ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.
أصبحت تنقية تقارب من البروتينات الانصهار بكتيريا الموسومة على راتنجات يحمل streptavidin هندسيا (بكتيريا-Tactin) طريقة تستخدم على نطاق واسع لعزل المجمعات البروتين في ظل الظروف الفسيولوجية. البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، لديها ميزة أعلى النسب للبكتيريا-Tactin مقارنة مع تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا البطاقات، مما يسمح تنقية البروتين أكثر فعالية. ومع ذلك، ويقابل هذه الميزة من حقيقة أن شطف من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة مع البيوتين قد تكون غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الانتعاش البروتين. الانتعاش يمكن تحسنت بشكل كبير باستخدام تغيير طبيعة شطف مع دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ولكن هذا يؤدي إلى تلوث عينة مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين المصب. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتطوير طريقة tetramer حيث يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactinواستقرت أول من التساهمية عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) ثم يستخدم الناتجة الراتنج عبر ربط لتنقية البروتين المجمعات المستهدفة في خطوة تنقية دفعة واحدة. شطف كفاءة مع SDS يضمن الانتعاش البروتين جيدة، في حين أن غياب بكتيريا تلوث-Tactin يسمح تحليل البروتين المصب بواسطة مطياف الكتلة. كدليل على المفهوم، ونحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتين الفيروسي SIII الموسومة VPG-Pro من نوى N. المصابة بالفيروسات النباتات benthamiana باستخدام الراتنج polymethacrylate بكتيريا-Tactin مرتبطة مع الصليب BS3. البروتوكول نفسه يمكن أن تستخدم لتنقية البروتين أي التوأم بكتيريا الموسومة المصالح وتميز شركائها ملزمة الفسيولوجية.
في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا بكتيريا البطاقات المستخدمة على نطاق واسع في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك البروتينات وعلم الأحياء الهيكلي. هذه التكنولوجيا لتنقية البروتين، والذي يعتمد على مزيج من البروتينات المؤتلف لفترة قصيرة بكتيريا علامة الببتيد، قد نضجت مع ظهور المصفوفات تقارب تحمل بكتيريا-Tactin، وهو البديل المعدلة وراثيا من streptavidin مع تحسين القدرات ملزمة الببتيد. 1، 2 البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، المعرض تقارب أعلى للمصفوفات بكتيريا-Tactin من تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا علامة، وضمان تنقية أكثر كفاءة من البروتينات المؤتلف و شركاء ملزمة المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن تقارب أعلى من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة إلى بكتيريا-Tactin ديها أيضا سلبيات. شطف التنافسية لهذه البروتينات مع البيوتين الزائدة قد تكون غير مكتملة، مما يؤدي إلى انخفاض العائد المستهدف البروتين. A مكفاءة خام البديل هو شطف مع SDS، لكنه يؤدي إلى تلوث العينة غير مرغوب فيها مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين. تعرض هذه الورقة تقنية للتغلب على هذا التحديد عن طريق تثبيت لأول مرة tetramer يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactin حسب المادة الكيميائية عبر ربط ثم باستخدام SDS إلى أزل البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات المرتبطة بها من الناتج راتنج عبر ربط. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق العائد كافية من البروتين دون تلوث العينة مع بكتيريا-Tactin، مما يتيح المزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة.
هذه الطريقة مناسبة لتنقية أي انصهار بروتين المؤتلف مع المعرضة للسطح SIII علامة 3 أو التوأم بكتيريا علامة (WSHPQFEK تسلسل الأحماض الأمينية (GGGS) 3 WSHPQFEK وSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK، على التوالي). البروتين يمكن أن يكون من الحيوان والنبات أو الأصل البكتيرية ويمكن عزلها من خلية إما مجموعالمحللة أو المخصب عضية الكسر. كمثال على ذلك، ونحن تصف هنا تنقية من البروتين SIII الموسومة VPG برو من الفيروسات البطاطس A (PVA) 4 من الكسر النووية من PVA المصابة النباتات benthamiana نيكوتيانا. تم عزل جزء النووية كما هو موضح سابقا 5، مع إجراء التعديلات التالية: لم يعاملوا الخلايا مع الفورمالديهايد، تم استبداله بوتيرات الصوديوم في جميع مخازن مع 5 ملي فلوريد الصوديوم، تم استبداله كاملة مثبط البروتياز مع PMSF، تريتون X-100 تركيز في استخراج تم تخفيض العازلة # 2 إلى 0.3٪ (ت / ت) وكان بيليه معلق النووي التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة السكروز (العازلة استخراج # 3) في 1.45 مل من العازلة ملزمة قبل المبردة وتناوب لمدة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تم معالجة واستخراج النووية الناتجة تحتوي على البروتين الطعم SIII الموسومة والمجمعات المرتبطة بها (عينة البروتين الطعم) وفقا لبروتوكول موضح أدناه (انظر القسم 2).
بروتوكول أعلاه يمكن استخدامها لتنقية أي بروتين الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة المصالح والمجمعات المرتبطة به في أي مناسبة العازلة التي لا تحتوي على البيوتين أو denaturants قوية. في النسخة الحالية من بروتوكول، يتم تنفيذ ملزمة وغسل تحت شروط صارمة نسبيا في وجود الملح العالي…
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف بامتنان الدعم الفني من سيني Miettinen، مينا Pöllänen وترو Rautavesi. نشكر Helka Nurkkala لتوفير HEK 293 الخلايا معربا عن التوأم بكتيريا الموسومة GFP وبيكا Evijärvi لتوفير معدات تسجيل الصوت. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الأكاديمية من فنلندا، منح أرقام 138329، 134684 258978 و.
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |