De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)
Summary
Se describe un método para la purificación eficiente de proteínas de fusión doble-Strep-etiquetados y sus complejos específicos sobre estreptavidina modificada (Strep-Tactin) de resina covalentemente reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). El método tiene las ventajas de velocidad rápida, buena recuperación proteína diana y alta pureza, y es compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas.
Abstract
La purificación por afinidad de proteínas de fusión Strep-etiquetados en resinas que llevan una estreptavidina de ingeniería (Strep-Tactin) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para el aislamiento de complejos de proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado doble-Strep-tag o SIII-etiqueta, tienen la ventaja de una mayor afinidad por Strep-Tactin en comparación con los que contienen sólo un único marcador Strep, permitiendo de este modo la purificación de proteínas más eficiente. Sin embargo, esta ventaja se ve compensada por el hecho de que la elución de las proteínas marcadas con doble Strep con biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la recuperación baja en proteínas. La recuperación se puede mejorar drásticamente mediante el uso de elución desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio (SDS), pero esto conduce a la contaminación de la muestra con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico de aguas abajo. Para superar esta limitación, se ha desarrollado un método por el cual tetrámero acoplado a la resina de Strep-Tactinprimero se estabiliza mediante la reticulación covalente con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) y la resina reticulada resultante se utiliza a continuación para purificar los complejos de proteína diana en una única etapa de purificación por lotes. Elución eficiente con SDS asegura una buena recuperación de proteína, mientras que la ausencia de contaminación de Strep-Tactin permite el análisis de proteínas aguas abajo por espectrometría de masas. Como una prueba de concepto, se describe aquí un protocolo para la purificación de la proteína viral SIII etiquetada VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectados por el virus benthamiana plantas utilizando la resina de polimetacrilato de Strep-Tactin reticulado con BS3. El mismo protocolo se puede utilizar para purificar cualquier proteína marcada-Strep-gemelo de interés y caracterizar sus parejas de unión fisiológicos.
Introduction
En los últimos años, la tecnología Strep-tag ha sido ampliamente utilizado en muchas áreas de la investigación biomédica, incluida la proteómica y la biología estructural. Esta tecnología de purificación de proteínas, que se basa en la fusión de proteínas recombinantes a un péptido Strep-tag corto, ha madurado con el advenimiento de matrices de afinidad que llevan Strep-Tactin, una variante modificada genéticamente de la estreptavidina con la mejora de la capacidad de unión al péptido. 1, 2 Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado twin-Strep-tag o SIII-tag, muestran una mayor afinidad por matrices Strep-Tactin que las que contienen sólo un único Strep-tag, asegurando la purificación más eficiente de las proteínas recombinantes y sus parejas de unión asociados. Sin embargo, la mayor afinidad de las proteínas marcadas con doble Strep a Strep-Tactin también tiene su lado negativo. Elución competitiva de estas proteínas con el exceso de biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la disminución de la producción de proteína objetivo. Una mmineral eficiente alternativa es elución con SDS, pero conduce a contaminación de la muestra no deseado con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico. Este trabajo presenta una técnica para superar esta limitación por primera estabilizar el tetrámero unido a resina de Strep-Tactin por entrecruzamiento químico y luego utilizando SDS para eluir proteínas etiquetadas-twin-Strep y sus complejos asociados de la resina reticulada resultante. Por lo tanto, suficiente rendimiento de proteína se puede lograr sin contaminación de la muestra con Strep-Tactin, permitiendo de este modo su posterior análisis por espectrometría de masas.
El método es adecuado para la purificación de cualquier proteína de fusión recombinante con una SIII-tag expuesto a la superficie 3 o twin-Strep-tag (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK y SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). La proteína puede ser de origen animal, vegetal o bacteriana y puede ser aislado a partir de ya sea total de célulaslisado o fracción enriquecida orgánulo. Como un ejemplo, se describe aquí la purificación de una proteína-SIII etiquetado VPg-Pro de la patata de virus A (PVA) 4 de la fracción nuclear de plantas de Nicotiana benthamiana infectadas por el PVA. La fracción nuclear se aisló tal como se describe anteriormente 5, con las siguientes modificaciones: las células no fueron tratados con formaldehído, butirato de sodio fue sustituido en todos los tampones con fluoruro de sodio 5 mM, inhibidor de proteasa completo fue sustituido con PMSF, Triton X-100 en la extracción de concentración tampón # 2 se redujo a 0,3% (v / v) y el sedimento nuclear obtenido por centrifugación a través de colchón de sacarosa (tampón de extracción # 3) se resuspendió en 1,45 ml de tampón de unión enfriado previamente y se hace girar durante 1,5 horas a 4 ° C. El extracto nuclear resultante que contiene la proteína cebo-etiquetados SIII y complejos asociados (muestra cebo de proteína) se procesó de acuerdo con el protocolo descrito a continuación (véase la sección 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior se puede utilizar para purificar cualquier proteína cebo de etiquetado de doble Strep de interés y sus complejos asociados en cualquier tampón adecuado que no contiene biotina o desnaturalizantes fuertes. En la versión actual del protocolo, de unión y lavado se llevan a cabo bajo condiciones relativamente estrictas en presencia de altas concentraciones de sal y detergente no iónico. Aunque esto da como resultado en menos de fondo, los complejos de proteínas frágiles pueden disociarse bajo e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo técnico de Sini Miettinen, Minna Pöllänen y Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para proporcionar células HEK 293 que expresan de etiquetado doble Strep GFP y Pekka Evijärvi para el suministro de equipos de grabación de sonido. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia, conceder los números 138329, 134684 y 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
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