Описан способ эффективного очищения твин-Strep-меченых гибридных белков и их специфических комплексов на модифицированной стрептавидином (Strep-Tactin) смолу, ковалентно сшитый с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3). Способ имеет преимущества высокой скорости, хорошее восстановление белка-мишени и высокой степенью чистоты, и совместим с последующим анализом методом масс-спектрометрии.
Affinity очистка Стрептококковое метками слитых белков на смол, несущих инженерии стрептавидин (Стрептококковое-Tactin) стал широко используемым методом для выделения белковых комплексов в физиологических условиях. Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной-Strep-теги или SIII-тег, имеют то преимущество, более высокое сродство к Strep-Tactin по сравнению с те, которые содержат только один Strep-тег, что позволяет более эффективную очистку белка. Однако это преимущество компенсируется тем, что вымывание твин-Стрептококковое-меченых белков с биотин может быть неполной, что приводит к низкой восстановления белка. Восстановление может быть значительно улучшена с помощью денатурирующего элюирование с додецилсульфатом натрия (SDS), но это приводит к образцу заражение Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с последующей протеомного анализа. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали метод, посредством смолы в сочетании тетрамерное из Strep-Tactinсначала стабилизированы ковалентной сшивки с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) и полученную сшитый полимер затем использовать для очистки целевых комплексов белков в одной стадии очистки пакета. Эффективное элюирование SDS обеспечивает хорошее восстановление белка, а отсутствие загрязнения Strep-Tactin позволяет потоку анализа белков методом масс-спектрометрии. Как доказательство концепции, мы описываем здесь протокол для очистки SIII-меченого вирусного белка ВПГ-Pro из ядер инфицированных вирусом N. benthamiana растения, использующие полиметакрилатные смолы Стрептококковое-Tactin сшитый с БС3. То же протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченый белок, представляющий интерес и характеризуют его физиологических партнеров по связыванию.
В последние годы технология Стрептококковое-тег стал широко используемым во многих областях биомедицинских исследований, в том числе протеомики и структурной биологии. Эта технология очистки белка, которая опирается на слияние рекомбинантных белков на короткий пептид Стрептококковое-тега, созрел с появлением сродства матриц, несущих Strep-Tactin, генетически модифицированного варианта стрептавидином с улучшенной пептид-связывающей способности. 1, 2 Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной Стрептококковое-теги или SIII-тег, проявляют высокое сродство к Стрептококковое-Tactin матриц, чем те, которые содержат только один Strep-тег, обеспечивая более эффективную очистку рекомбинантных белков и связанные с ними связывающие партнеры. Тем не менее, более высокое сродство твин-Стрептококковое-меченых белков Strep-Tactin также имеет свою оборотную сторону. Конкурентная вымывание таких белков с избыточным биотина может быть неполным, что приводит к снижению выход белка целевой. Мруда эффективной альтернативой является элюирование SDS, но это приводит к нежелательному загрязнения образца с Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с протеомного анализа. Эта статья представляет собой технику, чтобы преодолеть это ограничение, сначала стабилизации смолы связью тетрамер стрептококкового-Tactin с помощью химической сшивки, а затем с помощью SDS для элюирования твин-Стрептококковое-тегом белки и связанные с ними комплексы из полученного сшитого полимера. Таким образом, достаточно выход белка может быть достигнуто без загрязнения образца с Strep-Tactin, тем самым позволяя дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.
Метод подходит для очистки любого рекомбинантного гибридного белка с поверхности, подвергшихся воздействию SIII-тега 3 или двумя-Strep-тега (последовательность аминокислот WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK и SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, соответственно). Белок может быть животного, растительного или бактериального происхождения и может быть выделен из клеток либо общийлизат или обогащенный органелл фракция. В качестве примера, мы описываем здесь очищение в SIII с метками белка ВПГ-Профи Картофель Virus A (ПВС) 4 от ядерной фракции ПВА-инфицированных Nicotiana benthamiana растений. Ядерный фракцию выделяли, как описано ранее 5, со следующими изменениями: клетки не были обработаны формальдегидом, бутират натрия замещенных во всех буферов 5 мМ фторида натрия, в комплекте ингибитор протеазы был замещен PMSF, Тритон Х-100 в концентрации добычи буфер # 2 был снижен до 0,3% (объем / объем) и ядерный осадок получали центрифугированием через сахарозы (экстракционный буфер # 3) ресуспендировали в 1,45 мл предварительно охлажденной буфером для связывания и вращают в течение 1,5 часов при 4 ° С. Полученную ядерный экстракт, содержащий SIII-меченого белка приманки и связанные комплексы (примеры приманка белка) обрабатывают в соответствии с протоколом, описанным ниже (см. раздел 2).
Данный протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченого приманки интерес белок и связанных комплексов в любом подходящем буфере, который не содержит биотин или сильные денатурирующих. В текущей версии протокола, связывание и стиральная выполняются в относительно ж?…
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем искреннюю благодарность за техническую поддержку Сини Миеттиненом, Минна Pöllänen и Тару Раутавеси. Мы благодарим Helka Nurkkala для обеспечения НЕК 293 клетки, экспрессирующие твин-Стрептококковое-меткой GFP и Пекка Evijärvi для обеспечения звукового оборудования записи. Эта работа финансировалась Академией Финляндии, предоставить номера 138329, 134684 и 258978.
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |