Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Spermatozoer er helt unikke blandt celletyper. Selv produceret i testiklerne, er både transkription og translation kernegen slukket når pre-cursor runde celle begynder at langstrakt og differentiere i, hvad der morfologisk anerkendt som en sædcelle. Men sædcelle er meget umodne, ikke har nogen mulighed for motilitet eller æg anerkendelse. Begge disse begivenheder opstår, når sædcellerne transit en sekundær organ kaldet bitestiklen. Under ~ 12 dage passage, det tager for en sædcelle at passere gennem bitestiklen, post-translationelle modifikationer af eksisterende proteiner spiller en afgørende rolle i modningen af cellen. En vigtig facet af sådan proteinphosphorylering. For at karakterisere phosphorylering begivenheder, der finder sted i løbet af sæd modning, skal der etableres både rene sperm celle populationer og præ-fraktionering af phosphopeptider. Brug tilbage rødmen teknikker, en fremgangsmåde til isolering af ren spermatozoer of høj kvalitet og udbytte fra den distale eller kaudale bitestikler er skitseret. Trinene til solubilisering, fordøjelsen, og præ-fraktionering af sperm phosphopeptider gennem TiO2 affinitetskromatografi forklares. Når isolerede, kan phosphopeptider injiceres i MS for at identificere begge proteinphosphoryleringsbegivenheder om specifikke aminosyrerester og kvantificere niveauet af phosphorylering finder sted i løbet af sædmodning processer.
Efter at have kommet ud af testiklerne, er spermatozoer stærkt differentieret endnu bemærkelsesværdigt, disse celler er umodne 1,2. Som sådan, de mangler komplet funktionalitet, herunder evnen til at svømme og binder til en oocyt 3. Selv om yderligere modning af sædcellen er påkrævet, kan dette ikke ske via kanoniske ruter, da der på dette stadium af deres celledifferentiering proces, er de ude af stand til gentranskription og yderligere proteinbiosyntese 4. Biologisk kompetence tillægges spermatozoer, som de forlader testiklerne og indtaste en del af det mandlige reproduktive system kaldet epididymis 5. Epididymis er en tæt oprullet, meget differentieret røret, der forbinder de efferente kanalerne (i testikler) til sædlederen og er til stede i alle mandlige pattedyr 6. Spermatozoer gradvist erhverve deres befrugtende potentiale under epididymalt afstamning, bygger på den evigt skiftende luminale miljø, som er crprettet af de lokale epididymale epitelceller 7. De forskellige sekretoriske og re-absorberende aktiviteter stede i epididymal milieu handling at ændre selve sæd, ændrer dets protein, kulhydrat og lipid sammensætning 6. Betydningen af bitestiklen, især den første "caput 'region af denne struktur er blevet eksemplificeret ved anvendelse af kirurgiske ligeringsteknikker 8. Spermatozoer tilbageholdt i testiklerne af efferente kanal ligering er helt mangler i enhver kapacitet til at befrugte ægget 9-11.
Ud over epididymal miljø, signaltransduktionsveje i spermatozoerne arbejde posttranslationelt modificere eksisterende sædcellen komplement. For eksempel spermatozoer fra de tidlige regioner epididymis vise forskellige mønstre af proteinphosphorylering forhold til sidstnævnte regioner 5,12. Dette er ikke overraskende, da der er store forskelle i Capability af sæd fra disse regioner. Eksempelvis spermatozoer fra begyndelsen, caput epididymis er immotilite. I modsætning hertil vil sædceller fra cauda region undergår fremad progressiv motilitet gang anbragt i isotonisk medium. Da epididymal sædceller er ude af stand de-novo proteinbiosyntese skal alle de iboende veje regulerer sperm funktion være gennem post-translationelle modifikationer (PTM). Derfor er det indlysende, at proteomics, og navnlig undersøgelse af PTMS såsom phosphorylering skal være en større fremstød, hvis vi skal forstå sædceller modning.
En alternativ metode til at opnå spermatozoer fra epididymidies at bruge retro-returskylning 13-16. Selv om denne teknik er helt sikkert mere tidskrævende og tager en større grad af dygtighed af operatøren, sædcellerne opnåede konsekvent demonstrere renhed på over 99,99%. Derudover, i modsætning til alle de andre teknikker, spermatozoer CAn isoleres i en hvilende tilstand, der gør det muligt at undersøge, hvordan spermamotilitet påbegyndes. Prøveforberedelse er det vigtigste aspekt for proteomanalyse er isolation af spermatozoer blevet en af de vigtigste aspekter af sperm-proteomiske studier. Denne protokol giver en forklaring på, hvordan spermatozoer er isoleret fra cauda epididymis. Efter dette, er TiO2 phosphopeptid berigelse procedure skitseret, med særlig henvisning til, hvordan man kan udtrække peptider fra de meget differentierede sædceller. Kan bruges MS metode til at skelne skiftende phosphopeptider hvis man sammenligner den caudale epididymal spermatozoer i én stat (kun er ubevægelige sædceller eller ikke-kapacitetsbegrænsninger) til en anden (bevægelige, kapacitetsbegrænsninger, acrosom reagerede, etc.) gøre dette til en stærk tilgang til at studere sperm funktion.
De kritiske trin for en vellykket og reproducerbar proteomanalyse af spermatozoer er: 1) renhed af udgangsmaterialet; 2) fjernelse af uønskede salte og rengøringsmidler; 3) denaturering proteiner i deres fulde udstrækning, således at trypsin at fordøje et højt udbytte af proteiner og 4) minimerer håndtering af prøver for at reducere tab af peptid.
For at kunne tilbageskylning cauda epididymis, er det vigtigt at finde det område, hvorfra spermatozoerne vil afslutte. I tilfælde af både rotter og mus, er på toppen af den konkave område i midten af den kaudale område af epididymis (se figur 2A). Hvis man kommer videre mod sædlederen, tilbageskylning er lettere og succesraten er generelt højere. Men dette kommer på tabet af antallet af sædceller. Alternativt, hvis man forsøger at bevæge sig mere proximalt til corpus, så det krævede tryk for at skubbe spermatozoer tilbage gennem epididymal kanaler er ofte så høj, at skader på epididymis uundgåeligt opstår.
Tilbageskylning af epididymis traditionelt udført under anvendelse af vandmættet mineralolie og en balanceret saltopløsning i sprøjten selv som et medium for at fjerne spermatozoerne 22-25. Begge procedurer er potentielt problematiske af LC-MS. For det første mineral sandsynligvis blokere nano-C18 nano-kolonner, der grundlæggende anvendes verden over for proteomisk analyse og skal man være omhyggelig, så ingen bliver fremføres i proceduren. Hvis dette sker, er det umuligt at fortsætte, og prøven væsentlige tabt. Dette kan overvindes ved anvendelse af BWW eller andre balancerede saltopløsninger i sprøjten, men selv om dette er en succes, vi snart erkendt, at mange af spermatozoer blive motile så snart BWW opløsning kom i kontakt og blandes med den kaudale epididymal celler. For at omgå dette problem, vi simpelthen backflush spermatozoerne med luft. Ikke kun er Quality af spermatozoer sammenlignes med væskebaserede metoder, men mængden er identiske.
Fosfoproteom er måske et af de eneste måder at aftale, hvilke signalveje finder sted i sædceller efter ejakulation. En af de store veje Vi undersøger er processen kapacitation. Sædceller skal gennemgå "kapacitation", før det er i stand til at binde til et æg. I praksis opnås dette stort set ved inkubering spermatozoer for en periode (mus 40 min; rotte 1,5 time humant 3-24 timer) i BWW opløsning med serumalbumin. Tidligere har vi og andre vist en rolle for flere kinaser involveret i kapacitation. Af interesse, sletning af PKA μ II producerer mus hvis spermatozoer svømme spontant in vitro, men kan ikke undergå hyperaktivering 26. Sidstnævnte er kendetegnende for kapacitation, hvorved spermatozoer ændre deres svømning mønster fra en høj hastighed, lav amplitude, til en lavhastighed, høj amplitude slå frekvens. Vi har vist downstream kinaser er involveret i denne proces, omfatter pp60-CSRC (SRC) 13,27 C-ja 28 og C-ABL 14. Interessant hæmning af SRC stopper kapacitation afhængig tyrosinphosphorylering 13. Dog kan dette overvindes med okadainsyre, tyder på, at SRC ikke er direkte involveret i den generelle indtræden af tyrosinphosphorylering 29, men kan regulere en phosphatase 29. Problemet med at bruge BWW som et medium til at tvinge spermatozoer fra epididymis er, at når aktiveret, mus spermatozoer kun tage cirka 40 minutter at capacitate. Eftersom isolation af spermatozoer kan tage 5 min / mus og ofte flere mus anvendes i et eksperiment, så spermatozoer vil være på forskellige stadier af modenhed ved begyndelsen af eksperimentet. For at overvinde dette kan lufttryk anvendes til at skubbe spermatozoer fra den kaudale epididymis i et glas kanyle. Ikke alene er alle sperm Inaktivive og væsentlige som de ville findes i caudale miljø, det gør det muligt at sammenligne ikke-bevægelige og bevægelige fosfoproteom.
Prøvehåndtering for fosfoproteom bør holdes på et minimum, når man sammenligner spermatozoer i to forskellige funktionelle tilstande. Brugen af methanol chloroform i forhold til andre traditionelle metoder til proteinudfældning 1) reducerer behovet for ekstra vasketrin, 2) fjerner næsten alle spor af salte og fedtstoffer og 3) har en dokumenteret evne til at udfælde lav hyppighed proteiner i TCA 19. Anbefales Protein nedbør før trypsinfordøjelse da Dette er ikke blot med til at denaturere protein (som hjælper trypsinfordøjelse), men fjerner mange af de MS-stridige metabolitter er til stede i cellen.
Sammenligningen af sædceller phosphopeptider kan gøres på en række måder. På det grundlæggende niveau, en simpel sammenligning af de identificerede phosphopeptid i én prøve, som i en andenprøve i den såkaldte "spektral optælling" kan gøres. Men kritik har været på denne tilgang dybest set fordi tidlige proteomiske undersøgelser brugte lave gentagelser (for en mere fuldstændig diskussion se Lundren et al. 30). En mere raffineret fremgangsmåde er at se på intensiteten af peptidet forælder masse og sammenligne dette med de andre prøver (label-free sammenligning). I den i figur 4 viste eksempel kan et peptid fraværende fra fra ikke-motile (figur 4 øverst), men er til stede i motile (figur 4 nederst) spermatozoer fra m / z 650-670 ses. Denne proces, der omtales som MS-baserede label fri kvantificering er en etiket-fri strategi.
En alternativ strategi er almindeligt anvendt til at reducere mængden af kørsler, der kræves for proteomisk kvantificering er at bruge isotoper. Som massen af en isotop er forskellige, kan massespektrometer anvendes til at sammenligne intensiteterne af eluting peptider. Men i modsætning til de fleste andre celletyper, kan ikke anvendes nogle isotopmærkning spermatozoer. For eksempel tilsætning af stabile isotoper (en tung isotop bliver tilføjet til en prøve, mens en lettere version bliver føjet til en anden) kan anvendes i vævskultur. Når isotoper gå inkorporeres i proteinet, kan en proteomics analyse udføres ved at kombinere de to prøver (multiplexing). Men i tilfælde af spermatozoer, kan dette ikke ske, blot på grund af det faktum, at 1) isotopmærkning kræver flere passager (op til 8) i vævskultur og 2) sædcellerne har ingen transkription og translation nukleare gen og dermed de kan ikke optage isotoper i alle deres protein alligevel. En måde omkring dette er at bestille radioaktivt mærkede mus, men disse er notorisk dyre. En alternativ metode er at anvende en kemisk tag. Dette er blevet gjort, når ikke-kapacitetsbegrænsninger mus blev sammenlignet med kapacitetsbegrænsninger mus. I dette tilfælde en D 0 og D <sub> 3 -mærket blev anvendt til at skelne mellem en prøve og en anden i massespektrometeret 31. Andre fremgangsmåder kan omfatte anvendelse af iTRAQ (isobare tag for relativ og absolut kvantificering), hvorved lysiner mærkes kemisk med forskellige masse isotoper; ICAT (isotop kodet affinitetsmærke), hvorved cysteiner er mærket med forskellige masse isotoper og tunge og lette mærkning vand.
I hvert enkelt tilfælde, men en ting skal holdes for øje. MS kun rapporterer, hvad der er til stede i en prøve, og det er en afspejling af alt, hvad der er sket for at prøve indtil da. Minimering prøvehåndtering samtidig maksimere udbyttet på hvert trin er nødvendige for en vellykket proteomisk analyse.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |