Introduction
La capacità di hPSCs di differenziare verso tessuti adulti multilineage ha aperto nuove strade alla cura dei pazienti che soffrono di malattie gravi che coinvolgono cardiovascolare, epatico, pancreatico e sistemi neurologici 1-4. Vari tipi di cellule derivate da hPSCs sarebbe anche fornire piattaforme cellulari robuste per la modellazione della malattia, l'ingegneria genetica, screening di farmaci e test tossicologici 1,4. La questione chiave che assicura loro applicazioni cliniche e farmacologiche futuri è la generazione di un gran numero di hPSCs clinico-grade in coltura cellulare in vitro. Tuttavia, i sistemi di coltura attuali sono insufficienti o intrinsecamente variabile, che coinvolge vari alimentazione e senza alimentatore culture del hPSCs come colonie 5,6.
Colony-tipo crescita delle quote hPSCs molte caratteristiche strutturali della massa cellulare interna (ICM) di embrioni di mammiferi. L'ICM è incline a differenziarsi in tre strati germinaliin un ambiente multicellulare causa dell'esistenza di gradienti di segnalazione eterogenei. Pertanto, l'acquisizione di eterogeneità in sviluppo embrionale precoce è considerata come un processo necessario per la differenziazione, ma una caratteristica indesiderata della cultura HPSC. L'eterogeneità nella cultura HPSC è spesso indotto da eccessivi segnali apoptotici e differenziazione spontanea a causa di condizioni di crescita ottimali. Così, in colonia-tipo coltura, le cellule eterogenee si osservano spesso nella periferia delle colonie 7,8. È stato anche dimostrato che le cellule in cellule staminali embrionali umane (hESC) Colonie risposte differenziali Esporre a molecole di segnalazione come BMP-4 9. Inoltre, metodi di coltura colonia producono produzioni di cellule basse così come i tassi di recupero molto bassi cellulare da crioconservazione a causa di tassi di crescita incontrollabili e segnale apoptotico Percorsi di 6,9. Negli ultimi anni, diverse culture sospensioni sono state sviluppate per hPSCs coltura, soprattarly per l'espansione di grandi quantità di hPSCs in-e alimentatore condizioni prive di matrice 6,10-13. Ovviamente, diversi sistemi di coltura hanno i loro vantaggi e svantaggi. In generale, l'eterogeneità hPSCs rappresenta uno dei principali inconvenienti di tipo colonia e cultura aggregato metodi, che sono ottimali per la consegna di DNA e RNA materiali in hPSCs per l'ingegneria genetica 6.
Chiaramente, vi è la necessità imperativa di sviluppare nuovi sistemi che aggirano alcune carenze delle attuali metodi di coltura. Le scoperte di piccoli inibitori della molecola (come l'inibitore ROCK Y-27632 e JAK inibitore 1) che migliorano la sopravvivenza a cella singola spianare la strada per dissociato-HPSC cultura 14,15. Con l'uso di queste piccole molecole, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura in base al tipo non-colonia (NCM) crescita di dissociate-hPSCs 9. Questo metodo di coltura romanzo combina passaging cella singola e ad alta densitàplaccatura metodi, che ci permette di produrre grandi quantità di hPSCs omogenee sotto cicli di crescita costante senza grandi anomalie cromosomiche 9. In alternativa, cultura NCM potrebbe essere implementato con diverse piccole molecole e matrici definite (quale laminine) al fine di ottimizzare il metodo di coltura per le applicazioni di larghezza. Qui vi presentiamo diversi protocolli dettagliati basato sulla cultura NCM e delineare le procedure dettagliate per l'ingegneria genetica. Per dimostrare la versatilità dei protocolli di NCM, abbiamo provato anche la cultura NCM con inibitori ROCK diversi e con il singolo laminina isoforma 521 (vale a dire, LN-521).
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Protocol
Basato Single-cell di tipo non-colonia monostrato (NCM) cultura della hPSCs.
1. Preparativi
- Rendere 500 ml di terreno per la cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF): medie DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, e 0,1 mm aminoacidi non essenziali (NEAA).
- Isolare fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule derivate dal ceppo CF1 a seguito di un protocollo di routine 16 e cultura MEF sul 0,1% di gelatina rivestite 6-pozzetti di coltura cellulare in DMEM. In alternativa, l'acquisto di azioni del MEF al passaggio 3 da risorse commerciali.
- Preparare piatti Matrigel.
- Diluire 5 ml di hESC qualificati Matrigel magazzino con 5 ml di DMEM/F12 medio (raffreddato a ~ 4 ° C) e conservare il 50% aliquote in una -20 ° C freezer. Scongelare ghiacciato Matrigel magazzino in frigorifero (~ 4 ° C) O / N e diluire ulteriormente la Matrigel in mezzo DMEM/F12 freddo (per dare luogo ad una concentrazione di lavoro 2,5%).
- Rimuovere la piastra Matrigel dal frigorifero, lasciare che la piastra si riscaldi a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare per 10-30 min (Nota: non scaldare la piastra in un incubatore coltura cellulare), e aspirare DMEM prima della placcatura hPSCs.
- Rendere 500 ml mezzo hESC: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM L-glutammina, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, e 4 ng / ml di FGF-2.
- Preparare 10 ml di 2X HPSC medio di congelamento: 60% FBS, 20% DMSO e 20 mM Y-27632 in mTeSR1 mezzo, sterilizzare per filtrazione, e utilizzare il mezzo entro 1 settimana.
. 2 Protocollo 1 (Elementare): Grow HPSC Colonie su Alimentatori
- Utilizzare numeri passaggio MEF a 5 o 6 (designato come p5 e p6) per cultura HPSC per vedere Resul coerentets. Mitoticamente inattivare MEF trattando le cellule con 10 pg / ml mitomicina C per 3 ore a 37 ° C, lavare le cellule 3x con di 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS), e poi si dissociano MEF con 0,05% tripsina in 0,53 mM EDTA. In alternativa, irradiare MEF alla dose di 8.000 rad considerando un irradiatore a raggi X.
- Contare il numero di cellule utilizzando il metodo di esclusione del Trypan Blue macchia sotto microscopio. In alternativa, utilizzare un contatore automatico cella.
- Piastre MEF irradiati su lastre di polistirene 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina ad una densità di 1,88 x 10 5 cellule per pozzetto (cioè, 1,96 x 10 4 cellule / cm 2). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
- Rimuovere il terreno di coltura MEF per aspirazione con una pipetta Pasteur (Nota: nessun fasi di lavaggio necessari in questo momento).
- Triturare HPSC colonie dalla cultura precedente in piccoli ciuffi, esaminano i grumi sotto il microscopio per assicurare loro dimensioni variano from 50 a 100 micron di diametro, e piastra ciuffi HPSC sulla cima MEF strati feeder in un pozzetto contenente 2 ml di HPSC medie.
- Cambiare hESC mezzo al giorno per 3 a 5 giorni, record di crescita colonia fotografia, contrassegnare tutte le colonie morfologicamente alterati o differenziati (~ 5%), e rimuovere manualmente le colonie contrassegnati con delicatezza aspirazione con una pipetta Pasteur.
- Risciacquare le restanti colonie MEFs due volte (2 min ciascuno con D-PBS), e incubare le colonie con 2 ml di 1 mg / ml di collagenasi IV in HPSC medio per 10 a 30 minuti), ed esaminare il distacco delle colonie HPSC dal MEF superficie rivestita (Nota: utilizzare un raschietto per aiutare il processo di distacco solo se le colonie sono strettamente collegati alla piastra).
- Aggiungere 5 ml di HPSC mezzo a ciascun pozzetto per minimizzare le reazioni enzimatiche, trasferimento colonie ad una provetta da 15 ml, permettere colonie HPSC sedimentare per 3 a 5 minuti a temperatura ambiente, e garantire la sedimentazione delle colonie tramite visualizzazione diretta del cells nella parte inferiore del tubo (Nota: non centrifugare la provetta in questa fase).
- Rimuovere il surnatante contenente MEF residue e dissociato singole cellule, risospendere le colonie con 5 ml di hESC medie, e ripetere l'operazione di sedimentazione due volte.
- Rimuovere le medie, triturare colonie HPSC in piccoli ciuffi, negozio in 1X HPSC congelamento medio (o CryoStore CS10 mezzo congelamento) per la crioconservazione (1 confluente bene per fiala congelata) o piastra su un 6-pozzetti per passaging cellulare.
3 Protocollo 2:. Convertire HPSC colonie da alimentatori a NCM
- Sciacquare pellets HPSC in D-PBS una volta, incubare il pellet con 1 ml di 1X Accutase per 10 minuti, ed esaminare la reazione enzimatica sotto un microscopio per assicurare dissociazione singola cellula.
- Terminate le reazioni enzimatiche da risospendere delicatamente le cellule in 5 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 seguito da centrifugazione a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min(Nota, non utilizzare eccessive forze di centrifugazione che causano danni alle cellule).
- Aggiungere 5 ml di mTeSR1 mezzo al pellet, risospendere il pellet come singole cellule, e filtro dissociato cellule attraverso un colino cella 40 pm (per eliminare eventuali aggregati di cellule residue).
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs in un pozzetto (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) di un 6-pozzetti rivestiti con 2,5% hESC qualificato Matrigel, aggiungere mTeSR1 medio fino a 2,5 ml, e comprendono 10 micron Y-27632 nel mezzo (per facilitare il 24 hr placcatura singola cellula iniziale). In alternativa, utilizzare le seguenti piccole molecole di sostituire 10 micron Y-27632 per migliorare la placcatura unicellulare: 1 micron Y-39983 (ROCK I inibitore), 1 mM phenylbenzodioxane (inibitore ROCK II), 1 micron thiazovivin (un inibitore ROCK romanzo) , e inibitore JAK 2 mM 1.
- Sostituire il mezzo con drug-free medio mTeSR1 il giorno successivo (entro 24 ore), dissociare le cellule da uno in piùbene, e contare il numero di cellule per determinare singola cellula efficienza placcatura (Nota: approssimativamente, dal 50 al 90% della singola cellula placcatura di efficienza che può essere raggiunto in questa fase).
- Permettono alle cellule di crescere come una cellula formata singolo monostrato per alcuni giorni con 3 ml di mTeSR1 medie. Cambiare medio giornaliero.
- Determinare empiricamente la pianificazione per passaging adattato NCM seconda della densità cellulare. Passage quando la crescita delle cellule raggiunge confluenza al giorno 3 o 4 ° giorno, o al punto di tempo 4 ore dopo la scomparsa dei confini cellula-cellula. Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase, utilizzare un 1 a 3 rapporto di splittaggio (cioè, 1 confluenti ben di cellule piastrate in 3 pozzetti della piastra da 6 pozzetti) per passaging cella, e stabilizzare adattato NCM da 5 passaggi.
- Il congelamento delle cellule
- Utilizzare un pozzetto confluenti (~ 5-6 x10 6 cellule) per una fiala congelata: dissociare celle da una confluenti bene con 1 ml di Accutase per 10 min.
- Diluire wesima 5 ml di mTeSR1 medie e centrifugare le cellule come descritto sopra.
- Risospendere il pellet in 500 ml di mTeSR1 medio e poi aggiungere lentamente 500 ml di 2X HPSC medio di congelamento (contenenti 20 micron Y-27632) in un flaconcino di crioconservazione. In alternativa, risospendere le cellule in 1X HPSC medio congelamento contenenti inibitore JAK 2 mM 1 o 1X CryoStor CS10 medio in presenza di 10 pM o Y-27632 o 2 inibitore JAK 1 mM.
- Mettere fiale congelate in un cryocontainer ghiaccio freddo (bottom-riempita con isopranol) e trasferire il cryocontainer ad un -80 ° C freezer immediatamente.
- Trasferire le cellule dal -80 ° C congelatore ad un serbatoio di azoto liquido (il giorno successivo) per la crioconservazione a lungo termine.
- Scongelamento delle cellule
- Utilizzare un flaconcino crioconservazione per la placcatura 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
- Pre-riscaldare medio mTeSR1 in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min, cellule disgelo nella stessa bagnomaria per 2 min,goccia a goccia aggiungere celle a 5 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 contenenti 10 mM Y-27632, e centrifuga come sopra descritto.
- Risospendere delicatamente i pellet cellulari con 2 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 e lentamente trasferire cellule ad una ben pre-rivestito con Matrigel (Nota: evitare di produrre bolle d'aria).
- Cambia medio giornaliero e si aspettano una crescita HPSC raggiungere confluenza al giorno 3 o 4.
4 Protocollo 3:. Convertire HPSC colonie su Matrigel per NCM Cultura
- Rimuovere un piatto Matrigel rivestite da frigorifero, posizionare la piastra nella cappa coltura tissutale da 10 a 30 minuti, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra, e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 a ciascun pozzetto.
- Trasferimento triturato ciuffi HPSC dalla cultura alimentatore (Passo 2.10 del protocollo di base) alla piastra sopra Matrigel. Aggiungi mTeSR1 medio fino a 2,5 ml di volume finale in ogni pozzetto.
- Cambiare mezzo al giorno per 3 a 4 giornis fino colonie raggiungono l'80-90% di confluenza.
- Per passaging cella: sciacquare le colonie con D-PBS due volte, trattare le cellule con 1 ml di 2 mg / ml dispasi a 37 ° C per 15 a 20 minuti, e sedimenti e passaggio cellule come grumi.
- Per la cultura NCM: ripetere i passaggi 3,1-3,9 descritto nel protocollo 2.
5 Protocollo 4:. NCM Cultura della hPSCs su LN-521
- Scongelare il ricombinante soluzione LN-521 a 4 ° C prima del giorno di utilizzo e rendere la soluzione di rivestimento laminina (LCS) diluendo la laminina scongelato con 1X D-PBS (contenente Ca 2 + / Mg 2 +) ad una concentrazione finale di 10 ug / ml.
- Aggiungere 1 ml di LCS da un pozzetto in 6 pozzetti (nota: evitare a secco durante il processo di rivestimento).
- Sigillare la piastra ricoperta con Parafilm per evitare l'evaporazione e conservare il piatto in frigorifero (4 ° C) O / N (nota: utilizzare la piastra entro 1 settimana).
- Rimuovere delicatamente le LCS con una pipetta Pasteur, senza peruching la superficie rivestita e aggiungere 2 ml di mTeSR1 mezzo ad un pozzetto.
- Riscaldare tutte le soluzioni di coltura (inclusi D-PBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per 25 min.
- Convertire colonie HPSC a NCM
- Dissociare aggregati cellulari alle celle singole con Accutase come descritto nel protocollo 2.
- Seme circa 1,3-2 x 10 6 hPSCs in uno LN-521 rivestita di (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) senza la presenza di inibitori ROCK.
- Cambiare mezzo al giorno per 3-4 giorni.
- Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase al giorno 3 o 4 per il prossimo passaging cellulare utilizzando un 1 a 3 rapporto di splittaggio.
. 6 Protocollo 5: NCM cultura per il plasmide DNA Transfezione
- Adattare le colonie HPSC alla cultura NCM come descritto nei protocolli 2-4.
- Piatto dissociata hPSCs a 12-pozzetti con una densità cellulare di 7,5 x 10 5 cellule / pozzetto in mTeSR1 medio in presenza di 10 mM Y-27632.
- Sostituire mTeSR1 media con drug-free mTeSR1 medio tra 4-8 ore dopo la placcatura le cellule.
- Per ogni trasfezione, diluire 2,5 mg di plasmidi di espressione (ad esempio, pmaxGFP) e 5 ml di Lipofectamine 2000 in provette Eppendorf separati in 125 ml ciascuna di Opti-MEM Ridotto Serum Medium.
- Dopo 5 min, miscelare i reagenti diluito e incubare per 20 min a temperatura ambiente (per formare complessi trasfezione).
- Aggiungere 250 microlitri complessi trasfezione per ciascun pozzetto contenente hPSCs in 1 ml mTeSR1 medio e incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 ore.
- Esaminare l'efficienza di trasfezione sotto un microscopio a fluorescenza e fotografia casualmente per il calcolo della effettiva efficienza di trasfezione.
. 7 Protocollo 6: NCM cultura per trasfezione di microRNA
- Dissociare hPSCs semi-confluenti al giorno 2 in condizioni NCM con l'aggiunta di 1 ml di Accutase per pozzetto in 6 -Pozzetti.
- Aggiungere 10 ml di mTeSR1 mezzo per diluire le reazioni enzimatiche e centrifugare a 200 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare con mTeSR1 medio, seminare le cellule ad una densità di 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra 12 pozzetti in mTeSR1 terreno contenente 10 mM Y-27632, e lasciare che le cellule attaccano per 4 ore.
- Sostituire il mezzo con Y27632-libera mTeSR1 medie.
- Utilizzare disponibili in commercio microRNA (ad esempio, un non-targeting miRIDIAN miRNA Transfezione controllo etichettato con Dy547). Titolare concentrazioni che vanno 0-160 nM utilizzando i reagenti forniti e seguire le istruzioni del produttore.
- Ottimizzare l'efficienza di trasfezione per ciascuna concentrazione in linee HPSC dal imaging di fluorescenza Dy547 delle cellule vive sotto un microscopio a 24 ore dopo la trasfezione.
- Calcolare le efficienze di trasfezione in base alla percentuale di cellule positive Dy547 su tutte le cellule impressi.
- Ripetere i passaggi 7,1-7,4 del protocollo 6.
- Calcolare la quantità di particelle virali da utilizzare per la trasduzione: Utilizzare la seguente formula: TU = (MOI x CN) / VT, mentre TU indica il numero totale di unità di trasformazione, MOI è uguale alla molteplicità desiderato di infezione nel pozzo (MOI o TU / cell), CN specifica il numero di celle in ogni bene, e VT indica archivi titoli virali (TU / ml). Ad esempio, dato che i titoli azionari virali per SMART-shRNA vettore è uguale a 1 x 10 9 TU / ml (unità di trasformazione per ml), 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto al momento della trasduzione e un MOI previsto di 20: utilizzare 15 microlitri delle particelle virali di archivi per ogni bene (nota: questa condizione è raccomandato per l'induzione lentivirali transitorio).
- Pre-riscaldare 300 ml di mTeSR1 medio con 10 mg / ml di polibrene per 30 min.
- Aggiungere 15 ml di archivi particelle virali inil mezzo mTeSR1 pre-riscaldato contenente polibrene e mescolare delicatamente la soluzione.
- Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 300 ml di mezzo preriscaldata contenenti particelle virali.
- Dopo 4 ore di incubazione, esaminare turboGFP fluorescenza (un creatore di espressione shRNA) per determinare l'efficienza di trasduzione.
- Aggiungere 300 ml di ulteriore mezzo mTeSR1 alla trasduzione bene quando le cellule iniziano a esprimere turboGFP.
- Dopo 12-16 ore di incubazione, riesaminare l'espressione turbo-GFP.
- Effettuare esperimenti di follow-up desiderati con queste cellule trasdotte entro 72 ore.
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Representative Results
Uno schema generale della cultura NCM
Figura 1 rappresenta un tipico schema cultura NCM indica le variazioni dinamiche di hPSCs dopo alta densità di placcatura unicellulare in presenza dell'inibitore ROCK Y-27632. Questi cambiamenti morfologici includono connessioni intercellulari dopo la placcatura, la formazione di cluster cellulari, e la crescita cellulare esponenziale seguita da condensazione cella (Figura 1A). Un esperimento rappresentativo indica WA01 (H1) hESCs, placcato come cellule singole ad una densità di 1,9 x 10 5 cellule / cm 2 in presenza di 10 mM Y-27632 al giorno 1 (Figura 1B, riquadro a sinistra), ulteriormente propagato senza la formazione di colonie (Figura 1B, pannello centrale) al giorno 2, e condensato come un monostrato omogeneo che è adatto per gli esperimenti desiderati o per passaging cella al giorno 3 (Figura 1B, pannello di destra).
<strong> inibitori ROCCIA Varie sostenere la cultura NCM
A 96 pozzetti test piastra è stata utilizzata per proof-of-concept di selezione della droga high-throughput. È stato inoltre progettato per ottimizzare l'uso di vari inibitori roccia per sostenere la cultura NCM. Approssimativamente, 31.000 cellule dissociate SCU-i10, cellule pluripotenti indotte umane (hiPSCs) 17, sono stati piastrati su un Matrigel rivestite bene in presenza di diverse concentrazioni di inibitori della roccia. Dopo 24 ore, le cellule sono state sottoposte alla CCK-8 saggio basato sopravvivenza per determinare la sopravvivenza cellulare in queste condizioni. Abbiamo precedentemente dimostrato che il metodo NCM richiede l'uso dell'inibitore ROCK, Y-27632, a 10 pM che permettono di migliorare placcatura della singola cellula. In questo rapporto, abbiamo confermato che il 10 pM Y-27632 aumentare significativamente la 24 ore singola cellula placcatura efficienza di hiPSCs (P <0.05) (Figura 2). Abbiamo anche trovato che Y-39983 (ROCK I inibitore), phenylbenzodioxane (ROCK II inibizionetor), e thiazovivin (un inibitore ROCK romanzo) modulano significativamente a cella singola efficienza placcatura e di promuovere la crescita NCM a 1 micron rispetto ai loro controlli (p <0.05) (Figura 2). Inoltre, gli effetti dei tre inibitori ROCK (a 1 pM) su unicellulare efficienza placcatura erano paragonabili a quella di Y-27632 a 10 pM (P> 0,05) (Figura 2). In particolare, il ROCK I inibitore (a 5 micron) sembra mostrare citotossicità pronunciato rispetto con il farmaco a 1 micron (p <0,05), che implica un'interazione più specifico di altre molecole. Così, vari inibitori ROCK possono essere usate per sostenere la cultura NCM in futuro. Tuttavia, una caratterizzazione completa di entrambe le hESC e hiPSCs sotto NCM con questi nuovi inibitori sarebbe necessaria per un uso futuro.
LN-521 supporta cultura NCM senza l'uso di inibitori ROCK
Per determinare tha il ruolo di una specifica isoforma laminina nel sostenere la crescita hESC, abbiamo coltivato hiPSCs SCU-i30 su piatti LN-521-rivestite in terreno privo di xeno TeSR2. È interessante notare che, solo LN-521, senza la presenza di inibitori ROCK, supporta placcatura cella singola e la successiva crescita NCM per 15 passaggi in questa condizione (Figura 3). Immunostaining di cellule SCU-i30 con un anticorpo policlonale anti-NANOG indicato che le cellule in questa condizione dovevano alta espressione NANOG nei nuclei (Figura 3A). Analisi citofluorimetrica ha mostrato che il profilo di espressione marcatore hESC era simile alle cellule coltivate come NCM usando l'inibitore ROCK Y-27632 (Figura 3B).
Alta efficienza della consegna microRNA senza l'uso di particelle lentivirali
Trasfezione con oligonucleotidi microRNA Dy547 marcate è stata condotta in (H1) cellule WA01 in condizioni NCM. HESCs WA01 sono state coltivate come NCM su 2,5% Matrigel in mTeSR1 per 2 (Figura 4A) e 18 (Figura 4B) transitano rispettivamente. Queste cellule hanno mostrato alta efficienza di trasfezione 24 ore dopo la trasfezione (Figure 4A e 4B). In generale, possiamo ottenere trasfezione di efficienza fino al 91% in hESCs a 24 ore dopo la trasfezione.
Figura 1. (A) Schema di cultura NCM. Il grafico a linee delinea i cambiamenti dinamici di associazione multicellulare in una tipica coltura di 3 giorni in condizioni di NCM. (B) immagini di fase rappresentativi di WA01 (H1) hESCs propagati in una condizione NCM sul 2,5% Matrigel in mTeSR1 medio per 16 passaggi (designati come WA01, mcp16). Il pannello inferiore è la vista ingrandita del pannello superiore. Barre di scala indicano 100 micron.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Monocellulari saggi di sopravvivenza utilizzando un formato a 96 pozzetti. Approssimativamente, 31.000 hiPSCs SCU-i10 17 sono state piastrate su 2,5% Matrigel in presenza di varie piccole molecole inibitrici relative a Rho-chinasi associata (roccia) percorsi a concentrazioni indicate . Dopo 24 ore, le cellule sono state sottoposte a test di sopravvivenza CCK-8 misurando l'assorbanza a 450 nm (A450). La t-test di Student è stato utilizzato per determinare se le differenze nella cella singola efficienza placcatura tra vari inibitori ROCCIA sono di significatività statistica. Il segno asterisco singolare (*) indica differenze significative tra gli inibitori (P & #62; 0,05), mentre i segni doppio asterisco (**) indica la differenza osservata è di significatività statistica (P <0,05). Colonne in istogrammi designano i valori medi dei fattori determinanti quadruplicato e le barre rappresentano deviazioni standard.
Figura 3. Cultura NCM di hiPSCs su laminina-521 (LN-521) senza la presenza di inibitori ROCK. La linea hiPSC SCU-i30 è stato istituito presso l'NIH Stem Unità cellule. Cellule SCU-i30 sono state coltivate su LN-521-rivestite piastre da 6 pozzetti nella libera xeno medio TeSR2 per 15 passaggi senza l'uso di piccole molecole inibitrici come inibitori ROCK. (A) immunocolorazione delle cellule SCU-i30 con un anti -NANOG policlonale anticorpi e di contrasto con Hoechst 33342 (Hoechst). In particolare, alcune cellule che hanno una colorazione NANOG negativo sono esimocellule e sotto mitosi. (B) analisi citofluorimetrica dell'espressione marcatore HPSC in cellule SCU-i30 coltivate come NCM sul 2,5% Matrigel con l'utilizzo di 10 micron Y-27632 (pannello superiore) o NCM su LN-521 senza Y-27632 (pannello inferiore). Le procedure sia per immunoistochimica e l'analisi di citometria di flusso sono stati descritti in precedenza 5. Barre di scala raffigurano 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. NCM cultura hPSCs per microRNA trasfezione. WA01 hESCs sono state coltivate come NCM sul 2,5% Matrigel in mTeSR1 per 2 (A) e 18 (B) passaggi, rispettivamente. Fase e fluorescenza immagini rappresentative di cellule WA01 transfettate con Dy547-marcato microRNA controllo per monitorare l'efficienza di transfezione a 24 ore dopo la trasfezione. Barre di scala rappresentano il 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono due modi principali per hPSCs coltura in vitro: coltura convenzionale colonia-tipo (di celle alimentatori o matrici extracellulari) e cultura sospensione delle hPSCs gli aggregati senza alimentatori 6. Le limitazioni di entrambi colonia-tipo e sospensione metodi di coltura comprendono eterogeneità accumulati e cambiamenti epigenetici ereditabili. Cultura NCM, sulla base sia passaging singola cellula e cellula placcatura ad alta densità, rappresenta un nuovo metodo di coltura per la crescita HPSC 6,18. Sebbene vari metodi Passaging unicellulare sono stati documentati in letteratura, ma nessuno di essi sono usati per la propagazione di routine. Ad esempio, Wu e colleghi hanno impiegato un metodo passaging unicellulare per studiare gli effetti delle varie piccole molecole cocktail sul HPSC crescita 19. Tuttavia, i loro prodotti finali della cultura sono colonie. Così, a base di densità a basso metodi Passaging unicellulare appartengono ancora alla colonia di tipo culturale. Per quanto riguarda la cultura NCM, gli high-taneplaccatura lità trasforma questa cultura per un nuovo metodo, poiché il prodotto cellulare finale è un monostrato omogeneo. Recentemente, Dvorak e colleghi hanno usato metodo simile per analizzare globalmente proprietà HPSC in questa condizione di crescita 18. I loro risultati supportano anche i nostri principali conclusioni. E 'chiaro ormai che la cultura NCM è un metodo emergente che possiede diverse nuove caratteristiche e può essere ulteriormente modificato per molte potenziali applicazioni in biologia delle cellule staminali pluripotenti.
