Une étape de purification de protéines Twin-Strep-marqués et leurs complexes sur Strep-Tactin résine réticulée Avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)
Summary
Une méthode est décrite pour la purification efficace de protéines de fusion bi-Strep-marqués et leurs complexes spécifiques sur streptavidine modifiée (Strep-Tactin) résine réticulé de manière covalente avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3). Le procédé présente les avantages d'une vitesse rapide, une bonne récupération de la protéine cible et de haute pureté, et est compatible avec une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
Abstract
La purification par affinité de protéines de fusion Strep-marquées sur résines portant une streptavidine ingénierie (Strep-Tactin) est devenue une méthode largement utilisée pour l'isolement des complexes de protéines dans des conditions physiologiques. Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, ont l'avantage d'une plus grande affinité pour Strep-Tactin par rapport à celles ne contenant qu'un Strep-tag unique, permettant ainsi la purification de protéines plus efficace. Cependant, cet avantage est compensé par le fait que l'élution de protéines double Strep-marqués avec de la biotine peut être incomplète, conduisant à une faible récupération des protéines. La récupération peut être considérablement améliorée en utilisant une élution avec dénaturant le dodécylsulfate de sodium (SDS), mais ceci conduit à une contamination par des Strep-Tactin libéré de la résine de l'échantillon, rendant le test incompatible avec l'analyse protéomique aval. Pour surmonter cette limitation, nous avons mis au point un procédé par lequel des tétramères de résine couplée à de Strep-Tactinest tout d'abord stabilisé par des liaisons covalentes de réticulation avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3) et de la résine réticulée résultante est ensuite utilisée pour purifier des complexes de protéines cibles en une seule étape de purification par lots. Élution efficace avec SDS assure une bonne récupération des protéines, tandis que l'absence de contamination Strep-Tactin permet en aval l'analyse des protéines par spectrométrie de masse. Comme une preuve de concept, que nous décrivons ici un protocole pour la purification de la protéine virale SIII étiqueté VPg-Pro à partir de noyaux de N. infecté par un virus benthamiana plantes à l'aide de la résine de polyméthacrylate de Strep-Tactin réticulé avec BS3. Le même protocole peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine bi-Strep-marqué d'intérêt et caractériser ses partenaires de liaison physiologiques.
Introduction
Au cours des dernières années, la technologie Strep-tag a été largement utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale, y compris la protéomique et la biologie structurale. Cette technologie de purification des protéines, qui repose sur la fusion de protéines recombinantes à une courte Strep-tag peptide, a évolué avec l'avènement des matrices d'affinité portant des Strep-Tactin, une variante génétiquement modifiée de la streptavidine avec une meilleure capacité de liaison au peptide 1, 2. Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, présentent une plus grande affinité pour les matrices Strep-Tactin que ceux contenant seulement un Strep-tag unique, assurant la purification plus efficace des protéines recombinantes et leurs partenaires de liaison associés. Cependant, la plus grande affinité de protéines double-Strep-marqués à Strep-Tactin a aussi son revers. Élution compétitive de ces protéines avec un excès de biotine peut être incomplète, conduisant à une diminution du rendement en protéines cible. A mefficace minerai alternative est élution avec du SDS, mais elle conduit à la contamination de l'échantillon non désiré avec Strep-Tactin libéré de la résine, ce qui rend le dosage incompatible avec l'analyse protéomique. Cet article présente une technique pour surmonter cette limitation en première stabiliser le tétramère de résine couplée de Strep-Tactin par réticulation chimique, puis en utilisant SDS pour éluer les protéines bi-Strep-marqués et leurs complexes associés de la résine réticulée résultant. Ainsi, le rendement en protéines suffisante peut être obtenue sans contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin, ce qui permet en outre l'analyse par spectrométrie de masse.
La méthode est adaptée pour la purification de toute protéine de fusion recombinante avec un SIII-tag exposée en surface 3 ou bi-Strep-tag (WSHPQFEK de séquence d'acides aminés (GGGS) 3 WSHPQFEK et SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivement). La protéine peut être d'origine animale, végétale ou bactérienne et peut être soit isolé à partir de cellules totaleslysat ou fraction de organite enrichi. A titre d'exemple, nous décrivons ici la purification d'une protéine à étiquette SIII VPg-Pro Potato Virus de A (PVA) 4 à partir de la fraction nucléaire de plants de Nicotiana benthamiana infectés par le PVA. La fraction nucléaire a été isolé comme décrit précédemment 5, avec les modifications suivantes: les cellules sont traitées avec du formaldéhyde, le butyrate de sodium a été substitué dans tous les tampons avec du fluorure de sodium 5 mM, inhibiteur complet de protease a été substitué par PMSF, Triton X-100 à une concentration dans l'extraction tampon N ° 2 a été abaissée à 0,3% (v / v) et le culot nucléaire obtenu par centrifugation à travers des coussins de saccharose (tampon d'extraction N ° 3) a été remis en suspension dans 1,45 ml de tampon de liaison pré-réfrigérés et mis en rotation pendant 1,5 heures à 4 ° C. L'extrait nucléaire résultant contenant la protéine appât SIII marqués et complexes associés (échantillon de protéine appât) a été traitée selon le protocole décrit ci-dessous (voir la section 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole ci-dessus peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine appât double-Strep-marqué d'intérêt et ses complexes sont associés à n'importe quel tampon convenable qui ne contient pas de la biotine ou des dénaturants forts. Dans la version actuelle du protocole, de liaison et de lavage sont effectuées dans des conditions relativement strictes en la présence de forte teneur en sel et un détergent non-ionique. Bien que cela se traduit par moins de fond, des complexes de protéin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons avec gratitude le soutien technique de Sini Miettinen, Minna Pöllänen et Taru Rautavesi. Nous remercions Helka Nurkkala pour fournir des cellules HEK 293 exprimant double-Strep-GFP étiqueté et Pekka Evijärvi pour la fourniture de matériel d'enregistrement sonore. Ce travail a été financé par l'Académie de Finlande, accorder les numéros 138329, 134684 et 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
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