Introduction
Multilinaj yetişkin dokulara doğru ayırt etmek hPSCs kapasitesi kardiyovasküler, hepatik, pankreatik ve nörolojik sistemleri 1-4 içeren ciddi hastalıklardan muzdarip hastaların tedavisinde yeni yollar açtı. HPSCs türetilen çeşitli hücre tipleri de hastalık modelleme, genetik mühendisliği, ilaç tarama ve toksikolojik test 1,4 için sağlam hücresel platformlar sağlayacaktır. Onların gelecekteki klinik ve farmakolojik uygulamaları sağlayan temel konu, in vitro hücre kültürü yoluyla klinik dereceli hPSCs çok sayıda nesil. Ancak, mevcut kültür sistemleri koloniler 5,6 olarak hPSCs çeşitli besleyici ve besleyici ücretsiz kültürleri içeren, yetersiz ya da doğal olarak değişken ya vardır.
HPSCs erken hisse memeli embriyoların iç hücre kütlesinin (ICM) birçok yapısal özelliği de koloni tipi büyüme. ICM üç germ-tabaka halinde ayırt eğilimliheterojen olması nedeniyle sinyal degradelerin varlığının bir çok hücreli bir ortamda. Bu nedenle, erken dönemde embriyo gelişimi içinde heterojenite edinimi farklılaşması için gerekli bir süreç olarak kabul edilir, ancak hPSC kültür istenmeyen bir özelliktir. HPSC kültür içinde heterojenite nedeniyle genellikle optimal büyüme koşulları aşırı apoptotik sinyallerin ve kendiliğinden farklılaşma tarafından indüklenir. Bu nedenle, koloni tipi kültür, heterojen hücreleri genellikle kolonilerin 7,8 periferinde gözlenmektedir. Aynı zamanda, insan embriyonik kök hücre (HESC) in hücreleri, BMP-4, 9 gibi sinyal moleküllerine sergi farklı yanıtlar kolonilerinin gösterilmiştir. Ayrıca, koloni kültürü yöntemleri nedeniyle kontrol edilemeyen büyüme oranları ve apoptotik sinyal 6,9 yolaklar düşük hücre verimi yanı sıra kriyokorunması çok düşük hücre kurtarma oranları üretmek. Son yıllarda çeşitli süspansiyon kültürleri, kültürleme hPSCs için Partikül geliştirilmiştirbesleyici-ve matris içermeyen koşullar 6,10-13 içinde hPSCs büyük miktarda genişletilmesi için as ı. Açıkçası, farklı kültür sistemleri kendi avantajları ve dezavantajları var. Genel olarak, hPSCs heterojen doğası genetik mühendisliği 6 hPSCs içine DNA ve RNA malzemeleri bırakmak için optimal olan koloni tipi ve toplanmış kültür yöntemleri en önemli dezavantajları, birini temsil eder.
Açıkçası, mevcut kültür yöntemleri bazı eksikliklerini aşmak yeni sistemler geliştirmek için bir zorunluluk ihtiyaç vardır. Tek hücre canlılığını artırmak (örneğin ROCK inhibitörü Y-27632 ve JAK inhibitörü 1 gibi) küçük molekül inhibitörleri keşifler ayrışmış-hPSC kültür 14,15 için yol açmıştı. Bu küçük moleküllerin kullanımı ile, son zamanlarda non-koloni Çeşidi ayrışmış-hPSCs 9 (NCM) büyüme göre bir kültür yöntemi geliştirdik. Bu yeni kültür yöntemi tek hücreli pasajlanmasını ve yüksek yoğunluklu hem birleştiriryöntemleri kaplama bize majör kromozom anomalili 9 olmaksızın tutarlı bir büyüme çevrimleri altında homojen hPSCs büyük miktarlarda üretmek için izin. Seçenek olarak ise, NCM kültür geniş uygulamalar için kültür yöntemi optimize etmek amacıyla, farklı küçük moleküller (örneğin laminins gibi) gibi tanımlanmıştır matrisler ile uyarlanabilir. Burada, biz NCM kültürüne dayalı birçok ayrıntılı protokoller sunmak ve genetik mühendisliği için detaylı prosedürler tasvir. NCM protokollerin yönlülüğünü göstermek için, biz de farklı ROCK inhibitörleri ile ve tek laminin izoformlu 521 (yani, LN-521) ile NCM kültürü test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HPSCs tek hücre tabanlı olmayan koloni tipi tek tabaka (NCM) kültürü.
1.. Hazırlıklar
- % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, ve 0.1 mM temel olmayan amino asitler (NEAA) ile takviye edilmiş DMEM ortamı: fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ve kültür ortamının 500 ml olun.
- Fare embriyonik fibroblastlar DMEM ortamı içinde% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu hücre kültürü plakasının üzerinde rutin bir protokol 16 ve Kültür MEF'ler sonra CF1 suşundan türetilmiş (MEF'ler) hücreleri izole edin. Alternatif olarak, ticari kaynaklardan pasaj 3'de MEF hisse senedi satın.
- Matrigel tabak hazırlayın.
- Bir -20 ° C dondurucu içinde% 50 küçük parçalar halinde 5 (~ 4 ° C'de soğutulmuş) DMEM/F12 ortamı ml ve mağaza ile HESC nitelikli Matrigel stoklar 5 ml seyreltin. Bir buzdolabı (~ 4 ° C) O / N donmuş Matrigel stok çözülme ve daha fazla (% 2.5 'çalışma konsantrasyonuna neden vermek üzere), soğuk DMEM/F12 ortamı içindeki Matrigel seyreltin.
- Plaka 10 ile 30 dakika boyunca hücre kültürü kaputu (Not: Bir hücre kültürü inkübatör plaka sıcak değil) içinde oda sıcaklığında ısıtın, buzdolabından Matrigel plakasını çıkarın ve aspirat DMEM orta önce hPSCs kaplama için.
- 500 ml HESC orta edin:% 80 DMEM/F12 ortamı,% 20 KSR, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 0.1 mM β-merkaptoetanol ve 4 FGF-2 ng / ml.
- ,% 60 FBS,% 20 DMSO ve mTeSR1 ortamı içinde 20 uM Y-27632, filtrasyon ile sterilize ve 1 hafta içinde ortamını kullanmak: 2X hPSC dondurma ortamı 10 ml hazırlayın.
. 2. Protokol 1 (Temel): yemlikler üzerine hPSC Kolonileri büyütün
- Tutarlı resul almak için hPSC kültür için 5 veya 6 (P5 ve P6 olarak adlandırılan) at MEF pasaj numaraları kullanınts. Mitotik 37 ° C'de 3 saat boyunca 10 ug / ml mitomisin C ile hücrelerin işlemden geçirilmesi ile MEFS inaktive, yıkama hücreler, 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile 3 kez ve daha sonra 0.53 mM% 0.05 tripsin ile MEFS ayırmak EDTA. Alternatif olarak, bir X-ışını ışınlama ile 8000 rad bir dozda MEFS ışın.
- Mikroskop altında Trypan Blue leke çıkarma yöntemi kullanılarak hücre sayısı sayılır. Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayacı kullanmak.
- 6-yuvalı polistiren plakaları üzerine Plate ışınlanmış MEF'ler oyuk başına 1.88 x 10 5 hücre (örneğin, 1.96 x 10 4 hücre / cm2) bir yoğunlukta% 0.1 jelatin ile kaplanmıştır. 37 ° C'de inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2 24 saat karıştırıldı.
- Pasteur pipeti (: bu zamanda gerekli hiçbir yıkama adımları Not) aspirasyon ile MEF kültür ortamı çıkarın.
- Küçük öbekler halinde önceki kültürden öğütün hPSC koloniler, fr değişen boyutlarını sağlamak için mikroskop altında incelemek topaklarom 50 çaplarda um ila 100, ve de hPSC ortamının 2 ml birinde MEF besleyici tabakalarının üstüne hPSC kümeleri plaka.
- Herhangi bir morfolojik değişmiş veya farklılaşmış kolonileri (~% 5) işaretlemek, fotoğraf tarafından 3 ila 5 gün, kayıt koloni büyüme için HESC orta günlük değişim, ve elle bir Pasteur pipeti ile hafifçe aspirasyon ile işaretlenmiş koloniler çıkarın.
- Iki MEF'ler kalan koloniler (2 dakika D-PBS ile her biri) yıkayın ve 2 ml 1 mg / 10-30 dakika boyunca hPSC ortamı içinde ml kollajenaz IV) ile inkübe koloniler ve ikinci hPSC kolonilerin kopmasını incelemek MEF-kaplanmış yüzey (Not: koloniler sıkıca plakasına bağlı olan yalnızca dekolmanı sürecine yardımcı olmak için bir kazıyıcı kullanın).
- , Bir 15 ml tüp enzimatik reaksiyonlar, transfer koloniler en aza indirmek hPSC koloniler oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca tortu olanak sağlar ve c doğrudan görselleme yoluyla kolonilerin tortulaşmayı sağlamak için her bir oyuğa hPSC orta 5 mltüpün altındaki arşın (Not: Bu aşamada tüp santrifüj değil).
- Kalıntı MEFS içeren süpernatantlar çıkarın ve tek hücreler ayrışmış, HESC 5 ml ortam ile tekrar süspansiyon koloniler ve iki kez sedimantasyon adımı tekrarlayın.
- Hücre geçiş için bir 6-plaka üzerine (1 de dondurulmuş vialde konflüent) ya da levha dondurulması için orta (veya CryoSTORE CS10 donma orta) dondurma 1X hPSC küçük topaklar, mağaza içine orta, çiğnemek hPSC koloniler çıkarın.
3 Protokol 2:. NCM'ye için hPSC Kolonileri yemlikler dönüştürme
- , Bir kere daha D-PBS içinde hPSC pelet, 10 dakika boyunca çalkalayın 1X Accutase 1 ml ile inkübe granül ve tek hücreli ayrışmasını sağlamak için bir mikroskop altında enzimatik reaksiyonu inceleyin.
- Yavaşça Y-27632, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g'de santrifüj ile ve ardından 10 uM içeren mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri asılı enzimatik reaksiyonları sonlandırma(Hücre hasarına neden aşırı santrifüj kuvvetleri kullanmak istemiyorum, Not).
- Topağa mTeSR1 orta 5 ml, tek bir hücre olarak pelet tekrar süspansiyon ve filtre, bir 40 mikron hücre süzgecinden (herhangi bir artık hücre birikimlerin çıkması için) üzerinden hücreleri ayrışmış.
- Bir kuyu içine tohum 1.3-2 x 10 6 hPSCs% 2.5 HESC nitelikli Matrigel ile kaplanmış bir 6-yuvalı plakanın (1.4-2.1 x 10 5 hücre / cm 2), 2,5 ml kadar mTeSR1 orta ekleyin ve 10 uM içerir bir ortam içinde Y-27632 (ilk 24 saat, tek hücreli bir kaplama kolaylaştırmak için). 1 uM Y-39983 (I inhibitör ROCK), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitörü), 1 uM thiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü): Seçenek olarak ise, geliştirme, tek hücreli bir kaplama için 10 uM Y-27632 değiştirmek için aşağıdaki küçük moleküller kullanmaktadır ve 2 uM JAK önleyici 1.
- (24 saat içinde), bir sonraki gün ilaçsız mTeSR1 ortam ile orta yerine, ilave bir ila hücreleri ayırmakiyi ve tek hücreli kaplama etkinliğini belirlemek için, hücre sayısını (Not: yaklaşık olarak bu aşamada elde edilebilir, tek hücreli bir kaplama verimliliğinin 50-90%).
- Hücreler mTeSR1 ortam 3 ml ile bir kaç gün için tek hücreli bir şekillendirilmiş tek katman olarak çoğalmıştır izin verin. Günlük orta değiştirin.
- Ampirik hücre yoğunluğuna bağlı olarak adapte NCM pasaj yapmak için takvimi belirlemek. Hücre büyümesi 3 gün veya günde 4 izdiham, ya da hücre-hücre sınırlarının kaybolması sonra 4 saat zaman noktasında ulaşır Passage. Bir 1-3 bölme oranını (örneğin, 6 oyuklu plakanın yuvaları içinde plaka 3 hücrelerinin konfluent 1) hücre geçiş için kullanın Accutase 1 ml hücreleri ayırmak ve 5 kısım tarafından adapte NCM stabilize.
- Hücre dondurma
- Bir dondurulmuş şişe için, bir konfluent kuyu (~ 5-6 x10 6 hücre) kullanmaktadır: de, 10 dakika boyunca Accutase 1 ml bir konfluent hücreler çözülür.
- W sulandırmakith 5 yukarıda tarif edildiği gibi mTeSR1 orta ve santrifüj hücre ml.
- MTeSR1 ortamının 500 ul pelet yeniden süspanse edin ve daha sonra yavaş yavaş, bir kriyokoruma şişe içinde (20 uM Y-27632 ihtiva eden) 2X hPSC dondurma ortamı içinde 500 ul ekleyin. Seçenek olarak ise, 10 uM Y-27632 ya da 2 ya da uM JAK önleyici 1 varlığında, 2 uM JAK inhibitörü 1 veya 1X CryoStor CS10 ortam içeren 1X hPSC dondurma ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Bir buz soğutulmuş cryocontainer (isopranol ile alt-dolu) içine dondurulmuş şişeleri yerleştirin ve hemen -80 ° C dondurucu cryocontainer aktarın.
- Uzun süreli dondurulması için (bir sonraki günde) bir sıvı azot tankına -80 ° C dondurucu transfer hücreleri.
- Hücre çözdürme
- 6-plaka 1 kuyu kaplama için bir dondurulması flakon yararlanın.
- 2 dakika için aynı su banyosu içerisinde 10 dakika, erime hücreler için bir 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak mTeSR1 ortamı,damla damla 10 uM Y-27632 içeren önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri ekleyin ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
- Yavaşça 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortam 2 ml hücre topakları tekrar süspansiyon ve yavaş yavaş da iyi Matrigel ile önceden kaplanmış hücreleri transferi (Not: hava kabarcıkları üretmek kaçının).
- Günlük orta değiştirin ve hPSC büyüme günde 3 veya 4 de izdiham ulaşmasını bekliyoruz.
4 Protokol 3:. NCM Kültür Matrigel hPSC Kolonileri dönüştürün
- , Buzdolabı bir Matrigel kaplı plaka çıkarmak 10-30 dakika boyunca doku kültürü kaputu levhayı, plakanın her gelen orta kaldırmak ve de her bir önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamının 2 ml ekleyin.
- Aktarım Yukarıdaki Matrigel plakasına besleyici kültür (temel protokol Adım 2.10) için hPSC kümeleri ezilerek karıştırıldı. Her bir 2.5 ml nihai hacme kadar mTeSR1 orta ekleyin.
- 3-4 gün için her gün ortam değiştirmekoloniler kadar s% 80-90'ını izdiham ulaşmak.
- Hücre geçirilmesi için: iki kez D-PBS ile durulayın kolonileri 15-20 dakika boyunca 37 ° C 'de 2 mg / ml dispase 1 ml ile hücrelerin tedavi ve topaklar halinde sediment ve geçiş hücreleri.
- NCM kültürü için: 3,1-3,9 Protokol 2'de anlatılan adımları tekrarlayın.
5 Protokolü 4:. Üzerine hPSCs NCM Kültür LN-521
- Kullanım bir gün önce, 4 ° C 'de rekombinant LN-521 çözeltisi çözülme ve bir son konsantrasyon için (Ca 2 + / Mg2 + ihtiva eden) 1X D-PBS ile çözülmüş laminin seyrelterek laminin kaplama çözeltisi (LCS) yapmak 10 ug / ml.
- (: Kuru-out kaplama işlemi sırasında önlemek not) 6 oyuklu bir plaka içerisinde birine LCS 1 ml ilave edilir.
- Buharlaşmasını önlemek ve buzdolabında (4 ° C) O / N (: 1 hafta içinde plaka kullanmak notu) olarak plaka saklamak için Parafilm ile kaplanmış plaka mühür.
- Yavaşça olmadan bir Pasteur pipeti ile LCS çıkarınkaplanmış yüzeyi uching ve iyi birine mTeSR1 orta 2 ml ekleyin.
- 25 dakika için bir 37 ° C su banyosunda (D-PBS dahil) tüm kültür çözümler ısıtın.
- HPSC koloniler NCM'ye dönüştürme
- Protokol 2 de tarif edildiği gibi Accutase ile tek bir hücre için hücre agregatları ayrıştırmaları.
- Bir tohum içine 1.3-2 x 10 6 hPSCs iyi LN-521 kaplı (1.4-2.1 x 10 / cm 2 5 hücreleri) ROCK inhibitörlerinin varlığı olmadan.
- 3-4 gün boyunca her gün ortam değiştirin.
- Bir 1-3 bölme oranını kullanarak bir sonraki hücre geçiş için günde 3 ya da 4 ° C'de Accutase 1 ml hücreleri ayırmak.
. 6 Protokol 5: Kültür NCM Plasmid DNA Transfeksiyonu için
- 4 Protocols 2'de tarif edildiği gibi kültüre NCM hPSC koloniler uyum.
- Levha 10 uM Y-2763 mevcudiyetinde mTeSR1 ortamı içinde 5 hücre / oyuk 10 x 7.5 'lik bir hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde hPSCs ayrışmış2.
- Hücreleri kaplama yapıldıktan sonra 4-8 saat arasında ilaç içermeyen mTeSR1 orta mTeSR1 orta yerine.
- Her bir transfeksiyon için, (örneğin, pmaxGFP) ekspresyon plazmidleri 2.5 ug seyreltilmiş ve 125 ul Opti-MEM her ayrı Eppendorf tüpleri içinde Lipofectamine 2000 5 ul serum Orta azalır.
- 5 dakika sonra, seyreltilmiş reaktifleri karıştırmak ve oda sıcaklığına (transfeksiyon kompleksler oluşturmak üzere) 20 dakika boyunca inkübe edin.
- 1 ml mTeSR1 ortam içinde içeren her hPSCs için 250 ul transfeksiyon kompleksi ilave edin ve 24 saat boyunca bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de hücreleri inkübe edin.
- Flöresanlı bir mikroskop ve gerçek transfeksiyon verimliliğinin hesaplanması için rasgele fotoğraf altında transfeksiyon verimi inceleyin.
. 7 Protokol 6: NCM Kültür microRNA Transfaksiyon için
- 6'da oyuk başına Accutase 1 ml ilave etmek suretiyle NCM koşullar altında 2 gün yarı-birleşik hPSCs ayrıştırmaları Oyuklu plaka.
- 5 dakika boyunca 200 x g enzimatik reaksiyonlar ve santrifüj seyreltilmesi mTeSR1 ortamı 10 ml ilave edilir.
- , MTeSR1 orta hücre pelletini 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortamı içinde bir 12-çukurlu plaka içinde gözenek başına 7.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda hücreler tohum ve hücreler, 4 saat boyunca birleşmeye izin verin.
- Y27632-ücretsiz mTeSR1 orta orta yerine.
- Piyasada mevcut microRNA (örneğin, Dy547 ile etiketlenmiş olmayan bir hedefleme miRIDIAN miRNA Transfection Denetimi) kullanın. Sağlanan reaktifler kullanılarak 0-160 nM arasında değişen konsantrasyonlarda titre ve üreticinin talimatlarını izleyin.
- Transfeksiyondan 24 saat sonra bir mikroskop altında canlı hücre Dy547 flüoresan görüntüleme ile hPSC çizgilerle her bir konsantrasyonu için transfeksiyon verimi optimize.
- Görüntülenen tüm hücreleri üzerinde Dy547 pozitif hücrelerin yüzdesi göre transfeksiyon verimliliği hesaplayın.
- Tekrar Protokol'ün 6 7,1-7,4 adımları.
- Transdüksiyon için kullanılacak viral parçacıkların miktarda hesaplayın: aşağıdaki formül kullanılır: TU = TU birimlerinin dönüşüm toplam sayıları temsil eder, oysa (MOI CN x) / VT, MOI kuyunun (İB veya enfeksiyon arzu edilen çok sayıda eşittir TU / hücre), her bir oyuğa CN hücrelerin sayısını belirtir ve VT stok viral titreler (TU / ml) göstermektedir. Örneğin, SMART-shRNA vektörü için hazır viral titresi (bir ml için dönüştürme birimleri) 1 x 10 9 TU / ml eşit olduğu göz önüne alındığında, 7.5 x 10 5 transdüksiyon anda oyuk başına hücre ve 20 beklenen bir MOI: 15, kullanımı her bir kuyu için stok viral parçacıkların ul (not: Bu durum geçici Lentiviral indüksiyon için tavsiye edilir).
- 30 dakika boyunca polibren 10 mg / ml 'lik mTeSR1 ortamının önceden sıcak 300 ul.
- Stok viral parçacıkların 15 ul içine ekleyinönceden ısıtılmış mTeSR1 orta polybrene ihtiva eden ve çözelti yavaşça karıştırın.
- Viral parçacıkları içeren, önceden ısıtılmış ortam 300 ul hücre kültür ortamı değiştirin.
- 4 saat inkübe edildikten sonra, iletim etkinliğini belirlemek için turboGFP floresan (shRNA ekspresyonu için bir yapıcı) inceleyin.
- Hücreler turboGFP ifade başladığınızda iyi Transdükleme ek mTeSR1 orta 300 ul ekleyin.
- 12-16 saat inkübasyondan sonra, turbo-GFP ifade yeniden gözden.
- 72 saat içinde bu transdüksiyona hücrelerle istenen takip deneyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NCM kültürünün genel bir şema
Şekil 1, bu ROCK inhibitörü Y-27632 varlığında, yüksek yoğunluklu tek hücreli sonra kaplama hPSCs dinamik değişiklik gösteren tipik bir NCM kültür şemasını temsil etmektedir. Bu morfolojik değişiklikler, hücre kümeleri oluşumu kaplama ve hücre yoğunlaştırma ile ve ardından üssel hücre büyümesi (Şekil 1A) sonra hücreler arası bağlantıları vardır. Temsili deney 1. günde 10 uM Y-27632 mevcudiyetinde / cm 2 1.9 x 10 5 hücre yoğunluğunda tek hücreler olarak kaplama, WA01 (H1) hESC gösterir (Şekil 1B, sol panel), daha fazla olmayan yayılır 2. günde koloniler (Şekil 1B, orta panel) oluşumu ve arzu deneyleri için ya da 3 günde (Şekil 1B, sağ panel), hücre geçiş için uygun olan bir homojen tek tabaka olarak yoğunlaştırılır.
<strong> Çeşitli ROCK inhibitörleri NCM kültürüne destek
96 oyuklu bir plaka deney kanıt-of-kavram yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama için kullanıldı. Ayrıca NCM kültürünü desteklemek için çeşitli ROCK inhibitörlerinin kullanımını optimize etmek için tasarlanmıştır. Yaklaşık olarak, 31,000, SCU-i10 hücreleri, insan kaynaklı pluripotent hücreler (hiPSCs) 17 ayrışmış ekildi bir Matrigel kaplı ROCK çeşitli inhibitör konsantrasyonları mevcudiyetinde de. 24 saat sonra, hücreler bu koşullar altında hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, CCK-8 göre hayatta kalma deneyine tabi tutulmuştur. Daha önce NCM yöntem, tek hücreli bir kaplama artırmak için, 10 uM de ROCK inhibitörü, Y-27632, kullanımını gerektirir göstermiştir. Bu yazıda, 10 mcM Y-27632 anlamlı hiPSCs verimliliğini kaplama 24 saat tek bir hücre (p <0.05) (Şekil 2) artış olduğunu doğruladı. Biz de bulundu Y-39983 (I inhibitörü ROCK), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitörütor) ve thiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü) önemli ölçüde tek hücreli bir kaplama etkinliğini modüle eden ve kontrol (P <0.05) (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında, 1 uM'de NCM büyümesini teşvik. Ayrıca, tek hücreli bir kaplama verimliliğine (1 uM at) üç ROCK inhibitörlerinin etkileri 10 uM (P> 0.05) (Şekil 2) Y-27632 ile karşılaştırılabilir olmuştur. Özellikle, I (5 uM) inhibitör ROCK diğer moleküllere göre daha belirgin bir etkileşim karıştığı, 1 uM (P <0.05) de bir ilaç ile karşılaştırıldığında belirgin bir sitotoksisite göstermek için görünür. Bu nedenle, çeşitli ROCK inhibitörleri gelecek NCM kültür desteklemek için kullanılabilir. Ancak, bu yeni inhibitörleri ile NCM altında hem hESC ve hiPSCs tam bir karakterizasyonu ileride kullanmak için gerekli olacaktır.
LN-521 ROCK inhibitörlerinin kullanımı olmaksızın NCM kültür destekler
T belirlemek içinHESC büyümeyi destekleyen belirli bir laminin izoformunun o rolü biz kseno-barındırmayan ortam içinde TeSR2 LN-521 ile kaplanmış plakalar üzerine SCU-i30 hiPSCs kültürlenmiştir. İlginç bir şekilde, tek başına LN-521, ROCK inhibitörlerinin varlığı olmadan, tek hücreli kaplama ve bu koşullar altında 15 pasajdan sonra NCM büyüme (Şekil 3) destekler. Bir anti-Nanog poliklonal antikor ile SCU-i30 hücrelerin immün, bu koşul altında, hücrelerin çekirdeklerinde yüksek Nanog ifade (Şekil 3A) sahip olduğunu gösterdi. Akış sitometrik analizi HESC markör ifade profili, ROCK inhibitörü Y-27632 (Şekil 3B) kullanılarak NCM olarak yetiştirilen hücreler benzer olduğunu göstermiştir.
Lentiviral parçacıkların kullanmadan microRNA teslimat yüksek verim
Dy547 etiketli oligonükleotid microRNA ile transfeksiyonu NCM koşullar altında WA01 (H1) hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. WA01 HESC üzerinde NCM'ye gibi büyütüldü % 2.5 2 (Şekil 4A) için mTeSR1 in Matrigel ve 18 (Şekil 4B), sırasıyla geçitleri. Bu hücreler yüksek transfeksiyon verimi 24 saat post-transfeksiyon (Şekil 4A ve 4B) gösterdi. Genel olarak, transfeksiyondan 24 saat sonra HESC% 91'e kadar transfeksiyon verimi elde edilebilir.
NCM kültür Şekil 1.. (A) Şema. Çizgi grafiği NCM koşullar altında tipik bir 3 günlük kültür hücreli dernek dinamik değişiklikleri çizer. (B) 16 geçişleri için mTeSR1 ortamında 2.5% Matrigelin bir NCM koşul altında yayılır WA01 (H1) hESC Temsilcisi faz görüntüleri (belirlenmiş WA01, mcp16) elde edildi. Alt panel, üst panelin büyütülmüş bir görünüşüdür. Ölçek çubukları 100 um göstermektedir.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2,., 96 oyuklu bir format kullanılarak Tek hücreli hayatta kalma tahlilleri. Yaklaşık 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 belirtilen konsantrasyonlarda Rho-bağlı kinaz (ROCK) takip ettiği yol ile ilgili çeşitli küçük molekül inhibitörlerinin varlığında% 2.5 Matrigel ekildi . 24 saat sonra hücreler, 450 nm'de (A450) de absorbans ölçülerek CCK-8 hayatta kalma deneyine tabi tutulmuştur. Öğrenci t-testi, çeşitli ROCK inhibitörleri arasında tek hücreli kaplama etkinliğindeki farklar istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Tekil Yıldız işareti (*) inhibitörleri (P & # arasında anlamlı farklılık gösterir62; 0.05), (**) gözlenen fark gösterir çift yıldız işaretleri istatistik önem (p <0.05) olduğunu belirtir. Histogramlarda Sütunlar dörtlü belirleyicileri ve barlar ortalama değerleri standart sapmaları temsil adayı.
ROCK inhibitörlerinin varlığı olmadan laminin-521 (LN-521) üzerinde hiPSCs Şekil 3.. NCM kültürü. SCU-i30 hiPSC hat Hücre Ünitesi Kök NIH kurulmuştur. SCU-i30 hücreleri, ROCK inhibitörleri gibi küçük molekül inhibitörlerinin kullanımı olmaksızın 15 geçişleri için xeno-içermeyen ortam içinde TeSR2 LN-521 ile kaplanmış 6-yuvalı plakalar üzerinde yetiştirildi. Bir anti ile SCU-i30 hücrelerin (A) immün Nanog-poliklonal antikor ve Hoechst 33342 (Hoechst) ile zıt boyama yapılmıştır. Özellikle, olumsuz Nanog lekelenme bazı hücreler th vardırmitoz altında e hücreleri. (B) Y-27632 olmadan LN-521 10 uM Y-27632 (üst panel) veya NCM kullanımı ile% 2.5 Matrigel NCM olarak yetiştirilen SCU-i30 hücrelerinde hPSC markör ifade akış sitometrik analizi (Alt panel). İmmunosteyn ve akış sitometri analizi hem prosedürler daha önce 5 tarif edildi. Ölçek çubukları 100 mikron betimliyor. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Sırası ile, Şekil 4,. MicroRNA transfeksiyonu için hPSCs of NCM kültürü. WA01 HESC 2 (A) için mTeSR1 içinde% 2.5 Matrigel NCM gibi büyütüldü ve 18 (B) pasajlar. Dy ile transfekte WA01 hücrelerin Örnek faz ve floresans görüntüleriTransfeksiyondan 24 saat sonra, transfeksiyon verimini izlemek için kontrol microRNA 547 etiketli. Ölçek çubukları 100 mikron temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvansiyonel (besleyiciler veya hücre dışı matrisler üzerinde hücrelerin) koloni tipi kültür ve besleyiciler 6 olmadan agrega olarak hPSCs süspansiyon kültürü: in vitro kültür hPSCs iki ana yolu vardır. Koloni tipi ve süspansiyon hem kültür yöntemleri sınırlamalar birikmiş heterojenliği ve kalıtsal epigenetik değişiklikleri içerir. NCM kültür, tek hücreli bir pasaj ve yüksek yoğunluklu bir kaplama her iki hücre göre, 6,18 hPSC büyüme için yeni bir kültür yöntemi temsil eder. Çeşitli tek hücreli pasajı yöntemleri literatürde belgelenmiştir, ancak bunların hiçbiri rutin yayılma için kullanılır, ancak. Örneğin, Wu ve arkadaşları hPSC büyüme 19 üzerinde çeşitli küçük moleküller kokteyller etkilerini incelemek için bir tek hücre pasajı yöntemi kullanılmaktadır. Ancak, son kültür ürünleri kolonileri vardır. Yani, düşük yoğunluklu-tabanlı tek hücreli Pasajlanması yöntemleri hala koloni tipi kültürüne aittir. NCM kültür, yüksek dens ile ilgiliNihai hücre ürünün homojen bir tek-tabakalı olduğu ity kaplama, yeni bir yöntem, bu kültür dönüştürür. Son zamanlarda, Dvorak ve arkadaşları kapsamlı bu büyüme durumu 18 altında hPSC özelliklerini analiz etmek için benzer bir yöntem kullanılır. Bunların sonuçları da bizim önemli sonuçları desteklemek. Bu NCM kültürü birçok yeni özelliklere sahip gelişmekte olan bir yöntemdir ve ayrıca pluripotent kök hücre biyolojisi birçok potansiyel uygulamalar için modifiye edilebilir olduğu açıktır.
NCM kültür hPSCs temel özellikleri
Bu hücrelerin aynı türleri ile hPSCs NCM'ye altında kültür payı birçok özellikleri kolonilerin 9,18 olarak yetiştirilen düşünülebilir. Ekim-4, Nanog, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 ve SSEA-1, hPSCs hESC belirteçleri ait ekspresyon seviyeleri NCM ve koloni kültürü tipi hem de benzerdir . NCM adapte hücreleri de M yetiştirilen hPSC koloniler benzer küresel mRNA ifadesi kalıplarınıEF besleyici tabakalar 9. Teratom tahlil 9,18 ile belirlendiği gibi Açıkçası, NCM adapte hücreleri pluripotent durumunu sürdürmek. Bununla birlikte, hPSC koloniler farklı olarak, NCM koşullar altında hücrelerin istikrarlı büyüme eğrileri, hücre döngüsü ve hücre sayıları 9 ile karakterize edilen bir tahmin edilebilir bir büyüme oranına sahiptir. Nedeniyle yüksek yoğunluklu tek hücreli bir kaplama için, NCM koşullar altında hPSCs böylece MEF'ler yetişen koloniler hPSC kıyasla 4 kat, hücre sayısını artırarak, 2 ve 4 (Şekil 1 B) arasında üstel bir büyüme sergilerler. Uzun süreli kültür hücre üretimi artırmak değil, aksine apoptotik ve farklılaşma stres 9 arttırır. NCM da böylece çözülmüş hücreleri (Protokol 1) kaplama üzerine hızlı hücre iyileşme sağlayan, en iyi kriyo-korunmasının sağlar. Ayrıca, NCM çeşitli xeno-serbest protokolleri 9 hPSC kültürünün adaptasyonu kolaylaştırır. Genel olarak, NCM, hPSCs gelişimini destekler pluripotent durumunu korur ve po ayaktaüç germ yetişkin dokuların içine ayırt etmek için hPSCs ve uzaysal.
NCM'ye altında hPSCs kromozomal stabilite
Kromozomal stabilite açısından, farklı kültür yöntemleri hücreler arasında doğrudan bir karşılaştırma yoktur. G-bantlama, dizi tabanlı karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) 9 tarafından belirlenen bizim NCM kültür koşulları altında hPSCs çoğunluğu normal karyotipe ve gen kopya numaraları var. İki satır (~% 13), bir satır (yani, WA09) Trizomi 20 9 ile hücrelerin% 14 vardı yükseltilmiş poliploidi ve başka bir (ES01) sergiledi ki, anormal karyotip gösterdi. Bu anormal karyotip elde edilmiştir belirsizdir NCM önce kültür ya da NCM adaptasyon esnasında uyarılan mutasyona uğramış hücreleri önceden seçimi. Bu başlangıç hPSC kolonileri veya kolonilerin alt kümesini NCM kültür sh için kullanılan önemlidirNCM adaptasyon için zaman onların homojenlik ve kromozomal istikrar açısından iyi karakterize ould. Özellikle, NCM koşullar altında anormal karyotiplerin oranı yazarları baskın koloni tipi kültür koşulları altında 20% 34 anormal karyotipe ortaya ettiği yeni bir grup analizi, bildirilen çok daha düşüktür. Dolayısıyla, bizim çalışma biz ayrışmış tek hücreleri büyümek ve NCM koşullar altında kromozom istikrarı korumak olduğunu gösterir. Bununla birlikte, biz de önümüzdeki yıllarda hPSCs kromozom anormallikleri incelemek için daha duyarlı yöntemler kullanmak gerekir. Bu sık sık değişikliğe kromozomların bazı küçük lezyonlar (örn., 20q11.21 amplikonu) geleneksel tarafından tespit edilemez Özellikle, biz, daha yüksek çözünürlüklü sondalar (yani <50 kb) kullanılarak kromozom 1, 12, 17, ve 20 taramak gerekir karyotip ve FISH 20-22. Ayrıca, çeşitli NCM protokollerin geliştirilmesi ROBU tespit bize sağlayacakst ve gelecekteki uygulamalar için güvenli yöntemlerdir.
Çeşitli değişiklikler altında NCM kültür
ROCK inhibitörü, Y-27632, bu kullanımda, bir hücreye dayalı tahlilleri için kapıyı açtı. Farklı ROCK inhibitörlerinin durumu hPSCs NCM tabanlı genişleme ve dondurarak saklama (Şekil 2) için ek seçenekler sağlayacaktır. Teorik olarak, önemli ölçüde tek hücreli kaplama verimliliğini artırabilir herhangi bir küçük molekül, NCM kültür kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu farklı ROCK önleyicileri, bu tür bir örnek 9 temsil eder fonksiyonları JAK önleyici 1,. Tek moleküllerin veya kombinasyon yaklaşımların kullanılması bize optimum hücre büyümesini, hücre deneyleri, ve hPSCs ve kryopreservasyon sağlayabilir. Ancak, bu normal olarak 23-25 HESC olarak ifade edilen laminin izoformu LN-521, olarak tanımlanır, hücre dışı matris proteinleri, ilgili hPSCs alternatif NCM kültür küçük müdahaleyi ortadan kaldırabilmektedirmolekülleri (Şekil 3). LN-521 ayrışmış-hPSC canlılığını geliştirmek ve α6β1-PI3K/AKT yolunun 24 aktivasyonu yoluyla pluripotensini ayakta olabilir. LN-521 ile pasajı hPSCs basitliği tam olarak tanımlanmış bir ortam (Protokol 4) kullanılarak, çeşitli besleyici içermeyen ve xeno içermeyen hücre kültürü sistemleri ile uyumlu hücrelerinin heterojen azaltır. Ayrıca, küçük moleküllerin etkisi olmadan yüksek verimlilik deneyleri için bir modülü içerir. LN-521 on NCM kültürü altında iPSCs hPSC belirteçler, teratom deneyi ve embriyoit vücut dolayımlı multilineage farklılaşmasını kullanılarak bu hücrelerin daha iyi karakterize bir panel ekspresyonunu korumuş olmalarına rağmen bu hücrelerde pluripotent durumları teyit etmek için gerekli olabilir. Notun, hiPSCs laminin izoformu LN-521 bildirildi sitogenetik stabildir (http://biolamina.com/) üzerine kültüre. (Yukarıda anlatıldığı gibi) Ancak, biz de e daha yüksek çözünürlüklü ve duyarlı yöntemleri uygulamak gerekirBu hücrelerdeki kromozom istikrar xamine.
Genetik mühendisliği için NCM kültür yönlülük
NCM dayalı yöntemler hPSCs (Protokolleri 5-7) genetik manipülasyonu için özellikle faydalı olabilir, basit, sağlam ve ekonomik bir sistemi temsil eder. Bu koloniler HESC transfekte ya da farklı laboratuarlar 26-28 arasında, transfeksiyon / transdüksiyon etkisinde büyük bir değişkenlik ile transdükte zor olduğu bilinmektedir. Örneğin, hESC transfeksiyon verimi 3 koloni kültür koşulları altında 26% 35 arasında değişmektedir. Koloni koşullar altında BG01 hücrelerinde Lentiviral iletim sinyalleri 9, son derece düşük olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, NCM aracılık transfeksiyon verimi% 75 'den daha büyük 9 ve nakil yöntemleri modifikasyonu 90% 28 kadar lentivirüs aracılı iletim verimliliğini artırabilir. Sıkı bir karşılaştırmalı çalışma, inci olduğunu ortaya koymuşturdüşük transfeksiyon verimi 9 katkı HESC kolonideki e çok hücreli birlikleri. Ayrıca, kısa bir süre önce microRNA transfeksiyon protokol yapılması ve lentivirüsler (Protokol ve Şekil 4, 6) kullanılmaksızın yüksek transfeksiyon verimi (~% 91) elde etmek mümkün olan var. 5 günlük bir süre için - Bu protokol, kullanımı kolay ve bir 3 içinde geçici transfeksiyon deneyleri için kullanışlıdır. Yukarıda tarif protokollerinde olarak, hPSCs transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği optimize zaman, birden fazla faktör hususlar dikkate alınmalıdır. Bu faktörler hücre yoğunluğu, plazma konsantrasyonları, lentiviral titerleri, enfeksiyonun çokluğu (MOI), transfeksiyon / transdüksiyon süresi, reaktiflerin sitotoksisite ve Transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği için kullanılan yöntemler bulunmaktadır.
Biz ayrıntılı ve Matrigel ve tanımlanmış hücre dışı matrislerin üzerinde kültür hPSCs için NCM yöntemleri genişletebilir. Bu kültür yöntemiyaygın hPSC koloni ve toplanmış kültürler bulunan heterojenliği ortadan kaldırmak için etkili bir yoldur. NCM büyüme koşulları altında insan pluripotent kök hücreleri pluripotent ve kromozomal stabildir. Bu yeni kültür sistemi hPSC bakımı, büyük ölçekli genişleme ve genetik manipülasyonlar için basit ve çok yönlüdür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
- Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
- Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
- Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
- Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
- Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
- Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
- Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
- Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
- Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
- Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
- Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
- Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
