Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Spermatozoa zijn uniek onder celtypen. Hoewel geproduceerd in de testis, zowel nucleaire gen transcriptie en translatie worden uitgeschakeld zodra de pre-cursor ronde cel begint te verlengen en te differentiëren in wat morfologisch erkend als een zaadcel. Echter, de zaadcel zeer onrijp, zonder mogelijkheid voor motiliteit of eieren herkenning. Beide gebeurtenissen zich voordoen zodra de spermatozoa doorvoer een secundaire orgel bekend als de bijbal. Tijdens de ~ 12 dagen passage dat het duurt voor een zaadcel om door de bijbal passeren, post-translationele modificaties van bestaande eiwitten spelen een centrale rol in de rijping van de cel. Een belangrijk facet van dergelijke is eiwitfosforylatie. Om fosforylering gebeurtenissen tijdens spermarijping karakteriseren moeten zowel zuivere zaadcel populaties en pre-fractionering van fosfopeptiden worden vastgesteld. Met terugspoeling technieken, een methode voor het isoleren van zuivere spermatozoa of hoge kwaliteit en opbrengst van de distale of caudale epididymides wordt geschetst. De stappen voor solubilisatie, spijsvertering en pre-fractionering van sperma fosfopeptiden via TiO2 affiniteitschromatografie toegelicht. Eenmaal geïsoleerd, kan fosfopeptiden worden geïnjecteerd in MS zowel proteïne fosforylatie gebeurtenissen van specifieke aminozuurresiduen de niveaus van fosforylatie plaatsvindt tijdens de spermarijping processen te identificeren en te kwantificeren.
Na voortgekomen uit de testis worden spermatozoa gedifferentieerde nog opmerkelijk, deze cellen onvolwassen 1,2. Als zodanig zijn ze missen complete functionaliteit, zoals de mogelijkheid om te zwemmen en binden aan een oöcyt 3. Hoewel verdere rijping van de zaadcel vereist, kan deze niet plaatsvinden via canonieke routes, aangezien in deze fase van hun mobiele differentiatieproces, ze niet in staat zijn gentranscriptie en andere eiwit biosynthese 4. Biologische bevoegdheid aan spermatozoa verleend zij de testis verlaten en een deel van het mannelijke voortplantingssysteem zogenaamde bijbal 5. De bijbal is een strak opgerolde, zeer gedifferentieerde buis die de efferente leidingen (van de testis) wordt aangesloten op de zaadleider en is aanwezig in alle mannelijke zoogdieren 6 is. Spermatozoa geleidelijk tijdens epididymaire afdaling hun bemesten potentieel te verwerven, met een beroep op de steeds veranderende luminale omgeving die crat 's avonds door de lokale epididymaire epitheelcellen 7. De diverse secretoire en re-absorberende activiteiten aanwezig in de epididymis milieu handeling aan het sperma zelf te wijzigen, zijn eiwitten, koolhydraten en lipiden 6 veranderen. Het belang van de epididymis, meer bepaald de aanvankelijke 'caput' gebied van deze structuur is geïllustreerd middels chirurgische ligatie technieken 8. Spermatozoa behouden binnen de testis door efferente duct ligatie worden volledig ontbreekt in welke hoedanigheid om de eicel te bevruchten 9-11.
Naast de epididymis milieu, signaaltransductieroutes in de spermatozoa werk post-translationeel de bestaande zaadcel complement wijzigen. Bijvoorbeeld spermatozoa van de vroege regio van de bijbal tonen verschillende patronen eiwit fosforylering vergeleken met die laatste regio 5,12. Dit is niet verrassend aangezien er grote verschillen in de capability van het sperma van deze regio's. Bijvoorbeeld, spermatozoa uit het begin, caput bijbal zijn immotilite. Daarentegen zal zaadcellen de cauda regio vooruit vertonen progressieve beweeglijkheid eenmaal geplaatst in isotoon medium. Aangezien epididymale zaadcellen in staat de-novo proteïne biosynthese, moeten alle intrinsieke routes reguleren spermafunctie worden door post-translationele modificaties (PTM). Daarom ligt het voor dat proteomics redeneren, en in het bijzonder het onderzoek van PTMs zoals fosforylering een speerpunt moeten zijn als we zijn om sperma celrijping begrijpen.
