Introduction
La capacidad de hPSCs para diferenciar hacia los tejidos adultos multilinaje ha abierto nuevas vías para el tratamiento de pacientes que sufren de enfermedades graves que involucran cardiovasculares, hepáticas, pancreáticas, y los sistemas neurológicos 1-4. Varios tipos de células derivadas de hPSCs también proporcionarían plataformas móviles robustos para el modelado de la enfermedad, la ingeniería genética, la detección de drogas y 1,4 pruebas toxicológicas. La cuestión clave que garantiza sus futuras aplicaciones clínicas y farmacológicas es la generación de un gran número de hPSCs de grado clínico a través de cultivo celular in vitro. Sin embargo, los sistemas de cultivo actuales son insuficientes o intrínsecamente variables, diversos cultivos de alimentación y libres de alimentador de hPSCs como colonias 5,6.
Crecimiento de tipo colonia de acciones hPSCs muchas características estructurales de la masa celular interna (ICM) de embriones de mamíferos tempranos. El ICM es propenso a diferenciarse en las tres capas germinalesen un entorno multicelular debido a la existencia de gradientes de señalización heterogéneos. Por lo tanto, la adquisición de la heterogeneidad en el desarrollo embrionario temprano se considera como un proceso necesario para la diferenciación, pero una característica no deseada de la cultura HPSC. La heterogeneidad en la cultura HPSC es a menudo inducida por señales apoptóticas excesivas y diferenciación espontánea debido a las condiciones de crecimiento subóptimas. Por lo tanto, en el tipo de colonia de cultivo, las células heterogéneas se observan a menudo en la periferia de las colonias 7,8. También se ha demostrado que las células en células madre embrionarias (células madre) colonias de respuestas diferenciales de exposición a moléculas de señalización tales como BMP-9 4. Por otra parte, los métodos de cultivo de colonias producen rendimientos bajos de células, así como las tasas de recuperación muy bajo de células de la criopreservación, debido a las tasas de crecimiento incontrolable y señalización apoptótica pathways 6,9. En los últimos años, diversos cultivos en suspensión han sido desarrollados para hPSCs de cultivo, particulArly para la expansión de grandes cantidades de hPSCs en subordinado, y las condiciones de matriz libre 6,10-13. Obviamente, diferentes sistemas de cultivo tienen sus propias ventajas y desventajas. En general, la naturaleza heterogénea de hPSCs representa uno de los principales inconvenientes en los métodos de tipo colonia y cultura agregada, que son subóptimas para la entrega de materiales de ADN y de ARN en hPSCs para la ingeniería genética 6.
Claramente, existe una necesidad imperiosa de desarrollar nuevos sistemas que evitan algunas deficiencias de los métodos de cultivo actuales. Los descubrimientos de inhibidores de moléculas pequeñas (como el inhibidor de la ROCA Y-27632 y JAK inhibidor 1) que mejoran la supervivencia de una sola célula preparan el terreno para el cultivo disociado-HPSC 14,15. Con el uso de estas moléculas pequeñas, hemos desarrollado recientemente un método de cultivo basado en el tipo no-colonia (NCM) de crecimiento de-hPSCs disociadas 9. Este método de cultivo de la novela combina pases de una sola célula y de alta densidadchapado métodos, que nos permite producir grandes cantidades de hPSCs homogéneas bajo ciclos de crecimiento consistentes sin mayores anomalías cromosómicas 9. Alternativamente, la cultura NCM podría ser implementado con diferentes moléculas pequeñas y matrices definidas (tales como lamininas) con el fin de optimizar el método de cultivo para amplias aplicaciones. A continuación, presentamos varios protocolos de detalle sobre la base de la cultura NCM y delinear los procedimientos detallados para la ingeniería genética. Para demostrar la versatilidad de los protocolos de NCM, también a prueba la cultura NCM con inhibidores de ROCK diversos y con la única isoforma laminina 521 (es decir, LN-521).
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Protocol
Basada en células Individual tipo no colonia monocapa (NCM) cultura de hPSCs.
1. Preparación
- Hacer 500 ml de medio de cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs): medio DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA).
- Aislar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) células derivadas de la cepa CF1 siguiendo un protocolo de rutina 16 y la cultura MEFs en 0,1% 6-así placa de cultivo celular recubierto con gelatina en medio DMEM. Alternativamente, comprar acciones del MEF en el paso 3 de los recursos comerciales.
- Preparar placas Matrigel.
- Diluir 5 ml de células madre calificado Matrigel acción con 5 ml de medio DMEM/F12 (refrigerado a ~ 4 ° C) y la tienda de un 50% de alícuotas en un -20 ° C congelador. Descongelar la Matrigel de stock congelado en un refrigerador (~ 4 ° C) O / N y más diluir el Matrigel en medio DMEM/F12 frío (para dar lugar a una concentración de trabajo 2,5%).
- Retire la placa de Matrigel del refrigerador, deje que la placa se caliente a temperatura ambiente en la campana de cultivo de células de 10 a 30 min (Nota: no calentar la placa en una incubadora de cultivo celular), y aspirar DMEM medio antes de chapado hPSCs.
- Hacer 500 ml de medio de células madre: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, y 4 ng / ml de FGF-2.
- Preparar 10 ml de 2X HPSC medio de congelación: 60% de SFB, 20% de DMSO y 20 M Y-27632 en medio mTeSR1, esterilizar por filtración, y utilizar el medio plazo de 1 semana.
. 2 Protocolo 1 (Básico): Crecen HPSC Colonias en Alimentadores
- Use los números de paso del MEF a las 5 o 6 (designado como P5 y P6) para la cultura HPSC el fin de obtener resul consistentets. Mitóticamente inactivar MEFs mediante el tratamiento de las células con 10 g / ml de mitomicina C durante 3 horas a 37 ° C, se lavan las células 3 veces con fosfato solución salina tamponada con 1X de Dulbecco (D-PBS), y a continuación se disocian los MEFs con 0,05% de tripsina en 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a una dosis de 8.000 rads con un irradiador de rayos X.
- Contar el número de células usando el método de exclusión con tinción de azul de tripano bajo el microscopio. Como alternativa, utilice un contador de células automático.
- Placa MEFs irradiadas en placas de poliestireno de 6 pocillos recubiertas con 0,1% de gelatina a una densidad de 1,88 x 10 5 células por pocillo (es decir, 1,96 x 10 4 células / cm 2). Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Retire el medio de cultivo MEF mediante aspiración con una pipeta Pasteur (Nota: no hay pasos de lavado necesarios en este momento).
- Colonias Triturar HPSC de cultivo previo en pequeños grupos, examinan los grumos con el microscopio para asegurar que sus tamaños que van from 50 a 100 micras de diámetro, y la placa grumos HPSC en la parte superior de las capas alimentadoras MEF en un pocillo que contiene 2 ml de medio HPSC.
- Cambie hESC medio día durante 3 a 5 días, récord de crecimiento de colonias por fotografía, marcar cualquier colonias morfológicamente alterados o diferenciados (~ 5%), y quitar manualmente las colonias marcadas por aspiración suave con una pipeta Pasteur.
- Enjuague las colonias restantes en MEFs dos veces (2 min cada uno con D-PBS), e incubar las colonias con 2 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV en medio HPSC durante 10 a 30 min), y examinar el desprendimiento de colonias HPSC de la superficie recubierta-MEF (Nota: use un raspador para ayudar al proceso de desprendimiento sólo si las colonias están estrechamente unidos a la placa).
- Añadir 5 ml de medio de HPSC a cada pocillo para minimizar las reacciones enzimáticas, las colonias de la transferencia a un tubo de 15 ml, permitir colonias HPSC sedimentar durante 3 a 5 min a TA, y garantizar la sedimentación de colonias por visualización directa de la Cells en la parte inferior del tubo (Nota: No centrifugue el tubo en este paso).
- Retire los sobrenadantes que contienen MEFs residuales y disociada células individuales, volver a suspender las colonias con 5 ml de medio de células madre, y repetir la etapa de sedimentación en dos ocasiones.
- Retire las medianas, las colonias se tritura HPSC en pequeños grupos, tienda en 1X HPSC medio de congelación (o medio de congelación CryoStore CS10) para la crioconservación (1 confluentes bien por vial congelado) o la placa en una placa de 6 pocillos de pases celulares.
3 Protocolo 2:. Convertir HPSC Colonias de Comederos para NCM
- Enjuague pellets de HPSC en D-PBS una vez, incubar los gránulos con 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, y examinar la reacción enzimática bajo un microscopio para asegurarse de disociación de una sola célula.
- Terminar las reacciones enzimáticas resuspendiendo suavemente las células en 5 ml de medio mTeSR1 que contiene 10 mM de Y-27632 seguido por centrifugación a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 min(Nota, no utilice fuerzas de centrifugación excesivas que causan daño celular).
- Añadir 5 ml de medio mTeSR1 al sedimento, resuspender el precipitado como células individuales, y el filtro se disoció las células a través de un filtro de células de 40 m (para eliminar cualquier agregados celulares residuales).
- Semillas 1,3-2 x 10 6 hPSCs en un pocillo (1.4 a 2.1 x 10 5 células / cm 2) de una placa de 6 pocillos recubiertos con el 2,5%-hESC calificado Matrigel, añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml, y se compone de 10 M Y-27632 en el medio (para facilitar la 24 hr placa inicial de una sola célula). Como alternativa, utilice los siguientes moléculas pequeñas para reemplazar 10 M Y-27632 para mejorar chapado de una sola célula: 1 M Y-39983 (ROCK I inhibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inhibidor ROCA II), 1 mM thiazovivin (un inhibidor de la ROCA novela) , y el inhibidor de JAK 2 M 1.
- Sustituya el medio con medio mTeSR1 libre de drogas, al día siguiente (dentro de las 24 horas), disociar las células de una extraasí, y contar el número de células para determinar eficiencia de plaqueo de una sola célula (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de eficiencia de deposición electrolítica de una sola célula que se puede lograr en esta etapa).
- Permita que las células crezcan como una sola célula-formado monocapa durante unos días con 3 ml de medio mTeSR1. Cambio de medio al día.
- Empíricamente determinar el calendario de pases adaptado NCM dependiendo de la densidad celular. Pasaje cuando el crecimiento celular alcanza la confluencia en el día 3 o 4 días, o en el punto de tiempo de 4 horas después de la desaparición de las fronteras de célula a célula. Disociar las células en 1 ml de Accutase, utilizar una relación de división de 1 a 3 (es decir, 1 confluentes bien de células cultivadas en placas en 3 pocillos de placa de 6 pocillos) para los pases de células, y estabilizar adaptado NCM por 5 pasajes.
- Congelación de la célula
- Utilizar un pozo confluente (~ 5-6 x10 6 células) para un vial congelado: disociar las células de un confluente bien con 1 ml de Accutase durante 10 min.
- Diluir wITH 5 ml de células medianas y centrifugar mTeSR1 como se describió anteriormente.
- Resuspender el sedimento en 500 l de medio de mTeSR1 y luego añadir lentamente 500 l de 2X HPSC medio de congelación (que contienen 20 mM de Y-27632) en un vial de crioconservación. Alternativamente, resuspender las células en 1X HPSC medio de congelación que contienen inhibidor de JAK 2 M 1 o medio 1X CryoStor CS10 en presencia de ya sea 10 M Y-27632 o 2 inhibidor de JAK M 1.
- Coloque los viales congelados en un recipiente criogénico enfriada con hielo (abajo llena con isopranol) y transferir el recipiente criogénico a -80 ° C congelador inmediatamente.
- Células de transferencia del -80 ° C congelador a un tanque de nitrógeno líquido (al día siguiente) para la crioconservación a largo plazo.
- Descongelación celular
- Utilizar un vial de crioconservación para recubrir 1 pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Medio mTeSR1 Pre-caliente en un baño de agua a 37 ° C durante 10 min, las células de deshielo en el mismo baño de agua durante 2 min,gota a gota añadir células a 5 ml de medio mTeSR1 pre-calentado que contienen 10 mM de Y-27632, y se centrifuga como se describió anteriormente.
- Resuspender suavemente los sedimentos de células con 2 ml de medio mTeSR1 que contienen 10 mM de Y-27632 y transferir lentamente las células a un pocillo de pre-recubierta con Matrigel (Nota: evitar la producción de burbujas de aire).
- Cambiar medio diario y esperamos que el crecimiento HPSC alcanzar confluencia en el día 3 o 4.
4 Protocolo 3:. Convertir HPSC colonias en Matrigel a NCM Cultura
- Quitar una placa recubierta con Matrigel del refrigerador, coloque la placa en la campana de cultivo de tejidos de 10 a 30 min, se elimina el medio de cada pocillo de la placa, y añadir 2 ml de medio mTeSR1 precalentado a cada pocillo.
- Transferencia trituró grupos HPSC de la cultura alimentador (Paso 2,10 del protocolo básico) a la placa de Matrigel anteriormente. Añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml de volumen final en cada pocillo.
- Cambie medio diario del 3 al 4 díass hasta que las colonias alcanzan 80 a 90% de confluencia.
- Para pases de células: aclarar las colonias con D-PBS dos veces, el tratamiento de las células con 1 ml de 2 mg / ml dispasa a 37 ° C durante 15 a 20 minutos, y de sedimentos y de paso de células en forma de grumos.
- Para la cultura NCM: repita los pasos 3.1 a 3.9 describen en el Protocolo 2.
5 Protocolo 4:. NCM Cultura de hPSCs sobre LN-521
- Descongelar la solución recombinante LN-521 a 4 ° C antes de que el día de uso y hacer que la solución de revestimiento laminina (LCS) diluyendo la laminina descongelado con 1X D-PBS (que contiene Ca 2 + / Mg 2 +) a una concentración final de 10 g / ml.
- Añadir 1 ml de la LCS a un pocillo de placa de 6 pocillos (nota: evitar en seco durante el proceso de recubrimiento).
- Sellar la placa recubierta con Parafilm para evitar la evaporación y almacenar el plato en el refrigerador (4 ° C) O / N (nota: utilizar la placa dentro de 1 semana).
- Retire con cuidado los LCS con una pipeta Pasteur y sin queuching la superficie recubierta y añadir 2 ml de medio mTeSR1 a un pocillo.
- Calentar todas las soluciones de cultivo (incluyendo D-PBS) en un baño de agua a 37 ° C durante 25 min.
- Convertir colonias HPSC a NCM
- Disociar agregados celulares de células individuales con Accutase como se describe en el Protocolo 2.
- Semillas 1,3-2 x 10 6 hPSCs en una sola LN-521 con revestimiento de pozo (1.4 a 2.1 x 10 5 células / cm 2), sin la presencia de inhibidores de ROCK.
- Cambio de medio al día durante 3 a 4 días.
- Disociar las células en 1 ml de Accutase en el día 3 o 4 para la próxima pases de células utilizando una relación de división de 1 a 3.
. 6 Protocolo 5: NCM cultura para el ADN plásmido transfección
- Adaptar colonias HPSC a la cultura NCM como se describe en los Protocolos 2 a 4.
- Placa disociado hPSCs en placa de 12 pocillos con una densidad celular de 7,5 x 10 5 células / pocillo en medio mTeSR1 en presencia de 10 mM de Y-27632.
- Reemplace medio mTeSR1 con medio mTeSR1 libre de drogas entre 4-8 horas después de la siembra de las células.
- Para cada transfección, diluir 2,5 g de plásmidos de expresión (por ejemplo, pmaxGFP) y 5 l de Lipofectamine 2000 en tubos Eppendorf separados en 125 l de cada uno de Opti-MEM medio de suero reducido.
- Después de 5 min, mezclar los reactivos diluidos y se incuba durante 20 min a TA (para formar complejos de transfección).
- Agregue los complejos de transfección mu l 250 a cada pocillo que contiene hPSCs en 1 ml de medio mTeSR1 e incubar las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 24 horas.
- Examinar la eficacia de la transfección con un microscopio de fluorescencia y la fotografía al azar para el cálculo de la eficiencia de transfección real.
. 7 Protocolo 6: NCM Cultura para la transfección de microARNs
- Disociar hPSCs semi-confluentes en el día 2, en condiciones NCM añadiendo 1 ml de Accutase por pocillo en 6 Y placa.
- Añadir 10 ml de medio mTeSR1 para diluir las reacciones enzimáticas y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
- Resuspender el sedimento celular con medio mTeSR1, sembrar las células a una densidad de 7,5 x 10 5 células por pocillo en una placa de 12 pocillos en un medio que contiene 10 mM mTeSR1 Y-27632, y dejar que las células se adhieren durante 4 horas.
- Sustituya el medio con medio Y27632 libre mTeSR1.
- Utilice disponible comercialmente microRNAs (por ejemplo, un miRIDIAN miRNA control de transfección no dirigido etiquetado con Dy547). Valorar concentraciones que van desde 0 hasta 160 nM usando los reactivos proporcionados y siga las instrucciones del fabricante.
- Optimizar la eficacia de transfección para cada concentración en líneas HPSC por imágenes de la fluorescencia Dy547 de las células vivas con un microscopio a las 24 horas después de la transfección.
- Cálculo de las eficiencias de transfección basados en el porcentaje de células positivas Dy547 sobre todas las células de imágenes.
- Repita los pasos 7.1 a 7.4 del Protocolo 6.
- Calcule las cantidades de partículas virales que se utilizarán para la transducción: Utilice la siguiente fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, mientras que TU denota el número total de unidades de transformación, MOI es igual a la multiplicidad deseada de la infección en el pozo (MOI o TU / célula), CN especifica el número de células en cada pocillo, y VT indica los títulos virales de archivo (TU / ml). Por ejemplo, dado que los títulos virales de acciones para SMART-shRNA vector es igual a 1 x 10 9 TU / ml (unidades de transformación por ml), 7,5 x 10 5 células por pocillo en el momento de la transducción, y una MOI esperado de 20: uso de 15 l de las partículas virales de valores para cada bien (nota: se recomienda esta condición para la inducción lentiviral transitorio).
- Pre-caliente 300 l de medio de mTeSR1 con 10 mg / ml de polibreno durante 30 min.
- Añadir 15 l de partículas virales de acciones enel medio mTeSR1 precalentado que contiene polibreno y mezclar suavemente la solución.
- Reemplazar el medio de cultivo celular con 300 l de medio precalentado que contienen las partículas virales.
- Después de 4 horas de incubación, examinar turboGFP fluorescencia (una máquina para la expresión shRNA) para determinar la eficacia de la transducción.
- Añadir 300 l de medio de mTeSR1 adicional a la transducción bien cuando las células comienzan a expresar turboGFP.
- Después de 12-16 horas de incubación, examinar de nuevo la expresión turbo-GFP.
- Lleve a cabo los experimentos de seguimiento deseados con estas células transducidas dentro de 72 horas.
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Representative Results
Un esquema general de la cultura NCM
La figura 1 representa un esquema típico de la cultura NCM que muestra los cambios dinámicos de hPSCs después de alta densidad de placas de una sola célula en presencia del inhibidor de Rock y-27632. Estos cambios morfológicos incluyen conexiones intercelulares después de la siembra, la formación de grupos celulares, y el crecimiento celular exponencial seguida de la condensación de células (Figura 1A). Un experimento representativo indica WA01 (H1) hESCs, revestidos como células individuales en una densidad de 1,9 x 10 5 células / cm 2 en presencia de 10 mM de Y-27632 en el día 1 (Figura 1B, panel izquierdo), propagado sin la formación de colonias (Figura 1B, panel central) en el día 2, y se condensa como una monocapa homogénea que es adecuado para los experimentos deseados o para los pases de células en el día 3 (Figura 1B, panel derecho).
<> Varios inhibidores de ROCK fuertes apoyan la cultura NCM
Un ensayo de placa de 96 pocillos se utilizó para la prueba de concepto de detección de drogas de alto rendimiento. También fue diseñado para optimizar el uso de varios inhibidores de ROCK para apoyar la cultura NCM. Aproximadamente, 31.000 células disociadas SCU-i10, células pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSCs) 17, se sembraron en uno de Matrigel recubiertos bien en presencia de diferentes concentraciones de inhibidores de ROCK. Después de 24 h, las células se sometieron a la ensayo de supervivencia basada en la CCK-8 para determinar la supervivencia celular en estas condiciones. Hemos demostrado previamente que el método NCM requiere el uso del inhibidor de ROCK, Y-27632, en 10 mM para mejorar chapado de una sola célula. En este informe, se confirmó que el 10 M Y-27632 aumentó significativamente de 24 horas enchapado eficiencia de hiPSCs una sola célula (P <0,05) (Figura 2). También se encontró que Y-39983 (ROCK I inhibidor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibicióntor) y thiazovivin (un inhibidor de la ROCA novela) modulan significativamente eficiencia en placas de una sola célula y promover el crecimiento NCM a 1 M en comparación con sus controles (p <0,05) (Figura 2). Por otra parte, los efectos de los tres inhibidores de ROCK (a 1 M) en eficiencia de plaqueo de una sola célula fueron comparables a la de Y-27632 en 10 mM (p> 0,05) (Figura 2). En particular, la roca que el inhibidor (en 5 M) parece mostrar citotoxicidad pronunciada en comparación con el fármaco a 1 M (P <0,05), lo que implica una interacción más específica que otras moléculas. Por lo tanto, varios inhibidores de ROCK pueden ser utilizados para apoyar la cultura NCM en el futuro. Sin embargo, una caracterización completa de ambos hESCs y hiPSCs bajo NCM con estos nuevos inhibidores se requeriría para su uso futuro.
LN-521 soporta la cultura NCM sin el uso de inhibidores de ROCK
Para determinar tl papel de una isoforma de laminina específica para apoyar el crecimiento células madre, que cultivó hiPSCs SCU-i30 en placas recubiertas con LN-521 en el medio-xeno libre TeSR2. Curiosamente, solo LN-521, sin la presencia de inhibidores de ROCK, apoya chapado de una sola célula y el crecimiento NCM subsiguiente para 15 pasajes en estas condiciones (Figura 3). La inmunotinción de células de SCU-i30 con un anticuerpo policlonal anti-NANOG indicado que las células bajo esta condición tenían alta expresión de NANOG en los núcleos (Figura 3A). Análisis de citometría de flujo mostró que el perfil de expresión de marcador células madre fue similar a las células cultivadas como Ncm utilizando el inhibidor de Rock y-27632 (Figura 3B).
Alta eficiencia en la prestación de microARN y sin el uso de partículas lentiviral
La transfección con microRNAs oligonucleótidos marcadas-Dy547 se llevó a cabo en las células WA01 (H1) en condiciones NCM. HESCs WA01 se cultivaron como NCM en 2,5% de Matrigel en mTeSR1 para 2 (Figura 4A) y 18 (Figura 4B) pasajes respectivamente. Estas células mostraron una alta horas después de la transfección transfección eficiencia 24 (Figuras 4A y 4B). En general, se puede obtener la transfección eficiencia de hasta el 91% en hESCs a las 24 horas después de la transfección.
Figura 1. (A) Esquema de la cultura NCM. El gráfico de líneas que delinea los cambios dinámicos de la asociación multicelular en un típico cultivo de 3 días bajo condiciones de NCM. (B) imágenes de fase representativos de WA01 (H1) hESCs propagados bajo condiciones NCM en el 2,5% de Matrigel en medio mTeSR1 de 16 pasajes (designados como WA01, mcp16). El panel inferior es la vista ampliada del panel superior. Las barras de escala indican 100 micras.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ensayos de supervivencia de células individual utilizando un formato de 96 pocillos. Aproximadamente, 31.000 hiPSCs SCU-i10 17 se sembraron en 2,5% de Matrigel en presencia de varios inhibidores de moléculas pequeñas relacionadas con la quinasa asociada a Rho (ROCK) vías a las concentraciones indicadas . Después de 24 h, las células se sometieron a la ensayo de supervivencia de CCK-8 mediante la medición de la absorbancia a 450 nm (A450). Se utilizó el test t de Student para determinar si las diferencias en la eficiencia de plaqueo de célula única entre varios inhibidores de ROCK son de significación estadística. El signo asterisco singular (*) indica que no hay diferencias significativas entre los inhibidores (P & #62; 0,05), mientras que los dos signos de asterisco (**) denota la diferencia observada es de significación estadística (P <0,05). Las columnas de los histogramas designan los valores medios de los factores determinantes y las barras representan desviaciones estándar por cuadruplicado.
Figura 3. Cultura NCM de hiPSCs en laminina-521 (LN-521) sin la presencia de inhibidores de ROCK. La línea hiPSC SCU-i30 se estableció en el NIH Stem Unidad Móvil. Células de SCU-i30 se cultivaron en placas de 6 pocillos recubiertas-LN-521 en el medio libre de xeno-TeSR2 para 15 pasajes sin el uso de inhibidores de moléculas pequeñas tales como inhibidores de ROCK. (A) La inmunotinción de células de SCU-i30 con un anti -NANOG anticuerpo policlonal y counterstained con Hoechst 33342 (Hoechst). En particular, algunas células que tienen una tinción negativa NANOG son thcélulas e En la mitosis. (B) Análisis de citometría de flujo de HPSC la expresión del marcador en las células de SCU-i30 cultivadas como NCM en 2,5% de Matrigel con el uso de 10 mM de Y-27632 (panel superior) o NCM en LN-521 sin Y-27632 (panel inferior). Los procedimientos para la inmunotinción y el análisis de citometría de flujo fueron descritas anteriormente 5. Las barras de escala representan 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cultura NCM de hPSCs para microRNA transfección. WA01 hESCs fueron cultivadas como NCM en el 2,5% en Matrigel mTeSR1 para 2 (A) y 18 (B) pasajes, respectivamente. De fase y fluorescencia Imágenes representativas de células transfectadas con WA01 Dy547-etiquetados microRNAs de control para el seguimiento de la eficacia de transfección a las 24 horas después de la transfección. Las barras de escala representan 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay dos formas principales para hPSCs de cultivo in vitro: cultura convencional de tipo colonia (de las células en los comederos o matrices extracelulares) y de cultivo en suspensión de hPSCs como agregados sin alimentadores 6. Las limitaciones de los métodos de cultivo, tanto de tipo colonia y suspensión incluyen la heterogeneidad acumulada y los cambios epigenéticos heredables. Cultura NCM, basada tanto en los pases de una sola célula y de las planchas de células de alta densidad, representa un nuevo método de cultivo para el crecimiento HPSC 6,18. Aunque varios métodos pases de una sola célula se han documentado en la literatura, pero ninguno de ellos se utilizan para la propagación de rutina. Por ejemplo, Wu y colegas emplearon un método de pases de una sola célula para estudiar los efectos de diversos cócteles pequeñas moléculas sobre el crecimiento HPSC 19. Sin embargo, sus productos finales del cultivo son colonias. Por lo tanto, los métodos de los pases de una sola célula de bajas a base de densidad todavía pertenecen al tipo colonia cultura. En lo que respecta a la cultura NCM, las altas guaridaschapado dad transforma esta cultura a un nuevo método, ya que el producto final de células es una monocapa homogénea. Recientemente, Dvorak y sus colegas usaron un método similar para analizar exhaustivamente las propiedades HPSC bajo esta condición el crecimiento 18. Sus resultados también apoyan nuestras conclusiones principales. Ahora está claro que la cultura NCM es un método emergente que posee varias propiedades nuevas y se puede modificar más lejos para muchas aplicaciones potenciales en la biología de células madre pluripotentes.
Propiedades básicas de hPSCs de cultura NCM
Es concebible que hPSCs bajo NCM cultura comparten muchas características con los mismos tipos de células cultivadas como colonias 9,18. Los niveles de expresión de marcadores de células madre en hPSCs, que incluyen Oct-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, y SSEA-1, son similares en ambos NCM y de tipo colonia cultura . Células adaptadas-NCM también retienen los patrones de expresión de ARNm globales similares a las colonias cultivadas en HPSC MEF capas de alimentación 9. Claramente, las células adaptadas-NCM sostener el estado pluripotente como se determina por el ensayo de teratoma 9,18. Sin embargo, a diferencia de colonias HPSC, células bajo condiciones NCM tienen una tasa de crecimiento predecible que se caracteriza por las curvas de crecimiento, consistentes ciclos celulares, y el número de células 9. Debido a la alta densidad de placas de una sola célula, hPSCs en condiciones NCM exhiben crecimiento exponencial entre los días 2 y 4 (Figura 1B), lo que aumenta el número de células por 4 veces en comparación con colonias HPSC cultivadas en MEFs. Cultivo prolongado no aumenta la producción de células, sino más bien aumenta apoptótica y el estrés diferenciación 9. NCM también permite la criopreservación óptima, lo que permite la recuperación rápida de las células sobre chapado células descongeladas (Protocolo 1). Por otra parte, NCM facilita la adaptación de la cultura HPSC a varios protocolos de xeno libre 9. En general, NCM apoya el crecimiento de hPSCs, mantiene el estado pluripotente, y sostiene el potencialcial de hPSCs a diferenciarse en tejidos adultos de las tres capas germinales.
Estabilidad cromosómica en hPSCs bajo NCM
En términos de la estabilidad cromosómica, no hay comparación directa entre las células de diferentes métodos de cultivo. La mayoría de los hPSCs bajo nuestras condiciones de cultivo NCM tienen cariotipos normales y el número de copias de genes según lo determinado por el Grupo de anillamiento, la serie basada en la hibridación genómica comparada (aCGH), y la hibridación in situ fluorescente (FISH) 9. Dos líneas (~ 13%) mostraron cariotipos anormales, en el que una línea (es decir, WA09) exhibido poliploidía elevada y otro (ES01) tenía 14% de las células con trisomía 20 9. No está claro si estos cariotipos anormales se derivaron de la selección de células preexistentes mutadas antes de la cultura NCM o inducidos durante NCM adaptación. Es importante que las colonias HPSC de partida o subconjunto de colonias utilizan para NCM cultura SHould ser bien caracterizada en términos de su homogeneidad y la estabilidad cromosómica en el tiempo para la adaptación NCM. En particular, la tasa de cariotipos anormales en condiciones NCM es mucho menor que la reportada en un análisis de cohorte reciente, en el que los autores revelan 34% cariotipos anormales en condiciones de cultivo de tipo colonia predominantes 20. Por lo tanto, nuestro estudio indica que podemos crecer células individuales disociados y mantener su estabilidad cromosómica en condiciones NCM. Sin embargo, también tenemos que utilizar métodos más sensibles para examinar anormalidades cromosómicas de hPSCs en los próximos años. En particular, tenemos que analizar los cromosomas 1, 12, 17 y 20 el uso de sondas de mayor resolución (es decir, <50 kb), ya que algunas lesiones de menor importancia (por ejemplo, la amplificación 20q11.21) en estos cromosomas alterados con frecuencia no pueden ser detectados por el convencional cariotipo y FISH 20-22. Por otra parte, el desarrollo de diversos protocolos NCM nos permitiría identificar robuª y métodos seguros para aplicaciones futuras.
Cultura NCM bajo diversas modificaciones
El uso del inhibidor de ROCK, Y-27632, ha abierto la puerta para ensayos basados en células individuales. La disponibilidad de inhibidores de ROCK diversos sería proporcionar opciones adicionales para la expansión a base de NCM y la crioconservación de hPSCs (Figura 2). En teoría, cualquier molécula pequeña, que puede aumentar significativamente la eficiencia de chapado de una sola célula, se puede utilizar para facilitar la cultura NCM. JAK inhibidor 1, que funciona de forma diferente a partir de los inhibidores de ROCK, representa un ejemplo 9. El uso de moléculas individuales o enfoques combinatorios puede proporcionarnos un óptimo crecimiento celular, ensayos celulares y criopreservación de hPSCs. Sin embargo, la cultura alternativa NCM de hPSCs en proteínas de matriz extracelular definidos, tales como la isoforma laminina LN-521, normalmente expresada en hESCs 23-25, puede eliminar la interferencia de pequeñamoléculas (Figura 3). LN-521 podría mejorar la supervivencia disociado-HPSC y sostiene la pluripotencia a través de la activación de la vía α6β1-PI3K/AKT 24. La simplicidad de hPSCs pases con LN-521 reduce la heterogeneidad de las células, compatible con distintos sistemas de cultivo de células libres de alimentador y xeno gratis utilizando medio completamente definido (Protocolo n º 4). También proporciona un módulo adicional para ensayos de alto rendimiento y sin la influencia de pequeñas moléculas. Aunque las iPSCs en cultivo NCM sobre LN-521 retienen la expresión de un panel de marcadores HPSC, una mayor caracterización de estas células por medio de ensayo y teratoma embrioide diferenciación multilinaje cuerpo mediada que sean necesarias para confirmar los estados pluripotentes en estas células. Es de destacar que hiPSCs cultivados en la isoforma laminina LN-521 son los informes, citogenéticamente estable (http://biolamina.com/). Sin embargo, también tenemos que aplicar métodos de resolución más alta y sensibles (como se mencionó anteriormente) aeXAMINE la estabilidad cromosómica en estas células.
La versatilidad de la cultura NCM para la ingeniería genética
Métodos basados en NCM representan un sistema simple, robusta, económica y que puede ser particularmente útil para la manipulación genética de hPSCs (Protocolos 5-7). Se sabe que las colonias de células madre son difíciles de transfectar o transducir, con una gran variabilidad en la eficiencia de la transfección / transducción de entre diferentes laboratorios 26-28. Por ejemplo, la eficiencia de transfección en hESCs varía de 3 a 35% en condiciones de cultivo de colonias 26. No se encontraron señales de transducción lentiviral en células BG01 en condiciones de colonias a ser extremadamente baja 9. Sin embargo, la eficiencia de la transfección mediada por NCM fue mayor que 75% 9 y la modificación de los métodos de transducción puede aumentar la eficiencia de transducción de lentivirus mediada por hasta un 90% 28. Un estudio comparativo ajustado ha revelado que es the asociaciones multicelulares en colonias hESC que contribuyen a la baja eficiencia de transfección 9. Además, hemos modificado recientemente un protocolo de transfección de microARN y son capaces de lograr una alta eficiencia de transfección (~ 91%) sin el uso de lentivirus (Protocolo 6 y Figura 4). Este protocolo es fácil de usar y particularmente útil para experimentos de transfección transitoria dentro de un 3 - a marco de tiempo de 5 días. Como delineamos en los protocolos anteriores, varios factores deben ser tomados en consideraciones cuando optimizamos la eficiencia de transfección / transducción en hPSCs. Estos factores incluyen la densidad celular, las concentraciones de plásmido, los títulos de lentivirales, multiplicidad de infección (MOI), la duración de la transfección / transducción, la citotoxicidad de los reactivos, y los métodos utilizados para la eficiencia de transfección de supervisión / transducción.
Elaboramos y extendemos métodos NCM a hPSCs cultura en Matrigel y en las matrices extracelulares definidos. Este método de cultivoes una forma eficaz para eliminar la heterogeneidad que se encuentra comúnmente en la colonia HPSC y culturas agregados. Las células madre pluripotentes humanas en condiciones de crecimiento NCM son pluripotentes y cromosómicamente estable. Este sistema de cultivo novela es simple y versátil para el mantenimiento HPSC, expansión a gran escala, y las manipulaciones genéticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
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