Summary
Dette notatet presenterer metodene som brukes for sondering romlig korrelert kjemisk, strukturelle og mekaniske egenskaper av flere lag skala fra Atractosteus slikkepott (A. slikkepott) ved hjelp nanoindentation, Fourier transform infrarød (FTIR) spektroskopi, scanning elektronmikroskopi (SEM), og X- ray computertomografi (X-ray CT). De eksperimentelle resultatene har blitt brukt til å undersøke design prinsipper av beskyttende biologiske materialer.
Abstract
Den hierarkiske arkitektur av beskyttende biologiske materialer som mineralisert fiskeskjell, gastropod skjell, bukkehorn, gevir, og skilpadde skjell gir unike designprinsipper med potensialer for guiding utformingen av beskyttende materialer og systemer i fremtiden. Forstå struktur-eiendomsforhold for disse materielle systemer på mikroskala og nanoskala der svikt initierer er avgjørende. For tiden er eksperimentelle teknikker som nanoindentation, røntgen, CT, og SEM gi forskere med en måte å korrelere den mekaniske oppførsel med hierarkiske mikrostrukturer av disse materialsystemer 1-6. Men det er en veldefinert standard prosedyre for prøve utarbeidelse av mineralisert biomaterialer ikke tilgjengelig for øyeblikket. I denne studien, metoder for sondering romlig korrelert kjemisk, strukturelle og mekaniske egenskaper av flere lag skala fra A. spatel hjelp nanoindentation, FTIR, SEM, med enenergi-spredt X-ray (EDX) mikroanalyse, og X-ray CT presenteres.
Introduction
Forskere undersøker strukturelle biomaterialer og prøver å belyse design prinsipper, som gir strukturelle biomaterialer med forbedrede mekaniske egenskaper som mye høyere seighet og styrke i forhold til deres individuelle bestanddeler. Undersøkelsene på design prinsipper for pansrede fisk skalaer for Pagrus store 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus carpio 4, og Atractosteus spatel 1 har demonstrert behovet for å utvide anvendelsen av eksisterende eksperimentelle metoder for å studere de strukturelle responser og mikro egenskaper, ettersom detaljerte standard prosedyrer ikke er tilgjengelige for disse typer materialer og eksperimenter.
Blant de ulike pansrede skjell diskutert, A. spatel er en historisk rovdyr av det sentrale US 8, og er en art med høyly miner skalaer. Arten børsene muskelmasse for huden masse å oppnå en forbedret predator forsvarssystemet i forhold til fisken av sammenlignbar størrelse nevnt tidligere ni. Ifølge Page og Burr 10, A. slikkepott er den tredje største ferskvannsfisk i Nord-Amerika med den hvite stør (Acipenser transmontanus) og Atlantic stør (Acipenser Oxyrhynchus) blir større arter. De høyt miner skjell av A. slikkepott er bare nylig som studeres. Thompson og McCune 11 antydet at morfologien til de gar-skalaen har en tre-lags sammensetning som består av et ganoine ytre lag, en diffus ben lag, og lamellær ben sjikt. Aktuell forskning på A. spatel skalaer har ikke skilles benet laget til diffuse eller lamellære bein regioner, men har bare studert beinet regionen som ett indre lag 1,12.
I denne studien, prosedyrene for ivestigating mikrostruktur, nanostrukturen, kjemisk sammensetning, og romlige fordelinger av de mekaniske egenskapene til skalaer av A. spatel basert på resultatene av FTIR spektroskopi, er SEM, X-ray CT, og nanoindentation teknikker presenteres.
Protocol
En. Fish Scale Prøvepreparering
For denne studien ble skalaer hentet fra US Army Engineer Research and Development Center (ERDC) Miljølaboratoriet ved mid-lengde (29 th hale kolonne) fra en ca 600 mm lang gar (A. slikkepott). De fiskeskjell ble innhentet i henhold til ERDC og National Institute of Health (NIH) retningslinjer dyr omsorg.
- Materialer
Spill den romlige plasseringen på fisk av skalaer innhentet for studien. Sørg for å overholde den aktuelle organisasjonen eller statlige retningslinjer for å få biologiske prøver som NIH retningslinjer dyr omsorg. Oppbevar skalaer i en tilstrekkelig medium slik som fosfat-bufret saltløsning til å bevare fuktighet og opprettholde mineralinnhold når de er fjernet fra fisken. Unngå langvarig lagring som kan resultere i mineral tap, noe som kan påvirke nanoindentation data. Bruk en medium børste og tweezers å fjerne eventuelle myke vev fra de harde skalaer. - Prøve Montering og seksjonering
Undersøkelse av et tverrsnitt av den fisk skala kort-akse (fig. 1) ved hjelp av FTIR-og nanoindentation krever først montering skalaen i en stiv medium som for eksempel en to-komponent epoksy bestående av en harpiks og herder. Bruk generell RT herdende epoksy med lave topptemperaturer som for eksempel den kommersielle generell epoxy brukt i denne studien som hadde en topptemperatur på mindre enn 55 ° C.
Figur 1. Røntgen CT-bilder av A. spatel skala som viser den korte aksen tverrsnitt undersøkt i dette studiet av A. spatel hjelp nanoindentation og FTIR [A (anterior), P (posterior), D (rygg), V (ventral)]. </ P>
- Hold fisken skala i et 32 mm diameter prøven mold ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig plast prøven holderen. Dette holder prøven riktig vei mens montering i epoxy.
- Når prøven holdes i formen, helles den uherdede epoksy på prøven, og deretter tillate at epoxy å herde i henhold til produsentens anvisninger.
- Etter at epoksyen har herdet, avsnitt montert prøven ved hjelp av en diamantskive høy presisjon kappemaskinen på midtlinjen av prøven.
- Sonicate i destillert vann i 15 min for å fjerne eventuelle rester fra prøven.
- Polering for Nanoindentation og FTIR
For å oppnå en jevn flat overflate for nanoindentation som avbildet i figur 2, er følgende polering prosedyre og parametre basert på de diskusjoner med polerings fremstilling og testprøver. Men parametrene må kanskje justeres for ulike biomaterialer basert på svarslik som sliping. Ultrasonication av prøver i et bad av destillert vann mellom polerings trinn er viktig for å sikre at partikler fra grovere polering trinnet ikke er ført inn i en etterfølgende finere poleringstrinn.
Figur 2. Bilde av en polert kort-akse på tvers seksjon A. spatel skala montert i epoxy.
- Grov poler med en 15 mikrometer SiC puten og vann som et smøremiddel til prøven er planet ved hjelp av den automatiske polerhodet styrke på 7 lbf og hastighet på 200 omdreininger pr minutt (rpm).
- Sonicate prøven i et bad av destillert vann i 15 min.
- Intermediate polish med en 6 mikrometer SiC pad med vann smøremiddel på en platen hastighet på 130 rpm og en styrke på 7 lbf for5 min.
- Sonicate prøven i et bad av destillert vann i 15 min.
- Poler med en 1 mikrometer SiC puten ved hjelp av vann smøremiddel på en pressplate hastighet på 130 rpm, og en kraft på 7 lbf i 5 min.
- Sonicate prøven i et bad av destillert vann i 15 min.
- Siste finpussen med en 50 nm kolloidalt silika suspensjon ved hjelp av et egnet poleringspute for eksempel en høy tetthet, ikke-vevde, lav-nap porøs polyuretan som en produsent antyder for 50 nm suspensjoner. Polish ved en hastighet på 130 rpm med en kraft på 7 lbf i 5 min.
- Sonicate prøven i et bad av destillert vann i 15 min.
2. Nanoindentation Testing
- Kalibrere nanoindentation systemet før hvert parti av testing per produserer retningslinjer. Kalibreringen bør omfatte bestemmelse av systemets område funksjonen for Berkovich spissen og rammen stivhet. I tillegg utfører et mikroskop-til-indenter kalibrering på dette trinnetå sikre innrykkene relateres til de valgte mikroskop steder.
- Laste prøven i nanoindenter og bruke optisk mikroskop kontrollene på nanoindenter å bringe prøven i fokus.
- Bruk programvarekontroller for å flytte prøven til plasseringen for første strekpunkt. Ideelt sett er dette omtrent 10 mikrometer i harpiksen fra kanten av ganoine sjiktet langs senterlinjen av vektens tverrsnitt.
- Utfør fire parallelle rader av strekpunkter i avstand 15 mikrometer fra hverandre for å oppnå en statistisk signifikante data satt igang på dette stedet. Sett nanoindenter til en maksimal belastning på 5 mN, lasting og lossing priser på 0,1 mN / sek, en hold tid på 30 sek, og et minimum innrykk avstand på 5 mikrometer for hver rad. Raden av innrykk bør settes opp til å kjøre normalt på ganoine overflaten, og et tilstrekkelig antall innrykk bør spesifiseres til å reise over skalaens tverrsnitt ved kryssing ca 10 mikrometer inn i Epoxy forbi benete lag.
- Når sats er fullført, har nanoindenter opprette fiducial strek med en maksimal belastning på 100 mN ved den første og siste strekpunkt, som bør være i harpiksen før ganoine sjikt og etter benet sjikt, henholdsvis. Disse relateres til start-og sluttpunkt for hver rad med innrykk.
- Etter nanoindentation plasser prøven tilbake i PBS løsning for å unngå ytterligere dehydrering.
- Bruk nanoindentation programvare for å bestemme elastisitet og hardhet basert på Oliver-Pharr metode 13 hvis en tidsuavhengig materialet respons er observert. Ellers hold-tid kan trenge å bli utvidet til å overvinne den kryp observert lastes ut for raskt.
Tre. Romlig Løst ATR-FTIR spektroskopi
Bruken av en slide-on ATR tilbehør festet til et FTIR mikroskop er en foreslått metode for å samle romlig løst Fourier transform infrarød (FTIR) spektra av layers i en fisk skala prøve. ATR tilbehør tillater samling av høy kvalitet spektra med svært små (~ 10 mikrometer 2) romlig oppløsning, som ikke er oppnåelige med andre FTIR teknikk. Den samme polert prøve (figur 2) som er fremstilt for nanoindentation eksperimenter ble brukt i disse eksperimenter.
- Velg en prøve med en overflate og dimensjoner egnet for FTIR mikroskop som brukes til analyse for å sikre høy kvalitet spektra oppnås fra ATR-FTIR spectromicroscopy.
- Klargjør FTIR mikroskop for å samle inn data. FTIR mikro krever kalibrering av FTIR-signalet under de samme prøvebetingelser som skal brukes for måling av prøven. Vanligvis omfatter denne kjøling detektoren og gir tid for den til å stabilisere seg, så vel som å samle all bakgrunns spektra og spektra prøven under de samme forhold i omgivelsene. Dette kan være spesielt viktig, fordi CO2 og vanndamp i luften kan dramatically påvirke FTIR spektra. Det er også viktig å sikre at instrumentets optikk er justert.
- Samle en passende bakgrunn spektrum for å trekke prøven mot. For disse forsøk ble en polert gull-belagte objektglass som brukes som en bakgrunn for FTIR spectromicroscopy.
- Ved hjelp av et passende mål, fokusere på prøven og velge et område av interesse for analyse.
- Når et område av interesse er funnet, festes ATR tilbehør til FTIR mikroskop mål, heve prøven inntil det får intim kontakt med ATR intern refleksjon element, og samle inn en prøve spektrum.
- Etter å samle den FTIR spektra, utføre de nødvendige standard databehandlingen som kreves.
4. X-ray computertomografi (CT)
- Få tak i og forberede skala som omtalt i punkt 1.1
- Skanner-oppsett
- Warm-up røntgenkilde i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Set røntgen spenning og strøm til 50 kV og 160 μA hhv.
- Sett eksponeringstiden til 1450 millisekunder.
- Velg en 1,0 mm aluminiumsfilteret.
- Før lasting prøve, lage en flat-feltet korreksjon når røntgenkilden er avslått (mørke-feltet) og på (lyse-feltet).
- Mount and Load Specimen
Scales må monteres på en måte slik at de ikke forskyver seg eller bevege seg gjennom hele lengden av skanningen. Disse prøvene må også monteres ved hjelp av materialer som er nesten gjennomsiktig til røntgen. En kombinasjon av Styrofoam og Parafilm kan brukes for å feste skalaen til CT-stadiet.- Stivt montere prøven slik at den lengste dimensjon er parallell med detektoren.
- Sikre montert prøven til skanneren stadium.
- Plasser prøven slik at det vil være i rotasjonssenteret gjennom avsøkningen.
- Velg den høyeste oppløsningen slik at hele skalaen til å være i det synsfelt (FOV), i dette tilfellet7.5 mikrometer.
- Oppkjøps Innstillinger
Utføre søk i denne studien med en rotasjons-trinn på 0,25 ° og en ramme gjennomsnittsverdi på 15. Dersom lavere oppløsninger er akseptable, øker trinnstørrelsen og / eller senke rammen i snitt for å redusere det totale skanne tid. - Rekonstruksjon Parametere
Når et datasett blir oppnådd, rekonstruere røntgenprojeksjonsbilder for å skape et datasett som inneholder tverrsnittsbilder. Velg SkyScan sin NRecon programvareoppsettet, unntatt for følgende.- Endre Ring Artifact Rettelse til 20.
- Endre Beam Herde Rettelse til 25%.
- Juster CS Static rotasjon for å gjøre tverrsnittsbilde nivå.
- Bildebehandling
Bruk SkyScan sin CTAn programvare for å få den endelige 3D grå-skala image. Juster grå-skala område til et passende nivå for å fjerne gjenstander fra styrofoam og Parafilm.
Prøvene er utarbeidet av polering for nanoindentation og micro-/nano-structure karakterisering ble undersøkt ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM). Lav-vakuum-modus ble benyttet for å minimalisere dehydrering av prøver og behovet for påføring av ledende belegg. Lokal kjemisk analyse ble utført på polerte prøver i forbindelse med SEM bildebehandling ved hjelp av energi-spredt røntgenspektroskopi (EDX). EDX analyser ble utført på samme linje / rutenett som ble analysert ved nanoindentation for å gi sammenhenger mellom kjemiske og mekaniske egenskaper. Freshly brukket overflater ble også undersøkt av SEM å gi bedre informasjon om morfologi og orientering av biomineralized strukturer stede i fiskeskjell. For å forbedre oppløsningen for observasjon av nano-skala struktur på oppsprukne flater, ble prøvene frese belagt med gull (Au) og avbildes i høy-vakuum-modus. Følgendegir ytterligere detaljer om de prosedyrer som brukes.
- SEM Imaging av polerte overflater
- Plasser polert prøve i SEM-kammeret og pumpekammeret inn i lav-vakuum-modus med kammertrykk på 0,1 til 0,5 mbar.
- Juster arbeidsavstand til ca 5,0 mm.
- Aktiver høyspent (HV) og navigere til region av interesse på prøven som inkluderer overgangssonen mellom ganoine og benete sublayers eller andre områder av interesse.
- Få bilder på 15 kV HV og strålestrøm på ca 3,9 nA.
- Fokuser bildet og utføre alle nødvendige justeringer og stigmation justeringer.
- Ta bilder fra minst tre regioner av interesse på relevante forstørrelser (vanligvis 250x til 10000 X) ved hjelp av lav-vakuum tilbakespredte elektron (BSE) detektor for å hjelpe til med identifisering av endringer i biomineral innhold og tetthet (dvs. tett bein vs porøse bein ).
- SEM Imaging of Fractured Overflater
- Fest ferske brukket prøven til en 90 ° SEM stub bruker tosidige carbon tape med bruddflaten vendt opp.
- Frese belegge med Au å tilveiebringe en sub-nm tykt ledende lag på bruddflaten.
- Plasser prøven i SEM kammer og pumpe kammer i høy-vakuum-modus.
- Juster arbeidsavstand til mellom 3,0 og 5,0 mm.
- Aktiver HV og navigere til regioner av interesse på prøven. Primære områder av interesse i dette tilfellet var den struktur som finnes i de ganoine og bony lag.
- Få bilder på mellom 5 kV og 15 kV HV og en lavere strålestrøm på 0,24 nA å forbedre oppløsningen.
- I første omgang fokusere prøven og utføre foreløpige justeringer.
- Øk forstørrelsen til mer enn 5000 X og bytte fra normal feltet utslipp linse i nedsenking / ultra-høy oppløsning (UHR) linse.
- Utfør UHRs justeringer og stigmation justeringer.
- Ta bilder fra minst tre regioner of interesse på relevante forstørrelser (typisk 5000 X til 250 000 X) bruker gjennom linsen detektoren (TLD) operert i annenhånds elektron (SE)-modus.
- EDX analyse av polerte overflater (utført i forbindelse med SEM-imaging). Disse parametrene er materialavhengig og må justeres slik interaksjon volumet EDX er lik i størrelse til volum nanoindentation samhandling som diskutert av Moser 14.
- Naviger til regionen av interesse på polerte prøven som inkluderer nanoindentation grid indikert av fiducial merkene på slutten av hver linje av innrykk.
- Sikre HV er minst 15 kV, er strålestrøm på minst 3,9 nA, og arbeidsavstand er større enn 5,0 mm.
- Capture BSE bilde av regionen som skal analyseres ved hjelp EDX.
- Ved hjelp av EDX-analyse-programvare, fange opp det samme bilde for å hjelpe til med å lokalisere områdene for å utføre kjemiske analyser langs linjen innrykk.
- Ved hjelp av "Line Analysis" teknikk, posisjon en linje for å utføre kjemiske analyser langs linjen av interesse for strek starter på den første strekpunkt og ender ved den siste innrykket.
- Spesifiser antall analysepunkter som skal plasseres langs linjen. Det er best å bruke samme antall analyse punkter og innrykk som er til stede for å gi en direkte romlig sammenheng mellom kjemisk sammensetning og mekaniske egenskaper.
- Når linjen er plassert og peker riktig spesifisert, initiere linjen analyse ved hjelp EDX programvare.
- Når linjen analysen er fullført, identifisere elementer av interesse som skal kvantifiseres fra det punkt spektra erholdt langs den angitte linje på den polerte overflaten av prøven.
- Når elementer av interesse er identifisert, utføre en bakgrunn kalibrering å gjøre rede for bremsestråling stråling og andre effekter.
- Velg programvarens deconvolution analyse muligheten til å skaffe kvantitativ analyse på hvert punkt langs den angitte linjen til Quansere den kjemiske sammensetning ved hvert punkt.
- Lagre kvantitative kjemiske analyseresultatene sammen med bildet av angitte linjen som ble analysert for å hjelpe til romlig korrelasjon med mekaniske egenskaper målt ved hjelp nanoindentation.
Representative Results
Figur 3 viser de gjennomsnittlige resultatene av rommessig korrelert nanoinidentation / SEM / EDX-analyser utført over ca 800 um lange korte akse tverrgående tverrsnitt. I ca 60 mikrometer tykt ganoine lag, nanoindenter beregnet en gjennomsnittlig modulus på 69,0 GPa og hardhet på 3,3 GPa. Den nanoindenter fastsettes en gjennomsnittlig modulus på 14,3 GPa og hardhet på 0,5 GPa for de ca 740 mikrometer tykt bein lag.
EDX bestemt karbon, oksygen, kalsium og fosfor, som vanligvis finnes i mineralisert skalaer. Men ganoine og bein lag inneholdt kvantifiserbare forskjeller i kjemiske sammensetninger. Den observerte karbon pigg i benet lag kan tilbakeføres til denne regionen ikke blir så sterkt mineralisert, noe som resulterer i en svak økning i karbon som også skyldes den observerte nedgang i totale lysheten av BSE-bildet. Nærmere bestemt, den ganoine lag ", S betyr atomkonsentrasjon forholdet Ca: P på 1,71 viste seg lik hydroksyapatitt med et teoretisk forhold på 1,67. Benet lag gjennomsnittlige Ca: P forholdet redusert til 1,51 representerer en nedgang i mengden av mineralisering fra ganoine lag.
FTIR-spektra i figur 4 for benet sjiktet og ganoine lag identifisert de viktigste funksjonelle grupper som amid-, karboksyl-, fosfat-og karbonyl. Spesielt FTIR bekreftet visuell observasjon av hydroksyapatitt signaturer i ytre (ganoine) lag og kollagen signaturer i den indre (bein) lag. Topper på 3,500-3,000 cm -1 grunn til NH stretching og NH bøying mellom 1550 og 1500 cm -1 representerer amidgrupper i beinet lag. Toppene i regionen bølge nummer 1,470-1,365 cm -1 representere amid erstattet alkylgrupper. I tillegg ble en særegen C = O strekk på 1641 cm -1 observert på beinet lag. Peaks fra 3,000-2,500 cm -1 representerer karboksylgruppene. Både bein og ganoine lag 'spektra produsert en særegen peak nær 1,079.33 cm -1 indikerer strekker fosfat.
Røntgen CT-bilder i figur 5 fanger at ganoine lag ikke dekker benet sjikt hvor skalaene overlapper hverandre. De lysere grå ganoine lag indikerer tettere, hardere og stivere faser mens mørkere grå bein lag indikerer mindre tette og mindre stive faser. I tillegg har X-ray CT bilder hjulpet i å identifisere ikke-ensartethet i ganoine tykkelse. Faktisk er klare groper observert i nærheten av midten av ganoine lag, som ikke dekker benet laget i det hele tatt.