Een alternatieve methode om spermatozoa te verkrijgen van de epididymidies gebruik retro-terugspoelen 13-16. Hoewel deze techniek is zeker tijdrovend en draait grotere actie van de operator, de spermatozoa verkregen vaste tonen zuiverheid van meer dan 99,99%. In tegenstelling tot alle andere technieken, spermatozoa can afzonderlijk in een rusttoestand, waardoor het mogelijk om te bestuderen hoe spermamotiliteit geïnitieerd. Als monster voorbereiding is het belangrijkste aspect voor proteoomanalyses isolatie van spermatozoa is uitgegroeid tot één van de belangrijkste aspecten van het sperma-proteomics studies. Dit protocol geeft een uitleg over hoe spermatozoa worden geïsoleerd van de cauda epididymis. Hierna wordt de TiO 2 fosfopeptide verrijkingsprocedure geschetst, met een specifieke verwijzing over hoe peptiden te extraheren uit de zeer gedifferentieerde zaadcellen. De MS benadering kan worden aan veranderende fosfopeptiden onderscheiden wanneer men de caudale epididymis spermatozoa vergelijken op een toestand (immotile of niet capacitated) naar een andere (beweeglijke, capacitated, acrosome gereageerd, etc.) waardoor dit een krachtige aanpak om sperma te bestuderen functie.
De kritische stappen voor een succesvolle en reproduceerbare proteoomanalyse van spermatozoa zijn: 1) de zuiverheid van het uitgangsmateriaal; 2) het verwijderen van ongewenste zouten en wasmiddelen; 3) denatureren eiwitten volle omvang zodat de trypsine om een hoge opbrengst van eiwitten verteren en 4) het minimaliseren monsterbehandeling verlies van peptide verminderen.
Om met succes Backflushing de cauda epididymis, is het essentieel om het gebied waar de spermatozoa verlaat vinden. Bij zowel ratten en muizen, dit is op de top van het concave gebied, in het midden van het caudale deel van de bijbal (zie figuur 2A). Als men gaat verder in de richting van de zaadleider, terugspoelen is makkelijker en het slagingspercentage is over het algemeen hoger. Echter, dit gaat ten verlies van het aantal zaadcellen. Alternatief, als men probeert meer proximaal naar het corpus, dan de hoeveelheid druk vereist om de spermatozoa terug duwen door de epididymAl kanalen is vaak zo groot, dat schade aan de bijbal onvermijdelijk optreedt.
Backflushing van de bijbal wordt traditioneel uitgevoerd met behulp van water verzadigd minerale olie en een gebalanceerde zoutoplossing in de spuit zichzelf als een medium om de spermatozoa 22-25 verwijderen. Beide procedures zijn potentieel problematische van LC-MS. Ten eerste minerale wil de nano-C18 nano-kolommen die in principe wereldwijd gebruikt voor proteoomanalyse en zorg moet worden genomen, zodat er geen voorwaarts in de procedure plaatsvindt blokkeren. Wanneer dit gebeurt, is het onmogelijk worden en het monster in wezen verloren. Dit kan worden ondervangen door het gebruik van BWW of andere gebalanceerde zoutoplossingen in de spuit, maar hoewel dit succes, al snel onderkend dat veel van de spermatozoa worden beweeglijke zodra de BWW oplossing in contact kwam en gemengd met de caudale epididymis cellen. Om dit probleem te omzeilen we gewoon Backflush de spermatozoa met lucht. Niet alleen is de Qualheid van spermatozoa vergelijkbaar is met vloeistof gebaseerde methoden, maar de hoeveelheid is identiek.
Phosphoproteomics is misschien wel een van de weinige manieren om vast te stellen welke signaalwegen die zich in spermatozoa na de ejaculatie. Eén van de belangrijkste wegen onderzoeken we het proces capacitation. Spermatozoa moet ondergaan "capacitation" voordat het kan binden aan een ei. In de praktijk wordt dit in principe bereikt door incubatie spermatozoa voor een tijdsduur (muizen 40 min; rat 1,5 uur; menselijk 3-24 uur) in BWW oplossing serumalbumine. Eerder wij en anderen hebben aangetoond een rol voor verschillende kinasen betrokken capacitation. Van belang, schrapping van de PKA μ II produceren muizen waarvan de spermatozoa zwemmen spontaan in vitro, maar kan hyperactivation 26 niet te ondergaan. De laatste is een kenmerk van capacitation waarbij spermatozoa veranderen zwemmen patroon van een hoge snelheid, lage amplitude, een lagesnelheid, hoge amplitude verslaan frequentie. We hebben laten zien stroomafwaarts kinases betrokken bij dit proces zijn onder pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 en c-ABL 14. Interessant remming van SRC stopt capacitation-afhankelijke tyrosine fosforylatie 13. Dit kan echter worden overwonnen met okadazuur, suggereert dat SRC is niet direct betrokken bij de algemene begin van tyrosinefosforylering 29 maar kan een fosfatase 29 reguleren. Het probleem met het gebruik BWW als een medium om spermatozoa te dwingen uit de bijbal is dat eenmaal geactiveerd, muis spermatozoa slechts ongeveer 40 min naar capacitate. Omdat isolatie van spermatozoa 5 min / muis en vaak meerdere muizen bij een proef kan nemen, dan spermatozoa wordt in verschillende stadia van rijpheid het begin van het experiment. Om dit te overwinnen, kan luchtdruk worden gebruikt om de spermatozoa uit de caudale bijbal duwen in een glas canule. Niet alleen zijn de zaadcellen Inactive voornamelijk als ze worden gevonden in de caudale milieu, het maakt het mogelijk om niet-beweeglijke en beweeglijke phosphoproteomics vergelijken.
Steekproef hanteren voor phosphoproteomics moet worden tot een minimum beperkt bij het vergelijken van spermatozoa in twee verschillende functionele toestanden. Het gebruik van methanol chloroform boven andere traditionele methoden van eiwitprecipitatie 1) neemt de noodzaak van extra stappen wassen, 2) verwijdert nagenoeg alle sporen van zouten en vetten en 3) een bewezen vermogen lage abundantie proteïnen te precipiteren via TCA 19. Eiwitprecipitatie voor trypsine digestie wordt aanbevolen aangezien niet alleen werkt dit eiwit (dat trypsine digestie hulp) denatureren, maar verwijdert veel van de MS-incompatibele metabolieten in de cel aanwezig.
De vergelijking van sperma fosfopeptiden kan op een aantal manieren. Op basisniveau Een vergelijking van de geïdentificeerde fosfopeptiden in een monster, dat in een anderemonster in het proces dat bekend staat als "spectrale tellen" kan worden gedaan. Maar de kritiek is geweest op deze aanpak voornamelijk omdat vroege proteomics studies werden met behulp van lage herhalingen (Voor een nadere bespreking zie Lundren et al. 30). Een meer verfijnde aanpak is te kijken naar de intensiteit van de peptide ouder massa en vergelijk dit met de andere monsters (label-free vergelijking). In het in figuur 4 kan bijvoorbeeld een peptide afwezig in de uit onbeweeglijk (figuur 4 boven), maar in de beweeglijke (figuur 4 onder) spermatozoa van m / z 650-670 zichtbaar. Dit proces, aangeduid als MS-gebaseerde label vrij kwantificering is een label vrij strategie.
Een alternatieve strategie vaak gebruikt om de hoeveelheid runs nodig proteomische kwantificering verminderen is isotopen gebruiken. Aangezien de massa van een isotoop verschillend kan de massa spectrometer worden gebruikt om de intensiteit van de Elut vergelijkening peptiden. Anders dan de meeste andere celtypes, wat isotopische labeling kan niet worden toegepast op spermatozoa. Bijvoorbeeld, de toevoeging van stabiele isotopen (een zware isotoop wordt toegevoegd aan een monster, terwijl een lichtere versie wordt toegevoegd aan de andere) kan in weefselkweek. Wanneer de isotopen te opgenomen in het eiwit kan een proteomics analyse worden uitgevoerd door combineren van de twee monsters (multiplexing). Echter in het geval van spermatozoa, kan dit niet worden gedaan, louter op grond van het feit dat 1) isotopen vereist aantal passages (tot 8) in weefselkweek en 2) de zaadcellen geen nucleaire gentranscriptie en translatie en dus ze kunnen niet de isotopen in al hun eiwitten op te nemen toch. Een manier om dit is om radioactief gelabelde muizen te bestellen, maar deze zijn berucht duur. Een alternatieve benadering is om een chemische tag. Dit werd gedaan wanneer niet capacitated muizen werden vergeleken met capacitated muizen. In dit geval, een D 0 en D <sub> 3 -label werd gebruikt om onderscheid te maken tussen een monster en een andere in de massaspectrometer 31. Andere benaderingen omvatten het gebruik van iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificatie), waarbij lysinen chemisch gelabeld met verschillende massa isotopen; iCAT (isotoop gecodeerd affiniteitsmerker) waarbij cysteinen zijn gelabeld met verschillende massa isotopen en zware en lichte water etikettering.
In elk geval echter één ding moet in gedachten worden gehouden. De MS rapporteert alleen wat in een monster aanwezig is, en dit is een weerspiegeling van alles wat er is gebeurd met dat monster tot op dat punt. Minimaliseren monsterbehandeling terwijl maximale opbrengst bij elke stap is noodzakelijk om een succesvolle proteoomanalyse.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |