Nanomanipulation af Single RNA-molekyler af Optisk Pincet

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

En stor del af det humane genom er transkriberet, men ikke oversat. I dette indlæg genomisk æra, har regulerende funktioner RNA vist sig at være stadig vigtigere. Da RNA-funktion ofte afhænger af dens evne til at vedtage alternative strukturer, er det vanskeligt at forudsige RNA tredimensionale strukturer direkte fra sekvens. Single-molekyle tilgange viser potentialer til at løse problemet af RNA strukturel polymorfi ved overvågning af molekylære strukturer et molekyle ad gangen. Dette arbejde viser en metode til præcist at manipulere foldning og struktur af enkelt RNA-molekyler, der anvender optiske pincet. For det første at metoder syntetisere molekyler er egnede til enkelt-molekyle mekanisk arbejde er beskrevet. Dernæst forskellige kalibreringsprocedurer at sikre en korrekt drift af den optiske pincet diskuteres. Dernæst forskellige eksperimenter forklaret. For at demonstrere anvendeligheden af ​​teknikken, resultaterne af mekanisk udfolder RNA hårnåle og en enkelt RNA kissing kompleks anvendes som bevismateriale. I disse eksempler blev nanomanipulation teknik, der anvendes til at undersøge foldning af hver strukturelle område, herunder sekundære og tertiære uafhængigt. Endelig er de begrænsninger og fremtidige anvendelser af metoden diskuteret.

Introduction

Udviklingen af ​​den optiske pincet teknik har længe været ledsaget af dens anvendelse i biologisk forskning. Når den optiske fældefangst effekt først blev opdaget, Arthur Ashkin observeret, at bakterier i forurenet vand kan være fanget på laseren fokus ^1. Siden da, fældefangst bakterier er blevet en utilsigtet, sjov eksperiment for generationer af biofysik studerende samt en seriøs forskning værktøj til at studere mikrobiel fysiologi ^2,3. Den optisk indfangning teknik bruger fokuseret laserstråle til at immobilisere en mikroskopisk objekt ^1. Næsten en laser fælde fungerer som en optisk fjeder, der også måler kraft (F) på den fanget objekt ved dets forskydning fra centrum af fælden (AX). Inden for en kort rækkevidde, F = κ x AX, i κ er fjederkonstanten af fælden. Den optiske fælde kan bruges til at lægge kræfter i piconewton (PN) præcision til en mikroerCopic objekt og måle dens position med nanometer (nm) nøjagtighed. I de seneste to årtier har optisk pincet blevet en af ​​de mest anvendte enkelt-molekyle teknikker i biofysik. Teknikken er blevet anvendt til at undersøge foldning og mekanik DNA ^4-6, RNA ^7-9, og proteiner ^10,11. Optiske pincetter er også blevet anvendt til at observere DNA-replikation ¹² RNA-transkription ¹³ og proteinsyntese ^14,15, såvel som mange andre biomolekylære arrangementer ^16-18.

Single-molekyle tilgange er ansat i RNA strukturel forskning primært at udforske den barske foldning energi landskab af RNA. En RNA-sekvens kan normalt foldes i flere stabile gensidigt udelukker strukturer, på grund af den simple kemiske sammensætning og base skrælle regler RNA. Det har længe været kendt, at RNA-strukturel polymorfi, såsom der forekommer i riboswitches ^19,20, spiller en vigtig rolle i genregulering. En recent genom-undersøgelse har vist, at temperaturvariationer så små som et par grader stor indflydelse struktur og protein syntese af en stor del af den cellulære transkriptomet ^21. Dette eksempel antyder, at den biologiske rolle alternativ RNA-foldning er måske vigtigere og gennemgribende end tidligere antaget. Strukturel polymorfi, udgør imidlertid en udfordring for de traditionelle biokemiske og biofysiske metoder, der undersøger gennemsnitlige egenskaber af mange molekyler. For eksempel "on" og "off" konformationer af en riboswitch gensidigt udelukker hinanden. Et gennemsnit struktur afledt fra heterogene strukturer er ikke sandsynligt, at ligne en af ​​de biologisk relevante konformere. Desuden utranslateret RNA og mRNA sædvanligvis strukturer. Deres interaktion med proteiner og regulatoriske RNA'er almindeligvis kræver udfoldelse af eksisterende struktur som en del af interaktionen. Derfor studerer RNA udfoldning / refoldning bliver et relevantudstedelse af RNA biologi. For at imødekomme en sådan udfordring er enkelt molekyle tilgang blevet anvendt til at optrævle RNA strukturel polymorfi ved at studere et molekyle ad gangen ^22-27.

I forhold til den populære single-molekyle fluorescens metode, pincet baseret mekanisk udfoldning giver en fordel, at konformationer af enkelte molekyler kan manipuleres ved påførte kraft og måles med nanometer præcision. Denne nanomanipulation kapacitet kan udnyttes til at overvåge udfoldning / foldning af individuelle strukturelle domæner sådan at den hierarkiske foldning af et stort RNA kan dissekeres ^28. Alternativt kan en enkelt streng rettes til at folde i en af ​​flere konformere; eller en eksisterende struktur mekanisk kan induceres til at foldes ind i en anden konformation ^29. Under biologiske betingelser, kan et RNA-struktur ændres ved temperaturændring eller ligandbinding. Evnen til direkte manipulere molekylære filtreSTRUKTUR åbner en ny mødested af RNA strukturel undersøgelse. I princippet andre mekaniske teknikker, såsom atomic force mikroskop og magnetiske pincet, kan også anvendes til at undersøge foldning af en enkelt RNA-molekyler. Imidlertid er sådanne ansøgninger stort set begrænset på grund af den relativt lave rumlig opløsning ^30.

Beskæftigelsen af ​​optiske pincet tillader RNA strukturer, som skal udfoldes ved mekanisk kraft.

Fordelen ved mekanisk udfoldning er adskillige gange. Kraft kan bruges til at udfolde både sekundære og tertiære strukturer, mens metalioner og liganden induceret foldning hovedsagelig er begrænset til tertiære strukturer. Temperatur og denatureringsmiddel kan have stor indflydelse aktiviteterne i vand og opløste stoffer. I modsætning hertil påføres lokalt kraft at forurolige molekylære strukturer; virkningen af ​​kraft på det omgivende miljø er ubetydelig. Desuden er termisk smeltning bedst anvendes til at undersøge folde termodynamik små RNA-strukturer,henviser optisk pincet er blevet brugt til at studere RNA strukturer med forskellige størrelser, der spænder fra en syv basepar tetraloop hårnål ²⁸ til et 400-nukleotid ribozym ^31. Endvidere kan RNA-strukturer mekanisk foldet ved mesofile temperaturer. I modsætning til at udfolde RNA'er i en termisk smeltende eksperiment, er temperaturen typisk hævet et godt stykke over fysiologiske temperaturer, hvilket øger RNA hydrolyse, især i nærværelse af Mg ^{2 +} ioner.

Det er vigtigt at bemærke, at den mekaniske effekt af kraft afhænger af, hvordan den anvendes på en struktur. Den påførte kraft vipper folde energi landskab. For eksempel, når kraft påføres en hårnål, baseparrene sekventielt brudt, en ad gangen (figur 1a). Ripping gaffel frem langs den spiralformede akse, som er vinkelret på den påførte kraft. I modsætning hertil, når en minimal kissing komplekset er under spænding, de to kissingbasepar, som er parallelle med den påførte kraft, deler kraftpåvirkning (figur 1b). De forskellige geometrier af hårnålen og kissing kompleks i forhold til den påførte kraft resulterer i deres forskellige mekaniske svar, som kan anvendes til at skelne mellem sekundær og tertiær foldning ^28,32. Den teoretiske del af mekanisk udfoldning tidligere er blevet revideret ^8,9,30. Dette arbejde omhandler de grundlæggende tilgange til at etablere og udføre en enkelt molekyle mekanisk udfoldelse assay.

Eksperimentel opsætning. I vores mekaniske trække eksperiment RNA-prøven til pincet består af RNA af interesse flankeret af to dobbeltstrengede DNA / RNA-håndtag (figur 2) ^7. Hele molekyle kan være bundet til to overfladebelagte micron størrelse perler (SPHEROTECH) via streptavidin-biotin og digoxigenin-anti-digoxigenin-antistof-interaktioner, hhv. En perle er i besiddelse af en kraft-måling af optisk trAP, mens den anden afholdes på spidsen af ​​en mikropipette. Den relative afstand mellem perlerne kan ændres ved enten at styre fælden eller flytning af mikropipetten. Med denne fremgangsmåde kan en enkelt RNA-molekyle tethering perlerne strækkes og afslappet.

Forberedelse af prøver. Syntesen af RNA-prøver til tweezing indeholder et par trin (Figur 3). Først er den DNA-sekvens, der svarer til RNA af interesse først klonet ind i en plasmidvektor. Desuden er der tre PCR-reaktioner udført for at generere de to håndtag og en skabelon for transkription. Den transskription skabelon omfatter håndtaget regionerne og de indsatte sekvenser. Den fulde længde RNA syntetiseres ved in vitro-transkription. Sidst, er RNA og kemisk modificerede håndtag glødede sammen for at generere molekyler pincet.

Kalibrering og drift af pincet. Det grundlæggende design af Minitweezers brugd i dette arbejde følger, at de dual-beam optisk pincet ^33. Med mange forbedringer, de Minitweezers vise ekstraordinær stabilitet i forhold til den første generation af optiske pincet. En række forskergrupper i flere lande bruger Minitweezers i deres single-molekyle forskning ^14,15,34-37. Detaljerne i byggeri, kalibrering og drift af enheden, herunder instruktionsvideoer, findes på "Pincet Lab" hjemmeside (http://tweezerslab.unipr.it). Her bliver forbedringer og kalibreringsprocedurer, der skal udføres på daglig baser beskrevet i detaljer.

Protocol

1. Fremstilling af RNA-molekyler til Single-molekyle Tweezing Kloning sekvensen af ​​interesse. Klone DNA-sekvens, der svarer til RNA-struktur i en vektor. Syntese og oprensning af transkription skabelon. Syntetisere en transskription skabelon ved PCR. [Sted tabel 1 her] Dernæst oprense PCR-produkter under anvendelse af et PCR-oprensningskit, og koncentrere prøven til> 200 ng / pl. Da det oprensede DNA anvendes til transkription bør RNase frit vand anvendes i elueringsbetingelserne og konc…

Representative Results

Begrænset af rummet, er nanomanipulation af enkelte RNA-molekyler demonstreret ved at vise kun mekaniske udfolder eksempler på RNA hårnåle og et RNA med tertiær struktur. Manipulere Single Hårnål Molekyler Når en tøjret etableres mellem perlerne, kan udvidelse og kraft tøjret manipuleres under anvendelse af et bruger-defineret protokol. Fire fælles manipulation protokoller er almindeligt anvendt. Kraft-…

Discussion

Ændring og fejlfinding i Udarbejdelse af pincet prøver

Valg af Kloning Vector. Selv om den generelle ordning beskrevet her (figur 3), ikke kræver en speciel kloningsvektor vektoren foretrukket ikke at have iboende T7 eller T3-promotor for at lette transskription sådan, at en promotor kan indføres via PCR ved ønskede positioner.

Sekvens og Længder af håndtagene. Der er ingen specifik sekvens krav om…

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D