Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
精子是相当独特的之间的细胞类型。虽然产生于睾丸,既核基因的转录和翻译被关闭一次预光标圆形细胞开始伸长和分化成什么形态识别为精子。然而,精子是很不成熟,没有能力的蠕动或卵子的认可。这两个事件的发生,一旦精子中转称为附睾一二级机构。在〜12天通道,它需要一个精子细胞穿过附睾,现有蛋白质的翻译后修饰发挥细胞的成熟中发挥关键作用。这样的一个主要方面是蛋白质的磷酸化。为了表征磷酸化事件中精子成熟发生,无论纯的精子细胞群和预分馏磷酸的必须建立。使用反冲技术,一种用于纯精子Ò隔离从远端或尾部附睾F高品质和产量概述。的步骤为溶解,消化和预分馏通过TiO 2的亲和层析精子磷酸肽进行说明。一旦分离,磷酸可注入的MS中的精子的成熟过程,以确定在特定的氨基酸残基都蛋白质磷酸化事件和量化的磷酸发生的水平。
从睾丸已经出现,精子是高度分化又显着,这些细胞是未成熟1,2。因此,它们缺乏完整的功能,包括游泳的能力,并结合到卵母细胞3。虽然精子细胞的进一步成熟是必需的,这无法通过典型途径发生,因为在此阶段的细胞分化的过程中,它们是不能的基因转录和进一步蛋白质生物合成4。生物的能力是赋予精子,因为它们离开睾丸和进入被称为附睾5男性生殖系统的一部分。附睾是一个紧密盘绕,高度分化的管连接所述输出小管(睾丸)输精管和存在于所有雄性哺乳动物6。精子在附睾血统逐步收购其受精能力,依靠不断变化的环境,鲁米那是CR由本地附睾上皮细胞7 eated。存在于附睾环境行为的各种分泌和再吸收的活动来修改精子本身,改变它的蛋白质,碳水化合物和脂质组合物6。附睾的重要性,尤其是最初的“人均”这个结构的地区已经采用手术结扎技术8被例证。精子通过传出神经导管结扎睾丸内保留完全缺乏任何身份受精的卵母细胞9-11。
除了附睾环境内的精子功信号转导通路对翻译后修改现有的精子细胞的补充。例如,从附睾的早期区域精子显示不同的蛋白质磷酸化模式相比,这些后者的区域5,12。这并不奇怪,因为在C巨大差异apability来自这些地区的精子。例如,精子从早期,附睾头都immotilite。与此相反,精子细胞从马尾区域将经受向前一旦放置在等渗介质渐进运动。由于附睾精子细胞是不能脱从头蛋白质生物合成,所有的固有途径调节精子功能必须通过翻译后修饰(PTM)。因此,按理说,蛋白质组学,特别是翻译后修饰,如磷酸化的调查必须是一个主要的推力,如果我们要了解精子细胞成熟。
另一种方法以从epididymidies获得精子使用复古反冲13-16。虽然这种技术是肯定比较费时,由操作者需要更大程度的技术人员,对精子获得一致表明纯度超过99.99%。此外,不同于所有其它技术,精子CAN为分离处于静止状态,使得能够研究如何精子活力被启动。样品制备是用于蛋白组学分析中最重要的方面,精子隔离已成为精子蛋白质组学研究中最重要的方面之一。该协议提供了有关如何从精子马尾附睾被隔离的解释。在此之后,在TiO 2磷酸富集过程概述,关于如何从高度分化的精子细胞中提取的肽的具体参考。该MS的方法可以用来区分改变磷酸如果一个人尾附睾精子在一种状态比较(immotile或非获能)到另一个(能动,获能,顶体反应等)使之成为一个有效的方法来研究的精子功能。
对于精子的一个成功的和可重复的蛋白质组分析的关键步骤是:1)纯度的原料; 2)去除多余的盐和洗涤剂; 3)变性蛋白,以它们的全部范围,以使胰蛋白酶消化高收率蛋白和4)最小化的处理,以减少肽的损失样品。
为了成功地反冲马尾附睾,有必要确定从精子将退出区域。在大鼠和小鼠中的情况下,这是在所述凹区域的顶点,在附睾的尾部区域的中间(参见图2A)。如果有进一步的来向输精管,反冲更容易,成功率一般较高。然而,这是以精子数的损失。可替代地,如果一个人试图移动至更近侧到语料库,那么压力的量所需的精子推回通过epididym人管往往是如此之高,是破坏附睾不可避免地发生。
传统上执行使用水饱和的矿物油和作为介质在注射器本身平衡盐溶液以除去精子22-25附睾的反冲。这两个程序都是潜在的问题LC-MS的。首先,矿物很可能会阻止必须采取这样没有结转过程中的纳米C18纳米列基本上都是采用的全球蛋白质组学分析和护理。如果发生这种情况,就不可能继续并将样品实质上丢失。这可以通过使用BWW或在注射器的其他平衡盐溶液,然而来克服,这虽然是成功的,我们很快认识到,许多所述精子成为能动只要BWW溶液开始接触,并与尾附睾混合细胞。为了解决这个问题,我们简单地反冲与空气的精子。不仅是资格赛精子两者均媲美的基于液体的方法,但该数量是相同的。
磷酸化蛋白质组学也许是确定哪些信号通路是发生在精子后射精的唯一途径之一。一个我们正在调查的主要途径是获能的过程。精子必须经过“获能”才能够结合到一个鸡蛋。在实践中,这是通过孵育精子一段时间基本实现(;大鼠1.5小时;小鼠40分钟人类3-24小时)与血清白蛋白BWW溶液。以前,我们和其他人已经表明对参与获能几个激酶的作用。兴趣的,缺失的PKA的μII产生的小鼠的精子游动自发体外 ,但不能经受过度活化26。后者是获能的标志,由此精子改变其泳图案从高速,低幅度,以一低速度,高振幅摆动频率。我们已经表明参与这一过程的下游激酶包括PP60-中国证监会(SRC)13,27 C-是28和C-ABL 14。有趣的是,抑制SRC的停止获能依赖的酪氨酸磷酸化13。然而,这可以用冈田酸来克服,这表明SRC不直接参与在一般性发病酪氨酸磷酸29的,但可以调节磷酸酶29。使用BWW作为介质,迫使精子出附睾的问题是,一旦被激活,小鼠精子只需要大约40分钟,以与能力。鉴于精子隔离可能需要5分钟/小鼠和常数小鼠在实验中使用,那么精子将到期的在实验开始时的不同阶段。为了克服这个,空气压力可用于从尾附睾精子推入玻璃套管。不仅所有的精子INACT香港专业教育学院和基本上如它们将在尾环境中找到,它使得有可能比较非能动和能动磷酸化蛋白质组学。
样品处理对于磷酸化蛋白质组学应在两个不同的功能状态进行比较的精子时被保持在最低限度。以上蛋白质沉淀1)的其他传统方法使用甲醇氯仿降低需要额外的洗涤步骤,2)去除盐和脂肪的几乎所有痕量和3)具有经过验证的能力超过TCA 19以沉淀低丰度的蛋白质。前胰蛋白酶消化的蛋白质沉淀,建议因为这不仅有助于变性蛋白(其有助于胰蛋白酶消化),但除去许多在MS-不相容代谢产物存在于细胞内的。
精子磷酸的比较可以以多种方式来完成。在基层,所识别的磷酸肽的一个样本的简单比较,以在另一在被称为“谱计数”的过程中采样可以做到的。但是批评一直处于这种方法主要是因为早期的蛋白质组学研究用低重复(对于更详细的讨论参见Lundren 等 30)。一个更复杂的方法是看该肽母体质量的强度,并与其它样品(无标记的比较)进行比较。在图4所示的例子中,肽不存在于来自非能动( 图4上部),但目前在游动( 图4下)精子从M / Z 650-670可以看出。这个过程中,被称为基于MS的标签免费量化是一个无标记的战略。
常用来降低所需蛋白质的定量运行的量的另一种策略是使用同位素。作为同位素的质量是不同的,质谱仪可以用来比较ELUT的强度荷兰国际集团肽。然而,与大多数其它细胞类型,某些同位素标记不能适用于精子。例如,通过添加稳定同位素(1重同位素被添加到一个样品,而较轻的版本被添加到另一个)可在组织培养物中使用。当同位素得到并入蛋白,蛋白组学分析可以通过组合两个样品(复用)进行。然而,在精子的情况下,这不能做,仅仅凭借的一个事实,即1)同位素标记需要几个通道(最多8个)在组织培养和2)的精子细胞不具有核基因的转录和翻译,因此,他们不能纳入同位素其所有的蛋白质而已。解决这个的一种方式是订购放射性标记的小鼠,但是,这些是众所周知的昂贵。另一种方法是使用一种化学标记。当非获能小鼠用获能的小鼠相比,这已经完成。在这种情况下,A D 0以及D <sub> 3 -label用一个样品和另一个在质谱仪31之间进行区分。其他方法可以包括使用的iTRAQ(等压标记相对和绝对定量),由此赖氨酸被化学不同质量同位素标记的; ICAT(同位素编码的亲和标签),由此半胱氨酸标记有不同质量的同位素和重链和轻水标记。
在每一个情况,但是,有一点必须牢记。该MS仅报告什么是存在于样品中,而这是发生在该样品到这一点,一切的反映。最小化的样品处理,同时最大限度地提高产量在每一步是必要的一个成功的蛋白质组学分析。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |