Nanomanipulation av Single-RNA-molekyler med optisk pincett

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

En stor del av det mänskliga genomet transkriberas men översätts inte. I det här inlägget genomiska eran, har reglerande funktioner av RNA visat sig vara allt viktigare. Som RNA funktion beror ofta på dess förmåga att anta alternativa strukturer, är det svårt att förutsäga RNA tredimensionella strukturer direkt från sekvens. Single-molekyl närmar show potentialer för att lösa problemet av RNA strukturell polymorfism genom att övervaka molekylstrukturer en molekyl i taget. Detta arbete presenterar en metod för att exakt manipulera vikning och struktur av enskilda RNA-molekyler med användning av en optisk pincett. För det första att metoder syntetisera molekyler som är lämpliga för enda molekyl mekaniskt arbete beskrivs. Nästa, olika kalibreringsprocedurer för att säkerställa en väl verksamheten i optisk pincett diskuteras. Därefter olika experiment förklaras. För att demonstrera användbarheten av tekniken, resultat av mekaniskt utspelas RNA hårnålar och en enda RNA Kissing komplex används som bevis. I dessa exempel var den nanomanipulation teknik som används för att studera veckningen av varje strukturdomänen, inklusive sekundär och tertiär, oberoende av varandra. Slutligen är de begränsningar och framtida tillämpningar av metoden diskuteras.

Introduction

Utvecklingen av den optiska pincetten teknik har länge varit åtföljd med dess tillämpning inom biologisk forskning. När den optiska infångningseffekt först upptäcktes, konstaterade Arthur Ashkin att bakterier i förorenat vatten kan fastna vid laserfokus ^1. Sedan dess fångstmetoder bakterier har blivit en oavsiktlig, roliga experiment för generationer av biofysik studenter samt en seriös forskning verktyg för att studera mikrobiell fysiologi ^2,3. Den optiska fångst tekniken använder fokuserad laserstråle för att immobilisera en mikroskopisk objekt ^1. Praktiskt, en laser fälla fungerar som en optisk våren, som också mäter kraften (F) på fångade objektet genom dess förskjutning från mitten av fällan (AX). Inom en kort intervall, F = κ x AX, i κ är fjäderkonstanten i fällan. Den optiska fällan kan användas för att utöva kraft i picoNewton (PN) precision till en microsCOPIC-objekt och mäta sin position med nanometer (nm) noggrannhet. Under de senaste två decennierna har optisk pincett blivit en av de mest använda enda molekyl tekniker inom biofysik. Tekniken har använts för att studera vikning och mekanik av DNA ^4-6, RNA ^7-9, och proteiner ^10,11. Optiska pincetter har också använts för att observera DNA-replikation ^12, RNA-transkription ¹³ och proteinsyntes ^14,15, såväl som många andra biomolekylära händelser ^16-18.

Enda molekyl metoder används i RNA strukturell forskning främst för att utforska den oländiga fällbara energiområdet inför RNA. En RNA-sekvens kan oftast vika i flera stabila, ömsesidigt uteslutande strukturer, på grund av de enkla kemiska sammansättning och bas paring regler RNA. Det har länge varit känt att RNA strukturell polymorfism, såsom den som förekommer i riboswitches ^19,20, spelar en viktig roll i genreglering. En recent genomet hela undersökningen har visat att temperaturvariationer så liten som några grader kraftigt påverka struktur och proteinsyntes av en stor del av den cellulära transkriptom ^21. Detta exempel antyder att den biologiska rollen av alternativ RNA-veckning är kanske viktigare och genomträngande än tidigare antagits. Struktur polymorfism, dock innebär en utmaning för de traditionella biokemiska och biofysiska metoder, som tar upp de genomsnittliga egenskaperna hos många molekyler. Till exempel "på" och "off" konformationer av en riboswitch är ömsesidigt uteslutande. Ett genomsnitt struktur härrör från heterogena strukturer är inte troligt att likna något av biologiskt relevanta konforma. Dessutom oöversatt RNA och mRNA bildar oftast strukturer. Deras samspel med proteiner och regulatoriska RNA kräver ofta utspelas i befintlig struktur, som en del av interaktionen. Därför studerar RNA utspelas / återveck blir en relevantutfärdandet av RNA biologi. För att möta en sådan utmaning har enda molekyl tillvägagångssätt använts för att reda ut RNA strukturell polymorfism genom att studera en molekyl i taget ^22-27.

Jämfört med den populära enda molekyl fluorescens-metoden, pincett baserade mekanisk utspelas erbjuder en fördel att konformationer av enskilda molekyler kan manipuleras av applicerad kraft och mätas med nanometerprecision. Denna nanomanipulation förmåga kan utnyttjas för att övervaka den pågående / vikning av individuella strukturella domäner sådana att den hierarkiska vikning av ett stort RNA kan dissekeras ^28. Alternativt kan en enkel sträng vara inriktad på att vika in i en av flera konformerer; eller en befintlig struktur kan mekaniskt förmås att återvecka till en annan konforma ^29. Under biologiska förhållanden, kan en RNA-struktur ändras vid temperaturförändringar eller ligandbindning. Möjligheten att direkt manipulera molekylära sTRUKTUR öppnar en ny mötesplats för RNA strukturell studie. I princip andra mekaniska tekniker, såsom atomkraftsmikroskop och magnetiska pincett, kan också användas för att studera veckningen av enstaka RNA-molekyler. Dock är sådana ansökningar begränsas till stor del på grund av den relativt låga rumsupplösning ^30.

Anställning av optisk pincett gör RNA strukturer som skall vikas genom mekanisk kraft.

Fördelen med mekaniska utspelas är flerfaldigt. Force kan användas för att utvecklas både sekundära och tertiära strukturer, medan metalljoner och ligand inducerad vikning är huvudsakligen begränsade till tertiära strukturer. Temperatur och denatureringsmedel kan väsentligt påverka verksamheten i vatten och lösta ämnen. I motsats härtill är kraften som appliceras lokalt för att störa molekylära strukturer; effekten av kraften på den omgivande miljön är försumbar. Dessutom är värmesmält bäst används för att studera fällbara termodynamiken för små RNA-strukturer,medan optisk pincett har använts för att studera RNA-strukturer med olika storlekar, från en sju baspars tetraloop hårnål ²⁸ till en 400-nukleotid-ribozym ^31. Dessutom kan RNA-strukturer mekaniskt vikas vid mesofil temperatur. Däremot att veckla RNA i en termisk smältexperiment, är temperaturen normalt höjs långt över fysiologiska temperaturer, vilket avsevärt ökar RNA hydrolys, speciellt i närvaro av Mg ^{2 +} joner.

Det är viktigt att notera att den mekaniska effekten av kraft beror på hur den appliceras på en struktur. Den pålagda kraften lutar fällbara energilandskapet. Till exempel, när kraft anbringas på en hårnål, basparen är sekventiellt bruten, en i taget (Figur 1a). Den krusning gaffel skrider längs den spiralformade axeln, som är vinkelrät mot den anbringade kraften. Däremot när en minimal kissing komplex är under spänning, det två kissingbaspar, som är parallell med den pålagda kraften, dela kraften last (figur 1b). De olika geometrier av hårnålen och kyss komplex i förhållande till den anbringade kraften resultatet i deras olika mekanisk respons, som kan utnyttjas för att särskilja sekundär och tertiär vikning ^28,32. Den teoretiska aspekten av mekanisk utspelas har tidigare granskats ^8,9,30. Detta arbete beskriver de grundläggande metoder för att ställa upp och utföra en enda molekyl mekanisk utspelas analys.

Experimentell Setup. I vår mekanisk dragning experiment RNA-provet för tweezing består av RNA av intresse flankerad av två dubbelsträngade DNA / RNA-handtag (figur 2) ^7. Hela molekylen kan bindas till två ytbelagda micron stora kulor (Spherotech) via streptavidin-biotin och digoxigenin-anti-digoxigenin interaktioner antikropp, respektive. En pärla hålls av en kraftmätning optisk trap, medan den andra hålls på spetsen av en mikropipett. Det relativa avståndet mellan pärlorna kan ändras genom att antingen styra den fällan eller flytta mikropipetten. Med hjälp av denna metod kan en enda RNA-molekyl tjudra pärlorna sträckas och avslappnad.

Framställning av prover. Syntesen av RNA-prover för tweezing innehåller några steg (Figur 3). För det första är den DNA-sekvens som motsvarar det RNA av intresse först klonas in i en plasmidvektor. Därefter tre PCR-reaktioner utfördes för att generera de två handtagen och en mall för transkription. Transkriptionen mall omfattar handtaget regionerna och de insatta sekvenserna. Fullängds-RNA syntetiseras genom transkription in vitro. Slutligen är RNA och kemiskt modifierade handtag glödgas tillsammans för att skapa molekyler för tweezing.

Kalibrering och användning av pincett. Den grundläggande designen av Minitweezers användningd i detta arbete följer att de dubbla balk optisk pincett ^33. Med många förbättringar, de Minitweezers visa extra stabilitet jämfört med första generationen optisk pincett. Flera forskargrupper i flera länder använder Minitweezers i deras enda molekyl forskning ^14,15,34-37. Detaljerna i konstruktionen, kalibrering och drift av enheten, inklusive instruktionsvideor, finns på "pincett Lab" hemsida (http://tweezerslab.unipr.it). Här är förbättringar och kalibreringsprocedurer som behöver utföras på daglig basis beskrivs i detalj.

Protocol

1 Beredning av RNA-molekyler för enda molekyl Tweezing Kloning av sekvensen av intresse. Klona den DNA-sekvens som motsvarar det RNA struktur i en vektor. Syntes och rening av transkriptions mall. Syntetisera en transkriptionsmall med PCR. [Ort tabell 1 här] Därefter rena PCR-produkter med hjälp av en PCR-rening kit, och koncentrera provet till> 200 ng / l. Eftersom det renade DNA används för transkription, bör RNas fritt vatten användas i eluerings-och koncentrationssteg. I…

Representative Results

Begränsad av rymden, är nanomanipulation av enstaka RNA-molekyler demonstreras genom att visa endast mekaniska utspelas exempel på RNA hårnålar och en RNA med tertiär struktur. Manipulera Enkel hårnål Molekyler När ett tjuder är etablerad mellan pärlorna, kan förlängning av och kraft tjudret manipuleras med användning av en användardefinierad protokoll. Fyra vanliga manipulationsprotokoll är vanligt förekommande. <p class="jo…

Discussion

Modifiering och felsökning i framställning av tweezing prover

Val av kloningsvektor. Även om den allmänna ordningen som beskrivs här (figur 3) inte kräver en speciell kloningsvektor är vektorn föredraget att inte ha inneboende T7 eller T3-promotorn för den lätthet av transkription så att en promotor kan införas via PCR vid önskade positioner.

Sekvens och längder av handtagen. Det finns ingen …

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D