% framgång. Videor har blivit ett viktigt hjälpmedel i undervisningen i kirurgi 11,12.
Felsökning
Blödning från anastomoser kan uppstå och detta är sannolikt på grund av antingen brist på korrekt spänning i suturer, eller för få suturer. Medan en koagulering framkallande medel såsom Gelfoam kan vara användbart för att minska läckage, rekommenderar vi att kirurgen bör förlita sig på god teknik. Överbelastad icke-slående hjärta är oftast på grund av anastomoser som sitter åt, särskilt på den venösa sidan. En icke-Beating, är icke-perfusion transplantat vanligen orsakas av en luftbubbla som har rest in i en av kranskärlen. Det är viktigt att upprätthålla en fuktig till våt fältet för att undvika inträde av bubblor in i kärlen.
Begränsningar av Technique
Denna teknik är inte lämplig om en forskare vill undersöka effekterna på en fullt fungerande hjärta. Det skulle kräva en orthotopic transplantationsteknik, som hittills har visat sig omöjligt att utföra.
Betydelse avseende befintliga metoder
Om man vill studera effekterna på ett helt vaskulariserad, solid organtransplantation i musen, sedan hjärtat modellen är förmodligen det enklaste att bemästra. Existerar musmodeller av lung-, njur-och levertransplantation, men är mycket svårare att lära sig och perfekt.
Kritiska steg Inom protokollet
Det är mycket viktigt att full tjocklek påsnor inklusive kärl adventitia och intiman av suturnålen uppnås. Evertion av kanterna säkerställer också att det finns intima-to-intima kontakt, som hjälper till vid förslutning och läkning av anastomoser. En annan oerhört viktig faktor är att se till att spänningen i anastomotic sutur linjer är också optimal. För löst och det kommer att bli oåterkallelig läcker, för hårt och striktur flöda kommer att resultera. Om den arteriella sidan kommer detta att resultera i dålig genomblödning av transplantatet, om den venösa sidan en överbelastade hjärta kommer att resultera.
Framför allt kommer upprepning, konsekvens av förfarande och ständig uppmärksamhet på detaljer ge bra resultat och fonderas och publicerbara data.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Biagio Pietra för hans tidigare arbete i vårt labb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