Proprietà di base di hPSCs della cultura NCM
È concepibile che hPSCs sotto NCM parti cultura molte caratteristiche con gli stessi tipi di cellule coltivate come colonie 9,18. I livelli di espressione dei marcatori hESC in hPSCs, che includono Oct-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, e SSEA-1, sono simili in entrambi NCM e la colonia di tipo culturale . Cellule NCM-adattate mantengono anche simili mRNA globale pattern di espressione di colonie HPSC cresciute su MEF strati alimentatore 9. Chiaramente, le cellule NCM-adattate sostenere lo stato pluripotente, come determinato dal teratoma dosaggio 9,18. Tuttavia, a differenza colonie HPSC, cellule in condizioni NCM hanno un tasso di crescita prevedibile che è caratterizzato da curve di crescita coerenti, cicli cellulari, e cellulari di 9. A causa della placcatura unicellulare ad alta densità, hPSCs in condizioni NCM mostrano una crescita esponenziale tra i giorni 2 e 4 (Figura 1B), aumentando così il numero di cellule per 4 volte rispetto HPSC colonie cresciute su MEF. Cultura prolungata non aumenta la produzione di cellule, ma aumenta piuttosto apoptosi e la differenziazione di stress 9. NCM consente inoltre crioconservazione ottimale, permettendo così il recupero cellulare rapida sulla placcatura cellule scongelate (protocollo 1). Inoltre, NCM facilita l'adattamento della cultura HPSC a vari protocolli libero-Xeno 9. In generale, NCM supporta la crescita di hPSCs, mantiene lo stato pluripotenti, e sostiene il potenzialeziale di hPSCs a differenziarsi in tessuti adulti dei tre foglietti embrionali.
Stabilità cromosomica in hPSCs sotto NCM
In termini di stabilità cromosomica, non c'è confronto diretto tra le cellule di diversi metodi di coltura. La maggior parte dei hPSCs sotto le nostre condizioni di coltura NCM hanno cariotipo normale e il numero di copie del gene, come determinato dal G-banding, basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) e ibridazione in situ fluorescente (FISH) 9. Due linee (~ 13%) hanno mostrato cariotipi anomali, in cui una linea (cioè, WA09) esposto elevata poliploidia e un altro (ES01) avevano il 14% di cellule con trisomia 20 9. Non è chiaro se questi cariotipi anormali sono stati ricavati dal selezione delle preesistenti cellule mutate prima di cultura NCM o indotte durante NCM adattamento. È importante che le colonie partire HPSC o sottoinsieme di colonie usate per NCM cultura should essere ben caratterizzato in termini di omogeneità e stabilità cromosomica all'epoca per NCM adattamento. In particolare, il tasso di cariotipi anomali in condizioni NCM è molto inferiore a quello riportato in una recente analisi di coorte, in cui gli autori rivelano 34% cariotipi anormali sotto predominanti colonia di tipo condizioni di coltura 20. Quindi, il nostro studio indica che è possibile coltivare cellule singole dissociate e mantenere la loro stabilità cromosomica in condizioni di NCM. Tuttavia, abbiamo anche bisogno di utilizzare metodi più sensibili per esaminare le anomalie cromosomiche degli hPSCs nei prossimi anni. In particolare, abbiamo bisogno di eseguire la scansione di cromosomi 1, 12, 17 e 20 con sonde a risoluzione più elevata (ad esempio, <50 kb), come alcune lesioni minori (ad esempio, il 20q11.21 amplicone) a questi cromosomi frequentemente alterati non possono essere rilevati dai convenzionali cariotipo e FISH 20-22. Inoltre, lo sviluppo di protocolli diversi NCM ci permetterebbe di identificare Robust e metodi sicuri per le applicazioni future.
Cultura NCM sotto diverse modifiche
L'uso dell'inibitore ROCK, Y-27632, ha aperto la porta per saggi basati singola cellula. La disponibilità di inibitori ROCK diverse fornirebbe scelte supplementari per espansione basata NCM e crioconservazione di hPSCs (Figura 2). In teoria, qualsiasi piccola molecola, che può aumentare significativamente unicellulare efficienza placcatura, può essere utilizzato per facilitare cultura NCM. JAK inibitore 1, che funziona in modo diverso da tali inibitori ROCK, rappresenta un esempio 9. L'uso di singole molecole o approcci combinatori può fornirci una crescita ottimale delle cellule, saggi cellulari e crioconservazione di hPSCs. Tuttavia, cultura NCM alternativa di hPSCs su proteine della matrice extracellulare definiti, come la laminina isoforma LN-521, normalmente espressa in hESCs 23-25, può eliminare l'interferenza di piccolamolecole (Figura 3). LN-521 potrebbe migliorare la sopravvivenza dissociato-HPSC e sostiene pluripotenza attraverso l'attivazione della via α6β1-PI3K/AKT 24. La semplicità di hPSCs Passaging con LN-521 riduce l'eterogeneità delle cellule, compatibili con diversi sistemi di coltura cellulare e senza xeno libero-feeder utilizzando medio completamente definiti (protocollo 4). Esso fornisce anche un modulo aggiuntivo per saggi high-throughput senza l'influenza di piccole molecole. Anche se i iPSCs sotto cultura NCM su LN-521 mantenuto l'espressione di un pannello di marcatori HPSC, ulteriore caratterizzazione di queste cellule utilizzando teratoma saggio e embryoid differenziazione multilineare-mediata corpo possono essere necessari per confermare gli stati pluripotenti in queste cellule. Da segnalare, hiPSCs coltivate sul laminina isoforma LN-521 sono riferito citogeneticamente stabili (http://biolamina.com/). Tuttavia, abbiamo anche bisogno di applicare i metodi più alta risoluzione e sensibili (come discusso sopra) aexamine la stabilità cromosomica in queste cellule.
Versatilità della cultura NCM per l'ingegneria genetica
Metodi basati NCM rappresentano un sistema semplice, robusto ed economico che possono essere particolarmente utili per la manipolazione genetica di hPSCs (protocolli 5-7). E 'noto che le colonie hESC sono difficile trasfezione o trasduzione, con grande variabilità in efficienza di trasfezione / trasduzione tra diversi laboratori 26-28. Per esempio, l'efficienza di trasfezione in hESCs varia dal 3 al 35% in colonia condizioni di coltura 26. Segnali di trasduzione lentivirali in cellule BG01 in condizioni colonie sono risultate essere estremamente basso 9. Tuttavia, l'efficienza di trasfezione mediata da NCM era maggiore del 75% 9 e modifica dei metodi di trasduzione può aumentare lentivirus-mediata efficienza di trasduzione fino al 90% 28. Uno studio comparativo stretto ha rivelato che è ªe associazioni pluricellulari in colonie hESC che contribuiscono alla scarsa efficienza di trasfezione 9. Inoltre, abbiamo recentemente modificato un protocollo di trasfezione microRNA e sono in grado di ottenere un'elevata efficienza di trasfezione (~ 91%) senza l'uso di lentivirus (Protocollo 6 e Figura 4). Questo protocollo è facile da usare e particolarmente utile per gli esperimenti di trasfezione transiente in un 3 - al lasso di tempo di 5 giorni. Come abbiamo delineato nei protocolli di cui sopra, diversi fattori devono essere presi in considerazione quando si ottimizza l'efficienza di trasfezione / trasduzione in hPSCs. Questi fattori includono densità cellulare, le concentrazioni di plasmidi, titoli lentivirali, molteplicità di infezione (MOI), la durata della trasfezione / trasduzione, citotossicità dei reagenti e dei metodi utilizzati per l'efficienza monitoraggio trasfezione / trasduzione.
Elaboriamo ed estendere i metodi NCM a hPSCs cultura sul Matrigel e su matrici extracellulari definiti. Questo metodo di colturaè un modo efficace per eliminare l'eterogeneità che si trovano comunemente in HPSC colonia e culture aggregati. Le cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di crescita NCM sono pluripotenti e cromosomicamente stabile. Questo sistema di coltura romanzo è semplice e versatile per HPSC la manutenzione, l'espansione su larga scala, e manipolazioni genetiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
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