Et-trins Oprensning af Twin-Strep-mærkede proteiner og deres komplekser på Strep-Tactin Resin tværbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)
Summary
En metode er beskrevet til effektiv rensning af twin-Strep-kodede fusionsproteiner og deres specifikke komplekser på modificeret streptavidin (Strep-Tactin) harpiks kovalent krydsbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Fremgangsmåden har fordelene ved hurtig hastighed, god målprotein nyttiggørelse og høj renhed, og er forenelig med efterfølgende analyse ved massespektrometri.
Abstract
Affinitetsoprensning af Strep-mærkede fusionsproteiner på harpikser bærer en manipuleret streptavidin (Strep-Tactin) er blevet en udbredt metode til isolering af protein-komplekser under fysiologiske betingelser. Fusionsproteiner indeholdende to kopier af Strep-tag II udpegede twin-Strep-tag eller SIII-tag, har fordelen af en højere affinitet for Strep-Tactin forhold til dem, der kun indeholder en enkelt Strep-tag, således at en mere effektiv rensning af proteiner. Imidlertid er denne fordel modsvares af den kendsgerning, at eluering af twin-Strep-mærkede proteiner med biotin kan være ufuldstændig, hvilket fører til lavt proteinindhold recovery. Genopretning kan forbedres dramatisk ved hjælp af denaturerende eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men dette fører til prøve kontaminering med Strep-Tactin frigives fra harpiksen, hvilket gør assayet uforenelig med nedstrøms proteom analyse. For at overvinde denne begrænsning, har vi udviklet en metode, hvor harpiks-koblede tetramer af Strep-Tactinførst stabiliseret ved covalent tværbinding med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3), og den resulterende tværbundne harpiks derefter anvendes til at oprense target protein-komplekser i en enkelt batch oprensningstrin. Effektiv eluering med SDS sikrer god protein recovery, mens fravær af kontaminerende Strep-Tactin tillader nedstrøms protein analyse ved massespektrometri. Som et proof of concept, vi beskriver her en protokol til oprensning af SIII-mærket viralt protein VPG-Pro fra kerner af virus-inficerede N. benthamiana anlæg, der anvender Strep-Tactin polymethacrylatharpiks tværbundet med BS3. Den samme protokol kan anvendes til at oprense enhver twin-Strep-mærkede protein af interesse og karakterisere dets fysiologiske bindingspartnere.
Introduction
I de senere år har Strep-tag teknologien bliver udbredt i mange områder af biomedicinsk forskning, herunder proteomics og strukturel biologi. Dette protein rensning teknologi, som er baseret på fusionen af rekombinante proteiner til en kort Strep-tag-peptidet, er modnet med fremkomsten af affinitetsmatricer bærer Strep-Tactin, et gensplejset variant af streptavidin med forbedret peptid-bindende kapacitet. 1, 2 fusionsproteiner indeholdende to kopier af Strep-tag II, der er udpeget twin-Strep-tag eller SIII-tag, udviser en højere affinitet for Strep-Tactin matricer end dem, der kun indeholder et enkelt Strep-tag, sikre en mere effektiv rensning af rekombinante proteiner og deres tilknyttede bindingspartnere. Men den højere affinitet af twin-Strep-mærkede proteiner til Strep-Tactin har også sin downside. Konkurrencedygtige eluering af sådanne proteiner med overskydende biotin kan være ufuldstændige, hvilket fører til nedsat target protein udbytte. A mmalm effektivt alternativ er eluering med SDS, men det fører til uønsket prøvekontamination med Strep-Tactin frigives fra harpiksen, hvilket gør assayet uforenelig med proteom analyse. Denne artikel præsenterer en teknik til at overvinde denne begrænsning ved først at stabilisere harpiks-koblede tetramer af Strep-Tactin ved kemisk krydsbinding og derefter bruge SDS til eluering af twin-Strep-mærkede proteiner og deres tilknyttede komplekser fra den resulterende tværbunden harpiks. Således kan tilstrækkelig proteinudbytte opnås uden forurening prøve med Strep-Tactin, hvorved yderligere analyse ved massespektrometri.
Metoden er egnet til oprensning af en hvilken som helst rekombinant fusionsprotein med en overflade-eksponerede SIII-mærke 3 eller dobbelt-Strep-tag (aminosyresekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK og SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, henholdsvis). Proteinet kan være af animalsk, plante-eller bakteriel oprindelse og kan isoleres fra enten total cellelysat eller beriget organel fraktion. Som et eksempel beskriver vi her oprensningen af en SIII-mærket protein VPG-Pro kartoffel virus A (PVA) 4 fra kernefraktionen PVA-inficerede Nicotiana benthamiana planter. Kernefraktionen blev isoleret som tidligere beskrevet 5 med følgende modifikationer: celler blev ikke behandlet med formaldehyd, blev natriumbutyrat substitueret i alle buffere med 5 mM natriumfluorid blev fuldstændig proteaseinhibitor substitueret med PMSF Triton X-100-koncentration i ekstraktion buffer # 2 blev sænket til 0,3% (v / v), og den nukleare pille opnået ved centrifugering gennem saccharosepude (ekstraktionsbuffer # 3) blev resuspenderet i 1,45 ml forafkølet bindingsbuffer og roteret i 1,5 timer ved 4 ° C. Den resulterende nukleare ekstrakt, der indeholder den SIII-mærkede bait protein og associerede komplekser (bait protein prøven) er behandlet i henhold til protokollen beskrevet nedenfor (se afsnit 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovennævnte protokol kan anvendes til at oprense enhver twin-Strep-mærket agn protein af interesse og dens tilhørende komplekser i en egnet buffer, der ikke indeholder biotin eller stærke denatureringsmidler. I den nuværende udgave af protokollen, er bindende og vask udføres under relativt strenge betingelser i tilstedeværelse af høje salt-og ikke-ionisk detergent. Selvom dette resulterer i mindre baggrund kan skrøbelige proteinkomplekser dissociere under disse betingelser. For at bevare sådanne lavere affinite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker den tekniske support af Sini Miettinen, Minna Pöllänen og Taru Rautavesi. Vi takker Helka Nurkkala for at yde HEK 293 celler, der udtrykker twin-Strep-mærket GFP og Pekka Evijärvi for at yde lydoptagelse udstyr. Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi, giver numrene 138.329, 134.684 og 258.978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
