Summary
Denne artikel præsenterer de anvendte metoder til sondering rumligt korreleret kemiske, strukturelle og mekaniske egenskaber af flere lag omfang Atractosteus spatel (A. spatel) ved hjælp af nanoindentation, Fouriertransformation infrarød (FTIR) spektroskopi, scanning elektronmikroskopi (SEM), og X- ray computertomografi (X-ray CT). De eksperimentelle resultater er blevet anvendt til at undersøge design principper for beskyttende biologiske materialer.
Abstract
Den hierarkiske struktur af beskyttende biologiske materialer, såsom mineraliseret fiskeskæl, havsnegle skaller, vædderhorn, gevirer, og skildpaddeskjolde giver unikke design principper med potentialer for at lede design af beskyttende materialer og systemer i fremtiden. Er vigtigt at forstå de struktur og egenskaber for disse materiale systemer på mikroskala og nanoskala, hvor fiasko initierer. I øjeblikket eksperimentelle teknikker såsom nanoindentation, røntgen CT, og SEM give forskerne en måde at korrelere den mekaniske adfærd med hierarkiske mikrostrukturer af disse materielle systemer 1-6. Men en veldefineret standard procedure for udarbejdelse af mineraliseret biomaterialer eksemplar er i øjeblikket ikke tilgængelig. I denne undersøgelse metoder til sondering rumligt korrelerede kemiske, strukturelle og mekaniske egenskaber af flerlags skala A. spatel hjælp nanoindentation, FTIR, SEM, med enenergi-Dispersive X-ray (EDX) mikroanalyse, og røntgen CT præsenteres.
Introduction
Forskere undersøger strukturelle biomaterialer og forsøger at belyse design principper, som giver strukturelle biomaterialer med forbedrede mekaniske egenskaber, såsom meget højere sejhed og styrke i forhold til deres individuelle bestanddele. Undersøgelserne på de principper for udformningen af pansrede fiskeskæl for Pagrus større 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus carpio 4 og Atractosteus spatel 1, har vist behovet for at udvide anvendelsen af de eksisterende eksperimentelle metoder til at studere de strukturelle svar og mikrostrukturelle egenskaber, da detaljerede standardprocedurer er ikke tilgængelige for disse typer af materialer og eksperimenter.
Blandt de forskellige pansrede fiskeskæl diskuteret, A. spatel er en historisk spids rovdyr af den centrale US 8 og er en art med højly mineraliseret skalaer. Arten udvekslinger muskelmasse for hud masse at opnå et forbedret rovdyr forsvarssystem i forhold til fisk af sammenlignelig størrelse tidligere 9 nævnt. Ifølge Page og Burr 10 A. spatel er den tredje største ferskvandsfisk i Nordamerika med den hvide stør (Acipenser transmontanus) og Atlantic stør (Acipenser oxyrhynchus) er større arter. De højt mineraliseret fiskeskæl A. spatel er først for nylig blevet undersøgt. Thompson og McCune 11 foreslog, at morfologien af gar skalaer har en tre-lags sammensætning bestående af en ganoine ydre lag, en diffus knogle lag og lamellar knogle lag. Aktuel forskning på A. spatel skalaer har ikke skelnes knoglen lag i diffus eller lamellære knogle regioner, men har netop studeret knoglen regionen som en enkelt indvendig lag 1,12.
I denne undersøgelse af procedurerne for ivestigating mikrostruktur, nanostruktur, kemiske sammensætning, og rumlige fordelinger af de mekaniske egenskaber af skalaerne i A. spatel baseret på resultater af FTIR-spektroskopi, er SEM, røntgen CT, og nanoindentation teknikker præsenteres.
Protocol
1.. Fish Scale Prøveforberedelse
Til denne undersøgelse blev skalaer opnået fra den amerikanske hær Engineer Research og Development Center (ERDC) Environmental Laboratory midtskibs (29 th caudale kolonne) fra en cirka 600 mm lang gar (A. spatel). De fiskeskæl blev opnået i henhold til ERDC og National Institute of Health (NIH) retningslinjer dyrepleje.
- Materialer
Optag den rumlige placering på fisk af skalaer opnået for undersøgelsen. Sørg for at holde sig til den relevante organisation eller statslige retningslinjer for opnåelse af biologiske prøver såsom retningslinjer dyrepleje NIH. Opbevar skalaer i et passende medium, såsom phosphatpufret saltopløsning for at bevare hydrering og opretholde indhold af mineraler, når de er fjernet fra fisken. Undgå langvarig oplagring, der kan resultere i mineral tab, hvilket kan påvirke nanoindentation data. Brug en medium børste og tweezers at fjerne eventuelle bløde væv fra de hårde skalaer. - Prøve Montage og sektionering
Undersøgelse et tværsnit af fisken skala kort-aksen (figur 1) ved hjælp af FTIR og nanoindentation kræver først montere skalaen i en stiv medium, såsom en to-komponent epoxy består af en harpiks og hærder. Brug generelle formål RT hærdende epoxy med lave spidstemperaturer såsom kommercielle generelle formål epoxy anvendt i denne undersøgelse, der havde en maksimal temperatur på mindre end 55 ° C.
Fig. 1. X-ray CT billeder af A. spatel skala afbilder den korte akse tværsnit undersøgt i denne undersøgelse A. spatel hjælp nanoindentation og FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsale), V (ventrale)]. </ P>
- Hold fisken skala i en 32 mm prøve diameter skimmel ved hjælp af en kommercielt tilgængelig plast prøveholderen. Dette holder prøven orienteret korrekt, mens montering i epoxy.
- Når prøven holdes i formen, hæld uhærdet epoxy på prøven, og derefter give epoxyen hærde i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Når epoxyen er hærdet, afsnittet monterede prøve ved hjælp diamantklinge høj præcision cut-off så på midterlinjen af prøven.
- Soniker i destilleret vand i 15 minutter for at fjerne eventuelle rester fra prøven.
- Polering for Nanoindentation og FTIR
For at opnå en glat flad overflade for nanoindentation som vist i figur 2, er følgende polering procedure og parametre foreslået på baggrund af drøftelser med fremstilling poler og prøver. Parametre kan være nødvendigt Dog skal justeres til forskellige biomaterialer baseret på svarsåsom materialefjernelse. Ultralydbehandling af prøver i et bad af destilleret vand mellem polertrin er afgørende at sikre partikler fra en grovere polering skridt er ikke indført i en efterfølgende finere polering trin.
Figur 2. Billede af en poleret korte akse tværsnit A. spatel skala monteret i epoxy.
- Grov polish med en 15 um SiC pad og vand som et smøremiddel, indtil prøven er plan med den automatiske polering hoved kraft 7 lbf og hastighed på 200 omdrejninger per minut (rpm).
- Lydbehandle prøven i et bad af destilleret vand i 15 min.
- Intermediate polish med en 6 mM SiC pad bruge vand smøremiddel på en trykplade hastighed på 130 rpm og en kraft på 7 lbf for5 min.
- Soniker prøve i et bad af destilleret vand i 15 min.
- Poler med en 1 um SiC pude ved hjælp af vand smøremiddel en trykplade hastighed på 130 rpm og en kraft på 7 lbf i 5 min.
- Lydbehandle prøven i et bad af destilleret vand i 15 min.
- Slutpolering med en 50 nm kolloidt silica suspension ved hjælp af en passende polerpad såsom en høj densitet, ikke-vævede, lav-nap porøst polyurethan at en producent foreslår til 50 nm suspensioner. Polske ved en hastighed på 130 rpm med en kraft på 7 lbf i 5 min.
- Lydbehandle prøven i et bad af destilleret vand i 15 min.
2.. Nanoindentation Test
- Kalibrer nanoindentation systemet, før hvert parti af test per fremstiller retningslinjer. Kalibreringen bør omfatte fastlæggelse af systemets område funktion for Berkovich spids og rammen stivhed. Derudover udføre et mikroskop-til-indrykning kalibrering på dette trinat sikre led korrelerer til de valgte mikroskop steder.
- Load prøven i nanoindenter og bruge de optiske mikroskop knapperne på nanoindenter at bringe prøven i fokus.
- Brug software kontrol for at flytte prøven til placeringen for det første led. Ideelt set er dette cirka 10 um i epoxyen fra kanten af ganoine lag langs centerlinien af vægtens tværsnit.
- Udfør 4 parallelle rækker af led afstand på 15 um fra hinanden for at opnå en statistisk signifikante datasæt starter på denne placering. Indstil nanoindenter til en maksimal belastning på 5 mN, lastning og losning satser 0,1 mN / sek, en holdetid på 30 sek, og et led afstand af 5 m for hver række minimum. Rækken af led bør være setup til at køre vinkelret på ganoine overflade, og et tilstrækkeligt antal led bør præciseres at rejse på tværs af vægtens tværsnit mens gennemkører cirka 10 um i EPOXy forbi knoklet lag.
- Når partiet er afsluttet, har nanoindenter skabe fiducial led med en maksimal belastning på 100 mN ved første og sidste led, som bør være i epoxy, før ganoine lag og efter knoglen lag hhv. Disse korrelerer til start-og slutpunkter for hver række af led.
- Efter nanoindentation placere prøven tilbage i PBS løsning til at undgå yderligere dehydrering.
- Brug nanoindentation software til at bestemme modulus og hårdhed er baseret på Oliver-Pharr metode 13, hvis der observeres en tid-uafhængig materiale respons. Ellers kan det være nødvendigt at blive udvidet til at overvinde den krybe observeret fra losning for hurtigt hold-tid.
3.. Stedligt ATR-FTIR spektroskopi
Anvendelsen af en dias-on ATR tilbehør fastgjort til en FTIR mikroskop er en foreslået metode til at indsamle stedligt Fouriertransformation infrarød (FTIR)-spektre af layers i en fisk skala prøve. ATR tilbehør giver mulighed for samling af høj kvalitet spektre med meget lille (~ 10 um 2) rumlig opløsning, som ikke er opnåelige med andre FTIR teknik. Den samme poleret prøve (figur 2) forberedt til nanoindentation eksperimenter blev anvendt i disse eksperimenter.
- Vælg en prøve med en overflade og dimensioner passende til FTIR mikroskop anvendes til analyse for at sikre høj kvalitet spektre opnås fra ATR-FTIR spectromicroscopy.
- Forbered FTIR mikroskop for at indsamle data. FTIR microspectroscopy kræver kalibrering af FTIR-signalet under de samme prøveudtagning betingelser som vil blive anvendt til at måle prøven. Typisk omfatter dette køle detektoren og giver tid til at stabilisere såvel som at samle alle baggrund spektre og prøve spektre under de samme miljøforhold. Dette kan især være vigtigt, fordi CO 2 og vanddamp i luften kan dramatically påvirke FTIR spektre. Det er også vigtigt at sikre, at instrumentets optik er tilpasset.
- Saml en passende baggrund spektrum at trække prøven imod. Til disse eksperimenter blev en poleret, guld-belagt objektglas anvendes som baggrund for FTIR spectromicroscopy.
- Ved hjælp af en passende mål, fokus på prøven, og vælg et område af interesse for analyse.
- Når et område af interesse er fundet, vedhæfte ATR tilbehør til FTIR mikroskop mål hæve prøven, indtil det gør intim kontakt med ATR indre refleksion element, og indsamle en prøve spektrum.
- Efter indsamling FTIR spektrene, udføre den nødvendige standard databehandling kræves.
4.. Røntgen computertomografi (CT)
- Anskaf og forberede skala som diskuteret i afsnit 1.1
- Scanner Setup
- Warm-up X-ray kilde i henhold til producentens specifikationer.
- Set røntgen spænding og strøm til 50 kV og 160 uA, hhv.
- Indstil eksponeringstid til 1.450 ms.
- Vælg en 1,0 mm aluminium filter.
- Forud for lastning prøve, foretage en korrektion fladskærms-feltet, når X-ray kilde er slukket (dark-field) og (lys-felt).
- Mount og Load Specimen
Vægte skal monteres på en sådan måde, at de ikke kan ændre eller flytte hele længden af scanningen. Disse prøver skal også være monteret ved hjælp af materialer, der er næsten transparent for røntgenstråler. En kombination af Styrofoam og Parafilm kan anvendes til at fastgøre skalaen til CT fase.- Stift montere prøven, således at den længste dimension er parallelt med detektoren.
- Fastgør monterede prøve til scanneren scenen.
- Anbring prøven, så det vil være i centrum af rotation hele scanningen.
- Vælg den højeste opløsning, der gør det muligt for hele skalaen være i synsfelt (FOV), i dette tilfælde7,5 um.
- Acquisition Indstillinger
Udfør scanninger i denne undersøgelse med en roterende trin på 0,25 ° og en ramme gennemsnitsberegning værdi på 15. Hvis lavere opløsninger er acceptable, øge skridt størrelse og / eller formindske rammen gennemsnit at reducere den samlede scanningstid. - Reconstruction Parametre
Når et datasæt er opnået, rekonstruere røntgen projektion billeder for at skabe et datasæt indeholdende tværsnitsbilleder. Vælg Skyscan s NRecon software standardindstillinger med undtagelse af følgende.- Skift Ring Artifact Rettelse til 20..
- Skift Beam Hærdning Rettelse til 25%.
- Juster CS Static Rotation til at foretage tværgående billede niveau.
- Image Processing
Brug Skyscan s CTAN software til at opnå den endelige 3D gråskalabilledet. Juster grå-skala område til et passende niveau for at fjerne artefakter fra Styrofoam og Parafilm.
Prøver udarbejdet ved at polere for nanoindentation og micro-/nano-structure karakterisering blev undersøgt ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Low-vakuum-tilstand blev anvendt for at minimere dehydrering af enheder og behovet for anvendelse af ledende belægninger. Lokal kemisk analyse blev udført på polerede prøver i forbindelse med SEM billeddannelse bruge energi-Dispersive X-ray spektroskopi (EDX). EDX-analyser blev udført på den samme linje / gitter, der blev analyseret ved nanoindentation for at give korrelationer mellem kemiske og mekaniske egenskaber. Frisk brudflader blev også undersøgt ved SEM at give bedre oplysninger om morfologi og orientering af biomineralized strukturer til stede i fiskeskæl. For at forbedre opløsning til observation af nano-skala struktur på brudflader, blev prøver sputter belagt med guld (Au) og filmede i høj vakuum-indstilling. Følgendegiver yderligere detaljer om de anvendte procedurer.
- SEM Imaging af polerede overflader
- Anbring poleret prøve i SEM kammeret og pumpekammeret i lavt vakuum tilstand med kammertryk på 0,1 til 0,5 mbar.
- Tilpasse arbejdstiden afstand til ca 5,0 mm.
- Aktiver højspænding (HV) og navigere til region af interesse på prøven, der omfatter overgangszonen mellem ganoine og knoklet underlag eller andre områder af interesse.
- Anskaf billeder på 15 kV HV og stråle strøm på ca 3,9 nA.
- Fokus image og udføre alle de nødvendige justeringer og justeringer stigmation.
- Tag billeder fra mindst tre regioner af interesse på relevante forstørrelser (typisk 250X til 10.000 X) ved hjælp af lav-vakuum tilbagekastet elektron (BSE)-detektor for at hjælpe med identifikation af ændringer i biomineral indhold og densitet (dvs. tætte knogle vs porøs knogle ).
- SEM Billeddannelse af brudflader
- Anbringe frisk brækkede eksemplar til en 90 ° SEM stub med dobbeltklæbende carbon tape med brudfladen opad.
- Sprutte frakke med Au til at give en sub-nm tykt ledende lag på brudfladen.
- Anbring prøven i SEM kammer og pumpe kammer i høj vakuum-indstilling.
- Tilpasse arbejdstiden afstand til mellem 3,0 og 5,0 mm.
- Aktiver HV og navigere til områder af interesse på prøven. Primære områder af interesse i denne sag var den struktur til stede i ganoine og knoklede lag.
- Anskaf billeder på mellem 5 kV og 15 kV HV og en lavere stråle strøm på 0,24 nA at forbedre opløsning.
- I første omgang fokuserer prøven og udføre indledende alignments.
- Øg forstørrelsen til mere end 5.000 X og skifte fra normal felt emission linse i fordybelse / ultrahøj opløsning (UHR) linse.
- Udfør Uhr alignments og justeringer stigmation.
- Tag billeder fra mindst tre regioner of interesse på relevante forstørrelser (typisk 5.000 X til 250.000 X) ved hjælp af gennem linsen detektor (TLD) drives i sekundær elektron (SE) mode.
- EDX-analyse af polerede overflader (udføres i forbindelse med SEM billeddannelse). Disse parametre er materiale afhængig og skal justeres, så samspillet volumen EDX er ens i størrelse til nanoindentation interaktion volumen som diskuteret af Moser 14.
- Naviger til region af interesse på polerede eksemplar, der omfatter nanoindentation gitter indikeret ved Referencemærkernes ved slutningen af hver linje af led.