SEM bildet i Figur 6A av bruddflaten etset med H 3 PO 4 avslørte nanostrukturer som er organisert i en lagdelt mønster for ganoine lag. Dette nanorod-organiserteStrukturen korrelerer til hydroksyapatitt signaturer oppnådd fra FTIR for ganoine området.
Figur 6A viser et typisk lavere forstørrelse SEM mikrografi av en bruddflate klart identifisere overgangen mellom ganoine og skjelettlagene med den stiplede linje. Figur 6B skildrer de høyere forstørrelse SEM bilder av bruddflaten etter etsing med H 3 PO 4. Etter etsing, orienterte nanorods i det ytre ganoine laget er klart identifiserbar mens en fiberlignende nanostrukturen er observert i benet lag.
Figur 3.. Modulus og hardhet data fra nanoindentation romlig korrelert til SEM / EDX kjemisk sammensetning.
Figur 4. FTIR spektra samlet inn fra den ytre (ganoine) og indre (benete) lag.
Figur 5. Røntgen CT-bilder som viser fordypninger på den ytre (ganoine) lag som dekker den indre (bony) lag.
Figur 6. (A) Lav forstørrelse SEM bilde av typiske bruddflaten, (b) høyere forstørrelse bilder av nanorods i den ytre (ganoine), og fibrene i det innerste (bony) lag .. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Fra en eksperimentell synspunkt, forskere må huske at når du arbeider med naturlig forekommende biologisk materiale som mineralisert fiskeskjell, rapporterer den romlige plasseringen av skalaen på fisken er kritisk ettersom tidligere forskning har vist mekaniske egenskapene til mineralisert skjell er avhengig å hvor vekten ble plassert på fisken fire.
Mekaniske egenskaper av mineraliserte biologiske materialer har også vist seg å være avhengig av hydratisering tilstand av prøvene 4. Dette begrenser nytten av denne teknikken når du prøver å sammenligne nye prøver som har blitt skikkelig hydrert til publiserte resultater i den åpne litteraturen, som bruker tørre fossile prøver. Derfor langvarig testing ganger må unngås for å redusere virkningene av dehydrering på et utvalg mekaniske egenskaper under nanoindentation. Materielle konkrete pilotstudier anbefales å sikre erfaringling kjøretids er minimal nok til å ikke endre den mekaniske oppførsel av materialet. Våt celle nanoindentation ville være en foretrukket metode for å holde et konstant væsketilstand av materialet dersom testutstyr tillater det.
Den nanoindentation metode som brukes i denne undersøkelsen, som beregnet elastisitetsmodul fra losse kurve går materialet oppfører seg som en lineær elastisk isotropisk materiale. Teknikken kan brukes med en rekke indenter tips. Imidlertid var de tre-sidig Berkovich spiss med en halv vinkel på 65,35 ° er brukt i denne studien. Alternativt tips som kubehjørne (halv vinkel = 35.36 °) er egnet for fremgangsmåten presentert i dette manuskriptet, men siden kubehjørne spissen er mer akutt enn Berkovich tippe sprekker kan dannes i prøven ved mye lavere belastninger enn ved den Berkovich tips.
Polering er et viktig skritt for å oppnå en glatt og flat overflate med en minimert surface ruhet å ikke påvirke nanoindentation resultater. De poleringsmåten som presenteres i dette manuskriptet er en foreslått fremgangsmåte som kan trenge å bli endret avhengig av hvilken type av poleringsmaskin som brukes. Imidlertid er det kritisk trinn for å sikre nøyaktig nanoindentation data som overflateruhet er minimert, og for dette spesielle materialet en 50 nm endelige polish var nødvendig for å få en jevn flat overflate på innrykks dybder som probe.
Avstanden mellom innrykk sikrer også nøyaktig nanoindentation data som ikke er påvirket av materialet deformasjon oppstår fra tidligere innrykk. Den nanoindenter bruksanvisningen for utstyret i denne studien antydet at innrykk avstanden skal være minst 20-30x maksimal inntrengningsdybde for Berkovich Indenters 15. For alternative materialer, vil den nødvendige strekavstanden må fastsettes basert på anvendt belastning og maksimal innrykk som omtalt tidligere i åpenlitteratur 16,17. I tillegg, ble valgt holdetiden for dette materialet for å overvinne enhver kryping observert for de forskjellige materialfaser probed slik at for nanoindenter programvaren Oliver-Pharr analysemetode som skal anvendes. Men som diskutert av Oyen 18 alternative analysemetoder er tilgjengelig for biologisk materiale når tidsavhengige materialet svar ikke kan overvinnes med egnede hold ganger.
For å oppnå høy oppløsning resultater fra røntgenstråle CT, må flere innstillinger optimaliseres. Denne artikkelen beskriver et meget spesifikt sett med parametere for bruk på en fisk skala med en unik størrelse og lagdelt tykkelse. Med varierende utvalgsstørrelser, vil disse innstillingene må justeres for å få et datasett av høyeste kvalitet. Prosessen med å velge hver parameter bør være klart definert i bruksanvisningen som følger med maskinen er blitt brukt. Skanneinnstillinger (spenning, strøm, eksponering, valg filter) og gjenoppbygging innstillinger(ring gjenstander, beam herding) kan trenge å bli endret for å imøtekomme en rekke andre utvalgsstørrelser og geometrier.
Røntgen CT gitt et bilde av hele skala morfologi som identifiserer en ganoine lag som dekker et lag av knokkelmaterialet hvor vekten ikke overlapper hverandre. Røntgen CT-bilder identifiseres også at ganoine sjikt besto av en ikke-ensartet tykkelse over hele skalaen, og selv utstilte groper som manglet den ganoine sjikt helt.
Interessant, nanoindentation data romlig korrelert til SEM / EDX kjemisk analyse identifisert en skarp diskret overgang mellom de to lagene i stedet for en mer gradvis overgang observert for de mineraliserte skjell av P. senagalus (i Bruet et al. 2).
En kombinasjon av nanoindentation, FTIR, EDX, og SEM gitt mekanisk eiendom, kjemisk analyse, og strukturell informasjon for å bekreftedet ytterste laget som ganoine med emalje lignende morfologi og kjemi. I tillegg er disse teknikkene bekreftet det indre laget som en bony lag av materiale.
Som konklusjon, metodene som er skissert i denne undersøkelsen identifisert fremgangsmåte og tilsvarende resultater for å undersøke mineralisert fisk skala av A. spatel fra bulkstrukturen ned til nanostrukturen og kjemisk sammensetning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne økonomisk støtte til dette arbeidet gitt av den amerikanske hæren ERDC Military Engineering 6.1 Basic Research Program og ERDC senter for dirigert Research Program. Forfatterne ønsker også å takke de ansatte og fasiliteter av ERDC Geotekniske konstruksjons Laboratory Betong og Materials Branch for å støtte det eksperimentelle arbeidet. Tillatelse til å publisere ble gitt av direktøren, Geotekniske & Structures Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy resin | Buehler | 701-501512 | |
| Epoxy hardener | Buehler | 703-501528 | |
| Samplkups | Buheler | 20-8180 | |
| SamplKlips I | Buehler | 20-4100-100S | |
| High precision cut-off saw | Buehler | Isomet | |
| UltraMet 2002 sonic cleaner | Buehler | B2510R-MT | |
| Polisher | Buehler | 49-1750-160 | |
| 1,200 grit (15 μm) SiC paper | Struers | 40400012 | |
| 4,000 grit (6 μm) SiC paper | Struers | 40400014 | |
| 50 nm colloidal silica | Buehler | 40-10075 | |
| Chemomet polishing pad for 50 nm suspension | Buehler | 40-7918 | |
| Nanoindenter | MTS | G200 | |
| FTIR continuum microscope | Thermo Nicollet | 6700 | |
| X-ray computed tomography | Skyscan | Skyscan 1173 | |
| SEM | FEI | NovaNanoSEM 630 | |
| EDX | Bruker | AXS Xflash detector 4010 | |
| Sputter coater | Denton | Desk II |
References
- Allison, P. G., et al. Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales. Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).
- Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. Materials design principles of ancient fish armour. Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).
- Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).
- Marino Cugno Garrano, A., et al. On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).
- Song, J., et al. Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).
- Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton. J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).
- Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major. 142, 327-333 (2003).
- O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana. Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).
- Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus. J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).
- Page, L. M., Burr, B. M. A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , Houghton Mifflin Company. (1991).
- Thompson, K. S., McCune, A. R. Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes. J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).
- Yang, W., et al. Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales. Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).
- Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX. J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).
- Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).
- Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , Agilent Technologies Inc. Palo Alto. (2012).
- Ulm, F. J., et al. Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale. J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).
- Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -J. Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces. J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).
- Oyen, M. L. Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials. Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).
