Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)
Summary
É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.
Abstract
A purificação por afinidade das proteínas de fusão marcadas com Strep-resinas que transportam um estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) tornou-se um método utilizado para o isolamento de complexos de proteínas sob condições fisiológicas. As proteínas de fusão que contêm duas cópias de Strep-tag II, designadas-Strep-tag ou duplo SIII-tag, têm a vantagem de uma maior afinidade para o Strep-Tactin em comparação com aquelas que contêm apenas um Strep-tag único, permitindo assim a purificação da proteína mais eficiente. No entanto, esta vantagem é compensada pelo fato de que a eluição de proteínas twin-Strep-marcadas com biotina pode ser incompleta, levando a baixa recuperação de proteína. A recuperação pode ser drasticamente melhorada utilizando desnaturação eluição com dodecil-sulfato de sódio (SDS), mas isto conduz a amostra de contaminação com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteómica jusante. Para superar esta limitação, temos desenvolvido um método pelo qual tetrâmero acoplados à resina de Strep-Tactiné estabilizada pela primeira vez por reticulação covalente com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3), e a resina com ligações cruzadas resultante é, então, utilizada para purificar complexos de proteínas-alvo em um único passo de purificação por lotes. Eluição eficiente com SDS garante uma boa recuperação de proteína, enquanto a ausência de contaminação Strep-Tactin permite a análise de proteínas downstream por espectrometria de massa. Como prova do conceito, aqui descrita de um protocolo para a purificação de proteínas virais SIII marcado com VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectadas com vírus benthamiana plantas utilizando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. O mesmo protocolo pode ser utilizado para purificar qualquer proteína duplo-Strep-tag de interesse e caracterizar os seus parceiros de ligação fisiológicas.
Introduction
Nos últimos anos, a tecnologia Strep-tag tornou-se amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa biomédica, incluindo proteômica e biologia estrutural. Esta tecnologia de purificação de proteínas, o qual baseia-se na fusão de proteínas recombinantes a um péptido curto Strep-tag, amadureceu com o advento de matrizes de afinidade que transportam Strep-Tactin, uma variante geneticamente modificada de estreptavidina com uma melhor capacidade de ligação de péptidos 1, 2. As proteínas de fusão contendo duas cópias do Strep-tag II, designados-Strep-tag ou twin-tag SIII, exibem uma maior afinidade para matrizes Strep-Tactin do que aqueles que contêm apenas uma tag Strep único, garantindo a purificação mais eficiente das proteínas recombinantes e seus parceiros de ligação associados. No entanto, a maior afinidade de proteínas twin-Strep-tag para Strep-Tactin também tem seu lado negativo. Eluição competitiva de tais proteínas, com o excesso de biotina pode ser incompleta, levando à produção de proteína alvo diminui. Um mminério eficiente alternativa é a eluição com SDS, mas conduz a uma contaminação indesejada da amostra com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteoma. Este documento apresenta uma técnica para superar esta limitação, o primeiro estabilizador tetrâmero acoplado à resina de Strep-Tactin por reticulação química e, em seguida, utilizando SDS para eluir proteínas de duplo Strep-tag e os seus complexos associados a partir da resina com ligações cruzadas resultante. Assim, o rendimento de proteína suficiente pode ser conseguida sem a contaminação da amostra com Strep-Tactin, permitindo, assim, ainda mais a análise por espectrometria de massa.
O método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão recombinante com uma etiqueta de SIII exposto à superfície ou 3-Strep-tag duplo (WSHPQFEK sequência de aminoácidos (GGGS) 3 WSHPQFEK SAWSHPQFEK e (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou de origem bacteriana e pode ser isolado a partir de qualquer célula totaislisado ou fracção enriquecida organelo. Como exemplo, descrevemos aqui a purificação de uma proteína marcada com SIII VPg-Pro de batata vírus A (PVA) 4 a partir da fracção nuclear de PVA-infectadas de plantas de Nicotiana benthamiana. A fracção nuclear foi isolado como descrito anteriormente 5, com as seguintes modificações: As células não foram tratadas com o formaldeído, o butirato de sódio foi substituído em todos os tampões, com fluoreto de sódio 5 mM, inibidor de protease completo foi substituído com PMSF, Triton X-100 a concentração na extracção tampão # 2 foi reduzido para 0,3% (v / v) e o sedimento nuclear obtida por centrifugação através de almofada de sacarose (tampão de extracção # 3) foi novamente suspenso em 1,45 ml de tampão de ligação pré-refrigerado e rodado durante 1,5 horas a 4 ° C. O extrato nuclear resultante contendo a proteína isca SIII-marcados e complexos associados (amostra proteína isca) foi processado de acordo com o protocolo descrito a seguir (ver secção 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima pode ser utilizado para purificar qualquer proteína isco duplo-Strep-tag de interesse e os seus complexos associados em qualquer tampão adequado, que não contém biotina ou desnaturantes fortes. Na versão atual do protocolo, obrigatório e lavagem são realizadas em condições relativamente severas na presença de alto teor de sal e detergente não-iônico. Embora isto resulta em menos fundo, complexos de proteína frágeis podem dissociar sob estas condições. Para preservar os complexos de afin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio técnico da Sini Miettinen, Minna Pöllänen e Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para fornecer HEK 293 células expressando twin-Strep-marcado GFP e Pekka Evijärvi para o fornecimento de equipamentos de gravação de som. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 138329, 134684 e 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
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