Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
精子は、細胞型の中で非常にユニークです。精巣で生産さが、事前カーソル円形細胞が細長く、形態学的に精子と認識されているものに分化し始めると、核遺伝子の転写と翻訳の両方がオフになります。しかし、精子は運動性や卵認識のための能力を有していない、非常に未熟である。これらのイベントの両方が一度精子トランジット精巣上体として知られている二次臓器を発生する。精子細胞は、精巣上体を通過するのにかかる〜12日経過時に、既存のタンパク質の翻訳後修飾は、細胞の成熟に重要な役割を果たしている。このように一つの主要な面は、タンパク質のリン酸化である。精子成熟の間に起こるリン酸化事象を特徴づけるために、純粋な精子細胞集団およびホスホペプチドのプレ分画の両方が確立されなければならない。フラッシング法、純粋な精子oの単離のための方法を使用してバック遠位または尾側精巣上体からF高品質と歩留まりが概説されている。可溶化、消化、及びTiO 2アフィニティークロマトグラフィーを経て精子ホスホペプチドの前分画のための手順が説明されている。単離されると、ホスホペプチドは、特定のアミノ酸残基が両方のタンパク質リン酸化事象を識別し、精子成熟過程の間に起こるリン酸化のレベルを定量するためにMSに注入することができる。
精巣から現れた、精子がまだ非常に顕著に区別され、これらの細胞は、1,2-未熟である。そのようなものとして、それらは泳ぐ卵母3に結合する能力を含む完全な機能性を欠いている。精子細胞のさらなる成熟が必要であるが、それらの細胞分化過程のこの段階で、それらは、遺伝子転写、さらにタンパク質生合成4ことができないので、これは、標準的な経路を介して起こることができない。彼らは精巣を離れて、精巣上体5として知られる男性生殖器系の一部を入力するなどの生物学的能力は、精子に付与されている。精巣上体は、輸精管に(精巣の)遠心性ダクトを接続し、すべての男性の哺乳類6に存在しているしっかりとコイル状、高度に差別化された管である。精子は徐々にCRで刻々と変化する管腔環境に依存して、精巣上体の降下中に彼らの受精の可能性を獲得地元の精巣上体上皮細胞7によってeated。精巣上体環境の行為に存在する様々な分泌および再吸収性の活動はそのタンパク質、炭水化物と脂質組成物6を変え、精子自体を変更します。精巣上体の重要性、特にこの構造体の初期の「頭」領域は、外科的なライゲーション技術8を用いて例示されている。輸出管結紮によって、精巣内に保持精子が完全に卵母細胞9-11を受精するためにどんな能力に欠けている。
精巣上体の環境に加えて、精子の作業内シグナル伝達経路は、翻訳ポスト既存の精子細胞の補体を変更する。例えば、精巣上体の初期領域からの精子は、これらの後者の地域5,12に比べてタンパク質リン酸化の異なるパターンを表示する。 C言語で広大な違いがあるので、これは驚くべきことではないこれらの地域からの精子のapability。たとえば、初期の、頭の精巣上体から精子がimmotiliteです。対照的に、尾部領域から精子細胞を前方回等張媒体中に置かれた前進運動を受ける。精巣上体精子細胞は、 デノボタンパク質生合成することができないので、精子の機能を調節するすべての本質的な経路は、翻訳後修飾(PTM)を介してでなければなりません。それゆえ、そのプロテオミクスを理にかなって、私たちは精子細胞の成熟を理解するのであれば、特にリン酸化などののPTMの調査は、主要な推進力である必要があります。
別の方法は、13-16レトロバックフラッシュを使用するepididymidiesから精子を得る。この技術は、確かに多くの時間がかかり、オペレータによる熟練度が大きくかかりますが、一貫して得られた精子は、99.99%を超える純度を示す。加えて、すべての他の技術とは異なり、精子CAnは、それが可能な精子の運動が開始されるかを研究すること、静止状態で単離する。試料調製は、プロテオーム解析のための最も重要な側面であるため、精子の単離は、精子プロテオミクス研究の最も重要な側面の一つとなっている。このプロトコルは、精子が精巣上体尾から分離されている方法について説明しています。これに続いて、TiO 2のリン酸化ペプチドの濃縮手順は、高度に分化した精子細胞からペプチドを抽出する方法についての具体的な参照して、概説する。 MSアプローチは(運動性、受精能、先体は、等を反応させた)精子を研究するために、この強力なアプローチをする1を別の状態(不動または非受精能)で尾側精巣上体精子を比較した場合に変化リン酸化ペプチドを区別するために使用することができます機能。
精子の成功と再現性のプロテオーム解析のための重要なステップは次のとおりです。出発物質の1)純度。 2)不要な塩および界面活性剤の除去;トリプシンはタンパク質の高収量を消化することを可能にするように、3)その最大限にタンパク質を変性し、4)ペプチドの損失を低減するためにサンプル処理を最小限に抑える。
成功した精巣上体尾をバックフラッシュするためには、精子が終了し、そこから領域を見つけることが不可欠である。ラットおよびマウスの両方の場合、これは、精巣上体尾部領域の中央部( 図2A参照 )、凹面領域の頂点である。一つは輸精管に向かってさらに付属している場合、バックフラッシュは簡単で、成功率は一般的に高いです。しかし、これは精子数の損失に来る。一つはコーパスより近位に移動しようとした場合あるいは、その後圧力の量はepididym通って精子を押し出すために必要アルダクトは、精巣上体への損傷が必然的に発生していると、しばしば非常に高いです。
精巣上体のバックフラッシュは、伝統的に精子22-25を除去するための媒体として、注射器自体に水飽和鉱油及び平衡塩溶液を用いて行われる。両方の手順は、LC-MSの潜在的に問題である。第一に、ミネラルは、そのどれもが手順に持ち越されないように注意する必要があり、基本的プロテオーム解析とケアのための世界中で使用されているナノC18ナノの列をブロックする可能性がある。これが発生した場合は、継続することは不可能であり、サンプルは、本質的に失われる。これは、これが成功したものの、我々はすぐにBWW液が接触したとすぐに精子の多くは、運動性になることを認識し、尾精巣上体と混合し、しかしBWWまたはシリンジ内の他の平衡塩類溶液を使用することによって克服することができる細胞。この問題を回避するために、我々は単に空気と精子をバックフラッシュ。だけでなく、QUALです液体ベースの方法に匹敵する精子のITYが、量は同じである。
Phosphoproteomicsは、おそらくシグナル伝達経路は、精子のポスト射精で発生している確立するための唯一の方法の一つです。私たちが調査している主要な経路の一つは、受精能のプロセスです。それが卵に結合することができる前に精子が「能」を受けなければならない。実際には、これは、一定の期間精子をインキュベートすることによって基本的に達成される(マウス40分、1.5時間、ラット;ヒト3-24時間)血清アルブミンBWW溶液に。以前、我々は、他の受精能に関与するいくつかのキナーゼの役割を示している。興味深いのは、精子を試験管内で自然発生的に泳ぐが、過剰活性26を受けることができないPKAμII農産物マウスの削除。後者は、精子が低いと、高速、低振幅から自分の遊泳パターンを変更することにより、受精能の特徴である速度、高振幅、周波数を破った。我々は、このプロセスに関与する下流のキナーゼのpp60-CSRC(SRC)を含んで示されている13,27のc-はい28およびc-ABL 14。興味深いことに、SRCの阻害は能依存チロシンリン酸化13を停止します。しかし、これは、SRCを直接チロシンリン酸化29の一般的な発症に関与していないが、ホスファターゼ29を調節し得ることを示唆し、オカダ酸を克服することができる。精巣上体から精子を強制的に媒体としてBWWを使用する際の問題は、一旦活性化され、マウスの精子のみcapacitateに約40分かかるである。精子の単離は5分/マウスをとることができ、多くの場合、いくつかのマウスを実験に使用されていることを考慮すると、精子は、実験の開始時に成熟の異なる段階であろう。これを克服するために、空気圧がガラスカニューレに尾精巣上体の精子をプッシュするために使用することができる。だけでなく、すべての精子INACTですアイブと本質的にそれらが尾環境に見られるように、それは、非運動性と運動性phosphoproteomicsを比較することが可能となる。
二つの異なる機能状態で精子を比較するときphosphoproteomicsためのサンプル処理は最小限に保たれるべきである。タンパク質沈殿1)の他の従来の方法を超えるメタノールクロロホルムの使用は、2)塩および脂肪のほとんどすべての痕跡を除去し、3)TCA 19を介して少量のタンパク質を沈殿させるための実証済みの能力を有する、余分な洗浄工程の必要性を減少させる。 (トリプシン消化を助ける)、タンパク質を変性させるためにこのヘルプを行いますが、細胞内に存在するMS-互換性の代謝物の多くが削除されていないだけので、事前のトリプシン消化に対するタンパク質沈殿をお勧めします。
精子ホスホペプチドの比較は多くの方法で行うことができる。別のものと基本的なレベル、1サンプル中の特定されリン酸化ペプチドの単純な比較、時「スペクトルカウント」として知られるプロセスでサンプルを行うことができる。初期のプロテオミクス研究は低いの複製を使用していたので批判は基本的に、このアプローチにされている(充実した議論のためLundren ら 30を参照)。より洗練されたアプローチは、ペプチド、親質量の強度を見て、他のサンプル(ラベルのない比較)でこれを比較することである。 図4に示す例では、m / zが650〜から非運動性から( 図4の上面)には存在しないが、運動中に存在するペプチド( 図4下)精子を見ることができる。 MSに基づくラベルフリー定量化とも呼ばれるこのプロセスは、無標識戦略である。
一般的プロテオミクス定量化するために必要な実験の量を減少させるために使用される代替の戦略は、同位体を使用することである。同位体の質量が異なるように、質量分析計はELUTの強度を比較することができるるペプチド。しかし、ほとんどの他の細胞型とは異なり、いくつかの同位体標識は、精子には適用できない。例えば、安定同位体(軽量版が他に追加されながらつの重同位体は、一つのサンプルに追加される)の添加は、組織培養に用いることができる。同位体は、タンパク質に組み込まれ始めるとき、プロテオミクス分析は、2つのサンプル(多重化)を組み合わせることにより行うことができる。しかし、精子の場合には、これは)は、単に1)同位体標識は、組織培養および2)8まで(いくつかの通路を必要とするという事実によって、行うことができない精子細胞は、全く核遺伝子の転写および翻訳を持たず、従って彼らはとにかくすべてのタンパク質に同位体を組み込むことができません。これを回避する一つの方法は、しかし、これらは悪名高く高価で、放射性標識したマウスを注文することです。別のアプローチは、化学タグを使用することである。非受精能マウスは受精能のマウスと比較したときに行われている。この場合、D 0およびDで<sub> 3 -labelは、質量分析計31における一つのサンプルと他とを区別するために使用された。他のアプローチは、リシンが異なる質量同位体と化学的に標識されていることにより、例えばiTRAQ(相対的および絶対的定量のための同重体タグ)の使用を含むことができる。 ICAT(同位体コード親和性タグ)システインが異なる質量同位体および重および軽水のラベルで標識される。
それぞれ、すべての場合において、しかし、一つのことを念頭に置いておく必要がある。 MSは唯一の試料中に存在するものを報告し、これは、その時点までそのサンプルに起こったすべてのものを反映している。各ステップでの収率を最大にしながら、試料の取り扱いを最小限に抑えることが成功したプロテオーム解析のために必要である。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |