Summary
Denna uppsats presenterar de metoder som används för att sondera rumsligt korrelerade kemiska, strukturella och mekaniska egenskaper hos den flerskiktade skala Atractosteus spatel (A. spatel) använder nanoindentation, Fouriertransform infraröd (FTIR) spektroskopi, svepelektronmikroskop (SEM), och X- ray datortomografi (röntgen-CT). De experimentella resultaten har använts för att undersöka de konstruktionsprinciper för skyddande biologiska material.
Abstract
Den hierarkiska strukturen för skyddande biologiska material såsom mineraliserade fiskfjäll, snäckor, snäckor, bockhorn, horn och sköldpaddsskal ger unika designprinciper med potential för att styra utformningen av skyddsmaterial och system i framtiden. Förstå struktur och egenskaper för dessa materialsystem på mikroskala och nanoskala där fel initierar är viktigt. För närvarande, experimentella tekniker såsom nanoindentation, röntgen CT, och SEM ger forskare med ett sätt att korrelera det mekaniska beteendet med hierarkiska mikrostrukturer i dessa materialsystem 1-6. Dock finns för närvarande inte en väldefinierad standardförfarande för extraktion av mineraliserade biomaterial. I denna studie, metoder för sondering rumsligt korrelerade kemiska, strukturella och mekaniska egenskaper hos den flerskiktade skala A. spatel använder nanoindentation, FTIR, SEM, med enenergi-röntgen (EDX) mikroanalys, och röntgen CT presenteras.
Introduction
Forskare undersöker strukturella biomaterial och försöker belysa de konstruktionsprinciper, som ger strukturella biomaterial med förbättrade mekaniska egenskaper såsom mycket högre seghet och styrka jämfört med sina enskilda beståndsdelar. Undersökningarna om konstruktionsprinciper för pansarfiskfjäll för Pagrus större 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus carpio 4, och Atractosteus spatel 1 har visat på behovet att utvidga tillämpningen av befintliga experimentella metoder för att studera de strukturella svar och mikrostrukturella egenskaper, eftersom detaljerade standardförfaranden är inte tillgängliga för dessa typer av material och experiment.
Bland de olika bepansrade fiskfjäll som diskuteras, A. spatel är ett historiskt apex rovdjur i centrala US 8 och är en art med högly mineraliserade skalor. Börserna arter muskelmassa för huden massa för att få en förbättrad rovdjur försvarssystem jämfört med fiskar av jämförbar storlek som tidigare 9 nämnts. Enligt Page och Burr 10, A. spatel är den tredje största sötvattensfisk i Nordamerika med den vita stören (Acipenser transmontanus) och atlantisk stör (Acipenser oxyrhynchus) är större arter. De högt mineraliserade fiskfjäll av A. spatel är först nyligen som studeras. Thompson och McCune 11 föreslog att morfologin hos plaggen skalor har en tre-skiktskomposition bestående av en ganoine yttre skikt, ett diffust ben skikt och lamellärt ben skiktet. Aktuell forskning om A. spatel skalor har inte särskiljas benet lagret i diffusa eller lamellära ben regioner, men har bara studerat benet regionen som enda inre skikt 1,12.
I denna studie, de förfaranden som ivestigating mikrostrukturen, nanostruktur, kemisk sammansättning, och spatiala fördelningarna av de mekaniska egenskaperna hos skalorna i A. spatel baserat på resultat från FTIR spektroskopi, SEM, röntgen CT, och nanoindentation tekniker presenteras.
Protocol
1. Fish Scale Provberedning
För denna studie har skalor som erhålls från den amerikanska armén iscensätter forskning och utveckling Center (ERDC) Environmental Laboratory vid halva längden (29: e caudal kolumn) från en ca 600 mm lång gar (A. spatel). De fiskfjäll erhölls enligt ERDC och National Institute of Health (NIH) riktlinjer djurskötsel.
- Material
Notera den rumsliga placeringen på fisken av skalorna som erhållits för studien. Se till att hålla sig till rätt organisation eller statliga riktlinjer för att erhålla biologiska prover såsom riktlinjer NIH djurskötsel. Förvara skalorna i en adekvat medium såsom fosfatbuffrad koksaltlösning för att bevara fukt och upprätthålla mineralinnehåll när de väl har avlägsnats från fisken. Undvik långvarig förvaring som kan resultera i mineralförlust, vilket kan påverka nanoindentation data. Använd ett medium borste och tweezers att avlägsna eventuell mjuk vävnad från de hårda skalor. - Specimen Montering och snitt
Undersöka ett tvärsnitt av fisken skala kort-axeln (figur 1) med hjälp av FTIR och nanoindentation kräver första monterings skalan i ett stelt medium, såsom en tvådelad epoxi som består av ett harts och härdare. Använd allmänt ändamål RT härdande epoxi med låga topptemperaturer, såsom det kommersiella allmänna ändamål epoxi används i denna studie som hade en topptemperatur av mindre än 55 ° C.
Figur 1. Röntgen CT-bilder av A. spatel skala som visar sektionen kort axel tvärs undersökts i denna studie av A. spatel använder nanoindentation och FTIR [A (främre), P (bakre), D (rygg), V (ventrala)]. </ P>
- Håll fisken skala i en 32 mm prov diameter mögel med hjälp av en kommersiellt tillgänglig provplasthållare. Detta håller provet rätt medan montering i epoxin.
- När väl provet hålles i formen, häll den ohärdade epoxin på provet och sedan tillåta epoxin att härda i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- När epoxin har härdat, avsnittet monterade provet med en diamantklinga med hög precision cut-off såg vid mittlinjen av provet.
- Sonikera i destillerat vatten under 15 minuter för att avlägsna eventuella rester från provet.
- Polering för Nanoindentation och FTIR
För att få en jämn plan yta för nanoindentation som visas i figur 2, är följande poleringsförfarande och parametrar som föreslås bygger på diskussioner med polermaskin tillverkning och testprover. Parametrarna kan dock behöva justeras för olika biomaterial baserade på svarensåsom materialavverkning. Ultrasonication av prover i ett bad med destillerat vatten mellan polersteg är viktigt att se partiklar från ett grövre polersteg inte förs in i en efterföljande finare polersteg.
Figur 2. Bild av en polerad kort axel tvärs avsnitt A. spatel skala monterad i epoxy.
- Grov polera med en 15 | im SiC pad och vatten som smörjmedel tills provet är planet använder automatisk polerhuvudet kraft 7 Ibf och hastighet 200 varv per minut (rpm).
- Sonikera provet i ett bad med destillerat vatten i 15 min.
- Mellan polera med en 6 ìm SiC pad med vatten smörjmedel vid en platta hastighet på 130 varv per minut och en kraft 7 lbf för5 min.
- Sonikera provet i ett bad av destillerat vatten under 15 min.
- Polera med ett 1 | im SiC dynan med användning av vatten smörjmedel vid en platthastighet av 130 rpm och en kraft av 7 Ibf i 5 min.
- Sonikera provet i ett bad med destillerat vatten i 15 min.
- Slutlig polera med en 50 nm kolloidal kiseldioxid suspensionen med hjälp av en lämplig polerdyna, såsom en hög densitet, non-woven, låg tupplur porös polyuretan som en tillverkare föreslår för 50 nm-suspensioner. Polska vid en hastighet av 130 varv per minut med en kraft av 7 Ibf i 5 min.
- Sonikera provet i ett bad med destillerat vatten i 15 min.
2. Nanoindentation Test
- Kalibrera nanoindentation systemet före varje sats av test per den tillverkar riktlinjer. Kalibreringen bör innefatta fastställande av systemets område funktion för Berkovich spets och ram styvhet. Dessutom utför ett mikroskop-till-indenter kalibrering i detta stegatt se till att streck korrelerar till de valda mikroskop platser.
- Placera provet i nanoindenter och använda de optiska kontroller mikroskop på nanoindenter att bringa provet i fokus.
- Använd kontrollerna programvara för att flytta provet till platsen för den första strecksatsen. Idealiskt är detta cirka 10 um i epoxin från kanten av den ganoine skiktet längs centrumlinjen av skalans tvärsnitt.
- Utför 4 parallella rader med indrag inbördes avstånd av 15 nm från varandra för att få en statistiskt signifikanta uppgifter fastställs med början på den här platsen. Ställ nanoindenter till en maximal belastning på 5 mN, lastning och lossning hastigheter på 0,1 mN / sek, en hålltid på 30 sek, och en lägsta strecksatsen avstånd på 5 um för varje rad. Raden av strecksatser bör ställas in för att köra vinkelrätt mot ganoine ytan, och ett tillräckligt antal strecksatser bör anges för att resa över hela skalan tvärsnitt medan korsa cirka 10 mikrometer i EPoXy förbi benig skiktet.
- När satsen är klar, har nanoindenter skapa referens strecksatsen med en maximal belastning på 100 mN vid den första och sista strecksatsen, som bör vara i epoxin innan ganoine skiktet och efter benet lagret, respektive. Dessa korrelerar till start-och slutpunkter för varje rad av strecksatserna.
- Efter nanoindentation, placera provet tillbaka i PBS-lösning för att undvika ytterligare uttorkning.
- Använd nanoindentation programvara för att bestämma modul och hårdhet baserat på Oliver-Pharr metod 13 om en tidsoberoende material respons observeras. Annars hold-tiden kan behöva utvidgas till att övervinna den kryp observeras från lossning för snabbt.
3. Rumsligt upplösta ATR-FTIR spektroskopi
Användningen av en slid-on ATR tillbehör fäst vid en FTIR mikroskop är en föreslagna metoden för att samla in rumsligt upplösta Fouriertransform infraröd (FTIR)-spektra av de layers i en fisk skala prov. ATR-tillbehör möjliggör samling av hög kvalitet spektra med mycket liten (~ 10 | im 2) spatial upplösning, som inte kan uppnås med någon annan FTIR-teknik. Samma polerade provet (Figur 2), som framställts för nanoindentation experiment användes i dessa experiment.
- Välj ett prov med en yta och dimensioner lämpliga för FTIR mikroskop som används för analys för att säkerställa hög kvalitet spektra erhålles från ATR-FTIR spectromicroscopy.
- Förbered FTIR mikroskop för att samla in data. FTIR micro kräver kalibrering av FTIR-signalen under samma provtagningsförhållanden som kommer att användas för att mäta provet. Typiskt innefattar detta kylning av detektorn och ger tid för den att stabilisera samt uppsamling av all bakgrundsspektra och provspektra under samma miljöförhållanden. Detta kan vara särskilt viktigt, eftersom CO2 och vattenånga i luften kan dramatically påverka FTIR spektra. Det är också viktigt att säkerställa att instrumentets optik är i linje.
- Samla en lämplig bakgrund spektrum att subtrahera provet mot. För dessa experiment var en polerad, guld-belagda objektglas som används som bakgrund för FTIR spectromicroscopy.
- Med hjälp av ett lämpligt mål, fokusera på provet och markera ett område av intresse för analys.
- När ett intressant område påträffas, fäst ATR-tillbehör till mikroskopobjektivet FTIR, höja provet tills den kommer i intim kontakt med ATR inre reflektionselement, och samla in ett provspektrum.
- Efter uppsamling av FTIR spektra, utföra de nödvändiga standard databehandling som krävs.
4. Röntgen datortomografi (CT)
- Skaffa och förbereda skala som diskuteras i avsnitt 1.1
- Skannerinställning
- Warm-up röntgenkälla enligt tillverkarens specifikationer.
- Set röntgen spänning och ström till 50 kV och 160 pA, respektive.
- Ställ in exponeringstiden till 1.450 msek.
- Välj en 1,0 mm aluminiumfilter.
- Före lastning prov, göra en platt-fältkorrigering när röntgenkällan är avstängd (mörkfält) och på (ljusfält).
- Sätt i och Load Specimen
Vågar måste monteras på ett sådant sätt så att de inte flytta eller flytta hela längden på skanningen. Dessa prov måste också monteras med hjälp av material som är nästan transparent för röntgenstrålning. En kombination av frigolit och Parafilm kan användas för att fästa skalan till CT-scenen.- Stelt montera provet så att den längsta dimensionen är parallell till detektorn.
- Fäst det monterade provet till skannern skede.
- Placera provet så att det kommer att vara i centrum av rotation under hela avsökningen.
- Välj den högsta upplösning som medger att hela skalan vara i synfältet (FOV), i detta fall7,5 | im.
- Förvärvs Inställningar
Utför skanningar i denna studie med ett rotationssteg på 0,25 ° och en ram medelvärdes värde på 15. Om lägre upplösningar är acceptabla, öka steglängden och / eller minska ramen genomsnitt att minska den totala söktiden. - Rekonstruktionsparametrar
Så snart en uppsättning data har erhållits, rekonstruera röntgenprojektionsbilder för att skapa en datauppsättning som innehåller tvärsnittsbilder. Välj SkyScan s NRecon programvara standardinställningar med undantag för följande.- Ändra ring Artifact Korrigering till 20.
- Ändra Beam Härdning Korrigering till 25%.
- Justera CS Statisk Rotation att göra tvärsnittsbildnivå.
- Bildbehandling
Använd SkyScan s CTAN programvara för att få den slutliga 3D gråskalebilden. Justera gråskala område till en lämplig nivå för att ta bort artefakter från frigolit och Parafilm.
Prover som utarbetats av polering för nanoindentation och micro-/nano-structure karakterisering undersöktes med hjälp av svepelektronmikroskop (SEM). Low-vakuumläge användes för att minimera uttorkning av exemplar och behovet av applicering av ledande beläggningar. Lokal kemisk analys utfördes på polerade prover i samband med SEM avbildning med energiröntgenspektroskopi (EDX). EDX analyser utfördes på samma rad / rutnät som analyserades med nanoindentation för att ge samband mellan kemiska och mekaniska egenskaper. Nyligen brutna ytor undersöktes också med SEM för att ge bättre information om morfologi och orientering biomineralized strukturer som finns i fiskfjäll. För att förbättra upplösningen för observation av nanonivå struktur på brutna ytor, var prover spotta belagda med guld (Au) och avbildas i högvakuum läge. Följandeger ytterligare information om de förfaranden som används.
- SEM Imaging av polerade ytor
- Placera polerade provet till SEM kammaren och pumpkammare in i låg-vakuumläge med cylindertryck av 0,1 till 0,5 mbar.
- Justera arbetsavstånd på ca 5,0 mm.
- Aktivera högspänning (HV) och navigera till regionen av intresse på provet som innehåller övergångszonen mellan ganoine och beniga underskikt eller andra områden av intresse.
- Få bilder vid 15 kV HV och balk ström på cirka 3,9 nA.
- Fokus bild och utför alla nödvändiga anpassningar och justeringar stigmation.
- Ta bilder från minst tre regioner av intresse vid relevanta förstoringar (typiskt 250X till 10.000 X) med hjälp av låg-vakuumbakåtspridda elektron (BSE) detektor för att underlätta identifiering av förändringar i biomineral innehåll och densitet (dvs. tät ben vs poröst ben ).
- SEM avbildning av Bröt Ytor
- Fäst nyligen brutna exemplaret till en 90 ° SEM stöta med dubbelhäftande kol tejp med brottytan uppåt.
- Spotta päls med Au för att ge en sub-nm tjockt ledande skikt på brottytan.
- Placera provet i SEM kammare och pumpkammare i högvakuum läge.
- Justera arbetsavstånd på mellan 3,0 och 5,0 mm.
- Aktivera HV och navigera till områden av intresse på provet. Primära intresseområden i det här fallet var strukturen som finns i ganoine och beniga lager.
- Få bilder på mellan 5 kV och 15 kV HV och en undre balk ström på 0,24 nA att förbättra upplösningen.
- Inledningsvis fokuserar prov och utföra preliminära inriktningar.
- Öka förstoringen till mer än 5.000 X och växla från normal fältemissions lins i nedsänkning / extremt hög upplösning (UHR) lins.
- Utför UHR anpassningar och justeringar stigmation.
- Ta bilder från minst tre regioner of intresse på relevanta förstoringar (normalt 5.000 X till 250.000 X) med hjälp av genom linsen detektorn (TLD) som drivs i (SE) läget sekundär elektron.
- EDX-analys av polerade ytor (utförs i samband med SEM imaging). Dessa parametrar är materialberoende och kommer att behöva justeras så att EDX interaktionen volymen är ungefär lika stor som den nanoindentation interaktionsvolymen som diskuteras av Moser 14.
- Navigera till regionen av intresse på polerade exemplar som inkluderar nanoindentation rutnät som anges av referenspunkter i slutet av varje rad strecksatser.
- Se till att HV är minst 15 kV är strålströmmen minst 3,9 nA, och arbetsavstånd är större än 5,0 mm.
- Fånga BSE bild av regionen som skall analyseras med hjälp av EDX.
- Med hjälp av EDX analys programvara, ta samma bild för att hjälpa till att lokalisera områden för att utföra kemiska analyser längs linjen av strecksatserna.
- Med hjälp av "Linje Analysis" teknik, ponings en linje för att utföra kemiska analyser längs linjen av intresse indrag börjar vid den första strecksatsen och slutar vid den sista strecksatsen.
- Ange antalet analyspunkter som skall placeras längs linjen. Det är bäst att använda samma antal analyspunkter och indrag som är närvarande för att tillhandahålla ett direkt spatial korrelation mellan kemisk sammansättning och mekaniska egenskaper.
- När linjen är på plats och pekar anges korrekt, inleda raden analys med EDX programvara.
- När linjen analysen är slutförd, identifiera delar av intresse som skall kvantifieras från punkten spektra som erhålls längs den angivna linjen på den polerade ytan av provstycket.
- När delar av intresse identifieras, utför en bakgrundskalibrering att redovisa Bremsstrahlung strålning och andra effekter.
- Välj programvarans deconvolution analys möjlighet att erhålla kvantitativ analys på varje punkt längs den angivna linjen att kvantifierafiera den kemiska sammansättningen i varje punkt.
- Spara kvantitativa kemiska analysresultat tillsammans med bilden av angiven linje som analyserades till stöd i spatial korrelation med mekaniska egenskaper som mäts med nanoindentation.
Representative Results
Figur 3 visar de genomsnittliga resultaten av rumsligt korrelerade nanoinidentation / SEM / EDX-analyser genomförs över ca 800 nm lång kort axel tvärsnitt. I cirka 60 ^ m tjock ganoine skiktet, nanoindenter beräknas en medelelasticitetsmodul av 69,0 GPa och hårdhet av 3,3 GPa. Den nanoindenter fastställt en genomsnittlig modul av 14,3 GPa och hårdhet av 0,5 GPa för cirka 740 nm tjockt ben lager.
EDX bestämmas kol, syre, kalcium och fosfor, som normalt finns i mineraliserade skalor. Men ganoine och skelettlager innehöll kvantifierbara skillnader i kemisk sammansättning. Den observerade kol spik i benet lagret kan hänföras till den regionen inte är så starkt mineraliserade, vilket resulterar i en liten ökning av kol som också orsakade den observerade minskningen av ljusstyrkan i BSE-bilden. Specifikt ganoine skiktet ", S menar atomförhållande koncentration av Ca: P av 1,71 verkade liknar hydroxyapatit med ett teoretiskt förhållande på 1,67. Benet lagrets genomsnittliga Ca: P förhållandet minskade till 1,51 vilket motsvarar en minskning av mängden av mineralisering från ganoine lagret.
FTIR spektra i figur 4 för benet skiktet och ganoine skiktet identifierat de huvudsakliga funktionella grupper som amid, karboxyl-, fosfat-, och karbonyl. Specifikt FTIR bekräftade visuell observation av hydroxyapatit signaturer i de yttre (ganoine) lager-och kollagen signaturer i det inre (ben) skikt. Toppar vid 3,500-3,000 cm -1 grund av NH stretching och NH böjning mellan 1550 och 1500 cm-1 representerar amidgrupperna i benet lagret. Toppar i regionen av vågtalet 1,470-1,365 cm -1 representera amid-substituerade alkylgrupper. Dessutom var en distinkt C = O stretching på 1641 cm -1 observerades med ben lagret. Peaks från 3,000-2,500 cm -1 representerar karboxylgrupper. Både ben och ganoine lager-spektra producerade en distinkt topp nära 1,079.33 cm -1 indikerar stretching fosfat.
Röntgen-CT bildspråk i figur 5 fångar att ganoine skiktet inte täcker benet skiktet där vågen överlappar varandra. De ljusare grå ganoine skikt indikerar tätare, hårdare och styvare faser medan mörkare grå ben lager indikerar mindre täta och mindre stela faser. Dessutom röntgen-CT bildspråk understödda vid identifiering av icke-enhetlighet i ganoine skikttjocklek. Faktum är tydliga gropar observeras nära centrum av ganoine lagret, vilket inte täcker benet lagret alls.
SEM bild i figur 6A i brottytan etsas med H 3 PO 4 avslöjade nanostrukturer som organiseras i en skiktad mönster för ganoine lagret. Denna nanorod organiseradestruktur korrelerar till hydroxyapatit signaturer erhållits från FTIR för ganoine området.
Figur 6A visar en typisk lägre förstoring SEM av en brottyta tydligt identifiera övergången mellan ganoine och skelettlager med den streckade linjen. Figur 6B skildrar högre förstoring SEM-bilder av brottytan efter etsning med H 3 PO 4. Efter etsning, orienterade nanostavar i yttre ganoine skiktet är tydligt identifierbara när ett fiberliknande nanostruktur observeras i benet lagret.
Figur 3. Modulus och hårdhetsdata från nanoindentation rumsligt korrelerade till SEM / EDX kemisk sammansättning.
Figur 4. FTIR spektra som samlats in från den yttre (ganoine) och inre (benig) lager.
Figur 5. Röntgen-CT-bilder som visar gropbildning på den yttre (ganoine) skikt som täcker det inre (benig) skiktet.
Figur 6. (A) med låg förstoring SEM-bild av typiska brottytan, (B) högre förstoring av nanostavar i yttre (ganoine) och fibrerna i den inre (bony) lager .. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ur en experimentell synvinkel, forskare måste komma ihåg att när man arbetar med naturligt förekommande biologiskt material som mineraliserade fiskfjäll, rapporterar den rumsliga placeringen av skalan på fisken är kritisk eftersom tidigare forskning har visat mekaniska egenskaper hos mineraliserade fiskfjäll är beroende till där vågen var belägna på fisken 4.
Mekaniska egenskaper för mineraliserade biologiska material har också visat sig vara beroende av den hydratiseringstillstånd av proverna 4. Detta begränsar användbarheten av denna teknik när man försöker jämföra nya prover som har tillräckligt mycket vätska till publicerade resultat i den öppna litteraturen, som använder torra fossiliserade prover. Därför förlängda testtider måste undvikas för att minimera effekterna av uttorkning på ett prov har mekaniska egenskaper under nanoindentation. Material specifika pilotstudier rekommenderas för att säkra den erfarenhetling runtime är minimal nog att inte ändra det mekaniska uppträdandet hos materialet. Våt cell nanoindentation skulle vara en metod som föredras för att hålla en konstant hydratiseringstillstånd av materialet om testutrustning tillåter det.
Den nanoindentation metod som används i denna studie, som beräknas elasticitetsmodulen från kurvan avlastningsförutsätter att materialet uppför sig som en linjär elastisk isotropt material. Tekniken kan användas med ett stort urval av indenter tips. Emellertid var den tre-sidig Berkovich spets med en halv vinkel av 65,35 ° användes i denna studie. Alternativa tips såsom kubens hörn (halv vinkel = 35,36 °) är lämplig för det förfarande som presenteras i detta manuskript, men eftersom kuben hörn spets är mer akut än Berkovich tip sprickor kan alstras i provet vid mycket lägre belastningar än med den Berkovich dricks.
Polering är ett väsentligt steg för att erhålla en jämn och plan yta med en minimerad surface råhet att inte påverka nanoindentation resultat. Polersteg som presenteras i detta manuskript är ett förslag på förfarande som kan behöva ändras beroende på vilken typ av poler som används. Dock är det kritiska steget för att säkerställa korrekt nanoindentation data som ytjämnhet minimeras, och för detta material en 50 nm sista touchen krävdes för att få en jämn plan yta på indrag djup som sonderas.
Avståndet mellan strecksatser säkerställer också korrekt nanoindentation uppgifter som inte påverkas av den material deformation uppstår från föregående strecksatserna. Den nanoindenter bruksanvisningen för utrustningen i denna studie föreslog att strecksatsen avståndet bör vara minst 20-30x det maximala penetrationsdjupet för Berkovich indentorer 15. För alternativa material, kommer den erforderliga indrag behöver bestämmas på grundval av den pålagda lasten och maximal indrag djup såsom diskuterats tidigare i det öppnalitteratur 16,17. Dessutom var hålltiden för detta material valt att övervinna alla kryp observerats för de olika materialfaser sonde gör det möjligt att nanoindenter programvara Oliver-Pharr analysmetod som skall användas. Men som diskuterats av Oyen 18 alternativa analysmetoder finns tillgängliga för biologiskt material när tidsberoende materialsvar inte kan övervinnas med lämpliga väntetider.
För att uppnå hög upplösning resultat från röntgen CT måste flera inställningar optimeras. Detta dokument beskriver en mycket specifik uppsättning parametrar för användning på en fisk skala med en unik storlek och lager tjocklek. Med varierande urvalsstorlekar, kommer dessa inställningar behöva justeras för att få en datauppsättning av högsta kvalitet. Processen att välja varje parameter bör definieras tydligt i bruksanvisningen som följer med maskinen används. Skanningsinställningar (spänning, ström, exponering, urval filter) och återuppbyggnads inställningar(ring artefakter, beam härdning) kan behöva ändras för att rymma en mängd andra urvalsstorlekar och geometrier.
Röntgen-CT gav en bild av hela skala morfologi identifierar en ganoine skikt som täcker en benig skikt av material endast när vågen inte överlappar varandra. Den röntgen-CT bildspråk identifierade också att ganoine skiktet bestod av en icke-enhetlig tjocklek över hela skalan, och även uppvisade gropar som saknade ganoine skiktet helt och hållet.
Intressant, nanoindentation uppgifter rumsligt korrelerade till SEM / EDX kemisk analys identifierat en skarp diskret övergång mellan 2 lager i stället för en mer gradvis övergång observeras för de mineraliserade fiskfjäll av P. senagalus (i Bruet et al. 2).
En kombination av nanoindentation, FTIR, EDX, och SEM förutsatt mekaniska egenskaper, kemisk analys och strukturell information för att bekräftadet yttre skiktet som ganoine med emalj-liknande morfologi och kemi. Dessutom bekräftades dessa tekniker det inre skiktet som en benig materialskikt.
Sammanfattningsvis, de metoder som beskrivs i denna studie identifierat förfarande och motsvarande resultat för att undersöka den mineraliserade fisk skala A. spatel från bulkstruktur ned till nanostruktur och kemiska sammansättning.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för det ekonomiska stödet till detta arbete ges av den amerikanska armén ERDC Military Engineering 6.1 Basic Research Program och ERDC Center for Directed Research Program. Författarna vill också tacka personalen och anläggningar i ERDC geotekniska och struktur Laboratory Betong och Materials gren för att stödja det experimentella arbetet. Tillstånd att publicera beviljades av direktören, Geotekniska & Structures Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy resin | Buehler | 701-501512 | |
| Epoxy hardener | Buehler | 703-501528 | |
| Samplkups | Buheler | 20-8180 | |
| SamplKlips I | Buehler | 20-4100-100S | |
| High precision cut-off saw | Buehler | Isomet | |
| UltraMet 2002 sonic cleaner | Buehler | B2510R-MT | |
| Polisher | Buehler | 49-1750-160 | |
| 1,200 grit (15 μm) SiC paper | Struers | 40400012 | |
| 4,000 grit (6 μm) SiC paper | Struers | 40400014 | |
| 50 nm colloidal silica | Buehler | 40-10075 | |
| Chemomet polishing pad for 50 nm suspension | Buehler | 40-7918 | |
| Nanoindenter | MTS | G200 | |
| FTIR continuum microscope | Thermo Nicollet | 6700 | |
| X-ray computed tomography | Skyscan | Skyscan 1173 | |
| SEM | FEI | NovaNanoSEM 630 | |
| EDX | Bruker | AXS Xflash detector 4010 | |
| Sputter coater | Denton | Desk II |
References
- Allison, P. G., et al. Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales. Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).
- Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. Materials design principles of ancient fish armour. Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).
- Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).
- Marino Cugno Garrano, A., et al. On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).
- Song, J., et al. Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).
- Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton. J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).
- Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major. 142, 327-333 (2003).
- O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana. Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).
- Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus. J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).
- Page, L. M., Burr, B. M. A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , Houghton Mifflin Company. (1991).
- Thompson, K. S., McCune, A. R. Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes. J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).
- Yang, W., et al. Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales. Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).
- Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX. J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).
- Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).
- Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , Agilent Technologies Inc. Palo Alto. (2012).
- Ulm, F. J., et al. Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale. J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).
- Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -J. Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces. J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).
- Oyen, M. L. Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials. Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).