- Sikre HV er mindst 15 kV stråle strøm er mindst 3,9 nA, og arbejder afstanden er større end 5,0 mm.
- Capture BSE billede af området, der skal analyseres ved hjælp af EDX.
- Brug EDX analyse software, fange det samme billede til at hjælpe med at finde områder for at udføre kemiske analyser langs linjen af led.
- Ved hjælp af "Line Analysis" teknik, position en linje til at udføre kemiske analyser langs linjen af interesse led starter ved første led og slutter ved sidste led.
- Angiv antallet af analyseresultater punkter, der skal placeres langs linjen. Det er bedst at bruge det samme nummer af analyseresultater punkter og led, der er til stede for at tilvejebringe en direkte rumlige korrelation mellem kemisk sammensætning og mekaniske egenskaber.
- Når linjen er placeret og peger angivet korrekt, indleder den linje analyse ved hjælp af EDX software.
- Når linjen analysen er færdig, identificerer elementer af interesse, der skal kvantificeres fra punkt spektre opnået langs den angivne linje på den polerede overflade af prøven.
- Når elementer af interesse er identificeret, udføre en baggrund kalibrering for at redegøre for bremsestråling stråling og andre effekter.
- Vælg softwarens deconvolution analyse mulighed for at opnå kvantitativ analyse på hvert punkt langs den angivne linje Quantificere den kemiske sammensætning i hvert punkt.
- Gem kvantitative resultater kemisk analyse sammen med billedet af angivne linje, der blev analyseret for at støtte i rumlige korrelation med mekaniske egenskaber målt ved hjælp af nanoindentation.
Representative Results
Figur 3 viser de gennemsnitlige resultater af rumligt korreleret nanoinidentation / SEM / EDX analyser udført på tværs af omkring 800 um lange korte akse tværgående tværsnit. I cirka 60 um tyk ganoine lag, den nanoindenter beregnet et gennemsnit modul på 69,0 GPa og hårdhed på 3,3 GPa. Den nanoindenter bestemmes en gennemsnitlig modul på 14,3 GPa og hårdhed på 0,5 GPa til ca 740 um tyk knogle lag.
EDX bestemt carbon, oxygen, calcium og phosphor, som typisk findes i mineraliseret skalaer. Men ganoine og knogler lag indeholdt kvantificerbare forskelle i kemiske sammensætninger. Den observerede kulstof spike i knoglen lag kan henføres til denne region ikke er så stærkt mineraliseret, hvilket resulterer i en svag stigning i kulstof, der også forårsagede den observerede fald i den samlede lysstyrke af BSE billede. Konkret ganoine lag «; S betyde atomare koncentration forholdet Ca: P på 1,71 syntes ligner hydroxyapatit med et teoretisk forhold på 1,67. Knoglen lag gennemsnitlige Ca: P-forholdet er faldet til 1,51 hvilket er et fald i mængden af mineraliseringen fra ganoine lag.
FTIR spektre i figur 4 for knoglen lag og ganoine lag identificeret de vigtigste funktionelle grupper som amid, carboxylsyre, fosfat og carbonyl. Konkret FTIR bekræftet visuel observation af hydroxyapatit underskrifter i de ydre (ganoine) lag og kollagen signaturer i den indre (knogler) lag. Toppe ved 3,500-3,000 cm -1 skyldes NH stretching og NH bøjning mellem 1.550 og 1.500 cm -1 repræsenterer amid grupper i knoglen lag. Toppe i området af bølgetal 1,470-1,365 cm -1 repræsentere amid alkylgrupper. Desuden blev en karakteristisk C = O stretching på 1.641 cm -1 observeret på knoglen lag. Peaks fra 3,000-2,500 cm -1 repræsenterer carboxylgrupper. Både ben og ganoine sælgernes spektre produceret en karakteristisk top nær 1,079.33 cm -1 indikerer stretching fosfat.
Røntgen CT billedsprog i figur 5 fanger at ganoine lag ikke dækker knoglen lag, hvor skalaer overlapper hinanden. De lysere grå ganoine lag indikerer tættere, hårdere og stivere faser mens mørkere grå knogle lag indikerer mindre tætte og mindre stive faser. Derudover røntgen CT billeder hjulpet til at identificere den manglende ensartethed i ganoine lagtykkelse. Faktisk er tydelige gruber observeres tæt på centrum af ganoine lag, som ikke dækker knoglen lag overhovedet.
SEM billedet i figur 6A brudfladen ætset med H 3 PO 4 viste nanostrukturer organiseret i en lagdelt mønster for ganoine lag. Denne nanorod organiseretstruktur korrelerer med hydroxyapatit signaturer opnået fra FTIR for ganoine område.
6A viser en typisk lavere forstørrelse SEM mikrograf af en brudflade klart at identificere overgang mellem ganoine og knogler lag med den stiplede linie. Figur 6B skildrer de højere forstørrelse SEM billeder af brudfladen efter ætsning med H 3 PO 4. Efter ætsning, orienterede nanorods i den ydre ganoine lag klart kan identificeres, mens en fiber-lignende nanostruktur er observeret i knoglen lag.
Figur 3.. Modulus og hårdhed data fra nanoindentation rumligt korrelerede til SEM / EDX kemiske sammensætning.
Figur 4.. FTIR spektre indsamles fra den ydre (ganoine) og indre (bony) lag.
Figur 5. Røntgen CT billeder, der viser fordybninger på den ydre (ganoine) lag omfatter indre (bony) lag.
Fig. 6. (A) lav forstørrelse SEM billede af typiske brudoverflade, (B) højere forstørrelse billeder af nanorods i den ydre (ganoine), og fibrene i den indre (bony) lag .. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Fra en eksperimentel synsvinkel, forskerne nødt til at huske på, at når man arbejder med naturligt forekommende biologiske materialer, såsom mineraliseret fiskeskæl, rapportering den rumlige placering af skalaen på fiskene er kritisk, da tidligere forskning har vist, mekaniske egenskaber af mineraliseret fiskeskæl er afhængige hvor vægten var placeret på fisk 4..
Mekaniske egenskaber for mineraliserede biologiske materialer har også vist sig at være afhængig af hydrering tilstand prøverne 4. Dette begrænser nytten af denne teknik, når de forsøger at sammenligne friske prøver, der er blevet ordentligt hydreret til publicerede resultater i det åbne litteratur, der anvender tørre forstenede prøver. Derfor er det nødvendigt, forlænget svære tider skal undgås for at minimere effekten af dehydrering på en prøve mekaniske egenskaber under nanoindentation. Materialespecifikke pilotundersøgelser anbefales at sikre erfaling runtime er minimal nok til ikke at ændre den mekaniske opførsel af materialet. Wet celle nanoindentation ville være en foretrukken metode til at holde en konstant hydrering tilstand af materialet, hvis det udstyr tillader det.
Den nanoindentation metode, der anvendes i denne undersøgelse, som beregnet elasticitetsmodulet fra kurven aflæsning antager materialet opfører sig som en lineær elastisk isotropisk materiale. Teknikken kan anvendes med en række af indrykning tips. Imidlertid blev de tre-sidet Berkovich spids med en halv vinkel på 65,35 °, der anvendes i denne undersøgelse. Alternative tips såsom terningen hjørne (halv vinkel = 35,36 °) er egnede til den procedure, der præsenteres i dette manuskript, men da terningen hjørne spids er mere akut end Berkovich tip revner kan genereres i prøven ved meget lavere belastning end med Den Berkovich spids.
Polering er et vigtigt skridt for at opnå en glat og flad overflade med et minimeret overflade ruhed til ikke at påvirke de nanoindentation resultater. De polertrin præsenteres i dette manuskript er en foreslået procedure, der måske skal ændres, afhængigt af typen af poler, der anvendes. Det afgørende skridt for at sikre præcis nanoindentation data er imidlertid, at overfladeruhed minimeres, og for denne særlige materiale blev krævet en 50 nm slutpolering at opnå en glat flad overflade ved indrykning dybder, som testes.
Afstanden mellem led sikrer også præcis nanoindentation data, der ikke påvirkes af det materiale deformation fra tidligere led. Den nanoindenter brugsanvisning for udstyret i denne undersøgelse foreslået, at led afstand skal være mindst 20-30x den maksimale indtrængningsdybde for Berkovich indenters 15. For alternative materialer, vil den nødvendige led afstand skal bestemmes på grundlag af den anvendte belastning og maksimal indrykning dybde, som diskuteret tidligere i det åbnelitteratur 16,17. Desuden blev hold tid for dette materiale valgt at overvinde enhver krybe observeret for de forskellige materiale faser tastede giver mulighed for nanoindenter softwarens Oliver-Pharr analysemetode, der skal anvendes. Men som diskuteret af Oyen 18 alternative analysemetoder er til rådighed for biologiske materialer, når tidsafhængige materiale reaktioner kan ikke overvindes med egnede hold gange.
For at opnå høj opløsning resultaterne fra X-Ray CT, skal flere indstillinger optimeres. Dette papir skitserer en meget bestemt sæt af parametre til brug på en fisk skala med en unik størrelse og lagdelt tykkelse. Med varierende stikprøvestørrelser, vil disse indstillinger skal justeres for at opnå et datasæt af højeste kvalitet. Processen med at udvælge hver parameter skal være klart defineret i den brugervejledning, der følger med maskinen, der anvendes. Scan-indstillinger (spænding, strøm, eksponering, udvælgelse filter) og genopbygning indstillingerskal måske ændres til at rumme en række andre prøvestørrelser og geometrier (ring artefakter, stråle hærdning).
X-ray CT billede et billede af hele skala morfologi identificere en ganoine lag, der dækker en benet lag af materiale, hvis vægten ikke overlapper hinanden. X-ray CT billeder også identificeret at ganoine lag bestod af en ikke-ensartet tykkelse i hele skalaen, og selv udstillet gruber, der manglede ganoine lag helt.
Interessant, nanoindentation data rumligt korreleret til SEM / EDX kemisk analyse identificeret en skarp diskret overgang mellem de 2 lag i stedet for en mere gradvis overgang observeret for mineraliserede fiskeskæl af P. senagalus (i Bruet et al. 2).
En kombination af nanoindentation, FTIR, EDX, og SEM forudsat mekaniske egenskaber, kemisk analyse og strukturel information til at bekræftedet ydre lag som ganoine med emalje-lignende morfologi og kemi. Derudover disse teknikker bekræftede det indre lag som en benet materialelag.
Afslutningsvis identificeret metoderne i denne undersøgelse proceduren og tilsvarende resultater at undersøge mineraliseres fisk omfanget af A. spatel fra hovedparten struktur ned til nanostruktur og kemisk sammensætning.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den økonomiske støtte til dette arbejde, som den amerikanske hær ERDC Military Engineering 6.1 Basic Research Program og ERDC Center for Directed Research Program. Forfatterne vil også gerne takke personale og faciliteter i ERDC geotekniske og Strukturel Laboratoriets Beton og Materialer Branch til at understøtte det eksperimentelle arbejde. Tilladelse til at offentliggøre blev givet af direktøren, geoteknisk og konstruktioner Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy resin | Buehler | 701-501512 | |
| Epoxy hardener | Buehler | 703-501528 | |
| Samplkups | Buheler | 20-8180 | |
| SamplKlips I | Buehler | 20-4100-100S | |
| High precision cut-off saw | Buehler | Isomet | |
| UltraMet 2002 sonic cleaner | Buehler | B2510R-MT | |
| Polisher | Buehler | 49-1750-160 | |
| 1,200 grit (15 μm) SiC paper | Struers | 40400012 | |
| 4,000 grit (6 μm) SiC paper | Struers | 40400014 | |
| 50 nm colloidal silica | Buehler | 40-10075 | |
| Chemomet polishing pad for 50 nm suspension | Buehler | 40-7918 | |
| Nanoindenter | MTS | G200 | |
| FTIR continuum microscope | Thermo Nicollet | 6700 | |
| X-ray computed tomography | Skyscan | Skyscan 1173 | |
| SEM | FEI | NovaNanoSEM 630 | |
| EDX | Bruker | AXS Xflash detector 4010 | |
| Sputter coater | Denton | Desk II |
References
- Allison, P. G., et al. Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales. Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).
- Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. Materials design principles of ancient fish armour. Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).
- Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).
- Marino Cugno Garrano, A., et al. On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).
- Song, J., et al. Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).
- Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton. J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).
- Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major. 142, 327-333 (2003).
- O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana. Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).
- Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus. J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).
- Page, L. M., Burr, B. M. A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , Houghton Mifflin Company. (1991).
- Thompson, K. S., McCune, A. R. Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes. J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).
- Yang, W., et al. Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales. Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).
- Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX. J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).
- Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).
- Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , Agilent Technologies Inc. Palo Alto. (2012).
- Ulm, F. J., et al. Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale. J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).
- Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -J. Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces. J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).
- Oyen, M. L. Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials. Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).
