Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması
Summary
Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.
Abstract
Işlenmiş bir streptavidin (Strep-taktin) taşıyan reçineleri Strep-etiketli füzyon proteinlerinin afinite saflaştırılması, fizyolojik koşullar altında, protein kompleksleri izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Çift-Strep-etiket ya da SIII-etiketi belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri, böylece daha etkili bir protein arıtma sağlayan, tek bir Strep-etiketi ihtiva eden kıyasla Strep-taktin için daha yüksek afinite avantajına sahiptir. Ancak bu avantaj biyotin ile çift-Strep ile işaretlenmiş olan proteinlerin elüsyon düşük protein geri kazanımı yol açan, eksik olabilir gerçeği ile dengelenir. Kurtarma önemli ölçüde sodyum dodesil sülfat (SDS) ile denatüre elüsyonu kullanılarak geliştirilebilir, ancak bu alt-proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin bulaşmasını örnek yol açar. Bu sınırlamayı aşmak için, bir yöntem Strep-taktin bu sayede, reçine-birleştiğinde tetramerdir geliştirdikilk kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlama ile elde edilen çapraz bağlanmış Reçine daha sonra, bir tek partili saflaştırma adımında, hedef protein komplekslerinin saflaştırılması için kullanılan ile stabilize edilir. Strep-taktin kontamine olmaması kütle spektrometresi ile aşağı protein analizine olanak verirken SDS verimli yıkama, iyi bir protein iyileşme sağlar. Kavramının bir kanıtı olarak, virüs bulaşmış N. çekirdeklerden VPg-Pro SIII-etiketli viral proteinin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar BS3 ile çapraz bağlanmış Strep-taktin polimetakrilat reçine kullanılarak benthamiana bitkileri. Aynı protokol, ilgi duyulan herhangi bir çift-Strep-etiketli proteinin saflaştırılması ve bunun fizyolojik bağlanma ortakları karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Son yıllarda, Strep-etiket teknolojisi proteomik ve yapısal biyoloji dahil olmak üzere biyomedikal araştırmanın birçok alanda yaygın olarak kullanılır hale gelmiştir. Kısa bir Strep-eklentisi peptide rekombinant proteinlerin füzyon dayanır Bu protein saflaştırma tekniği, Strep-taktin, geliştirilmiş peptid-bağlama kapasiteli streptavidin bir varyantını taşıyan genetik olarak benzer matrislere gelişine olgunlaşmıştır. 1, 2 çift-Strep-eklentisi veya SIII-eklentisi, sergi rekombinant proteinlerin daha etkili bir temizlik sağlanması, sadece tek bir Strep-etiketi ihtiva eden daha Strep-taktin matrisler için daha yüksek bir afinite ve belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri ilişkili bağlama ortakları. Bununla birlikte, Strep-taktin için çift-Strep-etiketli proteinlerinin daha yüksek afinite da yanları vardır. Fazla biotin ile bu tür proteinlerin Rekabetçi elüsyon hedef protein verimi azalmasına yol, eksik olabilir. A mcevher Diğer alternatif SDS ile yıkama, ancak proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin ile istenmeyen örnek kirlenmesine yol açar. Bu çalışma, birinci kimyasal çapraz bağlama ile Strep-taktin reçine çiftli tetramer stabilize etme ve daha sonra elde edilen çapraz bağlanmış reçinenin ikinci çift-Strep-etiketli proteinleri ve ilgili kompleksleri elüt edilmesi için SDS kullanarak bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yöntem sunar. Bu nedenle, yeterli bir protein verimi ve böylece kütle spektrometresi ile daha fazla analiz sağlayan, Strep-taktin numune kirlenme olmadan elde edilebilir.
Yöntem, bir yüzey-açık-etiket SIII 3 ya da çift-Strep-etiketi (amino asit sekansı WSHPQFEK (GGGS) sırasıyla 3 ve WSHPQFEK SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) ile herhangi bir rekombinant füzyon proteininin saflaştırılması için uygundur. Protein, hayvan, bitki veya bakteri kaynaklı olabilir ve toplam hücre ya da izole edilebilirlizatı veya organel zenginleştirilmiş fraksiyon. Bir örnek olarak, burada PVA ile enfekte edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerinin nükleer fraksiyondan Potato Virüs A (PVA) 4 bir SIII etiketli protein VPg-Pro saflaştırılmasını anlatmaktadır. Daha önce, aşağıdaki modifikasyonlar ile, tarif edildiği gibi, 5 nükleer fraksiyon izole edilmiştir: hücre formaldehit ile tedavi edildi, sodyum bütirat 5 mM sodyum fluorür Tüm tamponlar içinde ikame edilmiş, tam proteaz inhibitör PMSF ile ikame edilmiş, ekstre içinde Triton X-100 konsantrasyonu tampon # 2% 0.3 'e düşürülmüştür (v / v) ve (ekstraksiyon tampon # 3) sakroz yastığı içinden santrifüjleme ile elde edilen nükleer pelet önceden soğutulmuş bağlanma tamponu içinde 1.45 ml içinde yeniden süspansiye edildi ve 4 ° C' de 1.5 saat boyunca döndürülür SIII-etiketli yem protein ve ilişkili kompleksler (yem protein örneği) ihtiva eden ortaya çıkan çekirdek ekstraktı, (bakınız bölüm 2), aşağıda tarif edilen protokole göre işlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokol biotin ya da güçlü denşirme içermeyen, herhangi bir uygun tampon maddesi içinde ilgi ve ilgili kompleksleri herhangi bir çift-Strep-etiketli yem proteini saflaştırmak için kullanılabilir. Protokol geçerli sürümünde, bağlanma ve yıkama, yüksek tuz ve iyonik olmayan deterjanın varlığında, nispeten sert koşullar altında gerçekleştirilir. Bu, daha az arka sonuçlanır, ancak kırılgan protein kompleksleri, bu koşullar altında ayırmak olabilir. Örneğin düşük afinite kom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz minnetle Sini Miettinen, Minna Pöllänen ve Taru Rautavesi teknik destek için minnettarım. Biz HEK ses kayıt ekipmanları sağlanması için ikiz-Strep-etiketli GFP ve Pekka Evijarvi ifade 293 hücreler sağlamak için Helka Nurkkala teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya Akademisi tarafından finanse edildi, sayıları 138329, 134684 ve 258978 hibe.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
