Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
정자는 세포 유형의 사이에 매우 독특합니다. 고환에서 생산하지만 사전 커서 라운드 셀 연장과 형태 학적으로 정자로 인식되고 무엇으로 분화하기 시작하면, 모두 핵 유전자 전사 및 번역이 꺼져 있습니다. 그러나, 정자 운동성 또는 계란에 대한 인식 능력을 갖지 않는, 매우 미성숙하다. 이들 이벤트 모두 정자 통과되면 부고환으로 알려진 보조 기관을 발생한다. 정자 세포 부고환 통과 걸리는 ~ 십이일 통로 중에 존재하는 단백질의 번역 후 변형은 세포의 성숙에 중추적 역할을한다. 그러한 하나의 중요한면은 단백질 인산화이다. 정자 성숙 중에 일어나는 인산화를 특성화하기 위하여, 순수한 정자 세포 집단 및 포스 포 사전 분획 모두 확립되어야한다. 순수한 오 정자의 분리를 위해, 방법을 플러싱 기술을 다시 사용말단 또는 꼬리 epididymides에서 F 높은 품질과 수율이 설명되어 있습니다. 가용화, 소화 및 이산화 티탄 친 화성 크로마토 그래피를 통해 정자 포스 포의 사전 분류하는 단계는 설명한다. 격리되면, 유기 인산 화합물은 정자 성숙 과정에서 일어나는 인산화 수준을 특정 아미노산 잔기에 모두 단백질 인산화를 식별하고 정량화하기 위해 MS에 주입 될 수있다.
고환에서 등장하는 데, 정자는 매우 아직 현저하게 차별화된다,이 세포는 1, 2 미숙. 이와 같이, 이들은 3 개의 난자 헤엄 능력 인드 포함한 완전한 기능이 부족하다. 정자 세포의 성숙이 더 필요하지만 그들의 세포 분화 과정이 단계들은 유전자 전사와 상기 단백질 생합성 4 없게되어 있기 때문에, 이것은 표준적인 경로를 통해 이루어질 수 없다. 그들은 정소두고 부고환 5라고도 남성 생식 기관의 일부를 입력 생물학적 능력이 정자에게 부여된다. 부고환은 정관에 (고환) 원심성 덕트를 연결하고 모든 남성 포유 동물 6에 존재 단단히 코일, 차별화 된 관입니다. 정자는 점진적으로 CR은 끊임없이 변화하는 내강 환경에 의존, 부고환 하강하는 동안 그들의 시비 가능성을 취득로컬 부고환 상피 세포 7 어갈. 부고환 환경의 행동에 존재하는 다양한 분비 및 재 흡수 활동은 단백질, 탄수화물 및 지질 성분 (6)을 변경, 정자 자체를 수정합니다. 이러한 구성의 특히 초기 'CAPUT'영역 부고환의 중요성은, 외과 용 결찰 기법을 이용하여 8 예로 들었다. 원심성 덕트 결찰에 의해 고환 내에서 유지 정자는 완전히 난자 9-11을 비옥하게하기 위해 어떤 능력이 부족합니다.
부고환 환경에 더하여, 정자 워크 내 신호 전달 경로는 전기 – 병진 기존 정자 세포 보충을 수정한다. 예를 들어, 부고환 초기 영역에서 정자 이러한 후자의 영역 -5,12- 비해 단백질 인산화의 다른 패턴을 표시. C 광대 차이가 있기 때문에 이는 놀랍지 않다이 지역에서 정자의 apability. 예를 들어, 초기의, 부고환 CAPUT 정자는 immotilite이다. 대조적으로, 카우 영역으로부터 정자 앞으로 한번 등장 매질에 배치 프로그레시브 운동성을 받게 될 것이다. 부고환 정자 세포가 드 노보 단백질 생합성 능력이 있기 때문에, 정자의 기능을 조절하는 모든 고유 경로는 번역 후 변형 (PTM)를 통해해야합니다. 따라서, 그 단백질 체학을 당연한, 우리는 정자 세포 성숙을 이해하는 경우 특히 이러한 인산화 등 PTMS의 조사는 큰 추력을해야합니다.
다른 방법은 13 ~ 16 복고풍 백 플러싱 사용 epididymidies에서 정자를 얻을 수있다. 이 기술은 확실히 더 많은 시간이 소모되며 조작자의 지식을 가진 큰 정도 소요되지만, 정충 일관 99.99 % 이상의 순도를 입증 수득. 또한, 모든 다른 기술과는 달리, 정자의 CAN 가능 정자 운동성이 개시되는 방법 공부하게 정지 상태로 단리 할. 샘플 준비가 단백질체 분석에 가장 중요한 측면이므로, 정자의 분리 정자 프로테오믹스 연구의 가장 중요한 측면 중 하나가되고있다. 이 프로토콜은 카우의 부고환에서 분리하는 방법 정자에 대한 설명을 제공합니다. 이어서, 형성된 티오 포스 포이 농축 과정은 고도로 분화 된 세포로부터 정자 펩티드를 추출하는 방법에 대한 참조로, 개략되어있다. MS 접근법은 하나 하나의 상태에 꼬리 부고환 정자과 비교한다면 변화 포스 포를 구별하는데 사용될 수있다 (immotile 또는 비 capacitated) 정자 공부이에게 강력한 접근 방식을 (등 반응 운동성 capacitated, 첨체) 다른 기능.
정자의 성공 재현 단백질체 분석을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 출발 물질의 1) 순도; 원치 않는 염 및 세제의 2) 제거; 트립신은 단백질의 높은 수율을 소화 할 수 있도록하기 위하여 3) 그들의 전체 범위로 단백질을 변성 및 4) 펩티드의 손실을 줄이기 위해 처리 샘플을 최소화한다.
성공적 카우의 부고환 역류하기 위해서는, 정충 종료되는 사이의 영역을 찾는 것이 필수적이다. 랫트와 마우스 모두의 경우에, 이것은 부고환 꼬리 영역의 중앙에 (도 2A 참조), 오목 영역의 정점이다. 하나 정관 향해 더 오면 역세가 용이하고 성공 확률이 높다. 그러나, 이것은 정자 번호 손실 온다. 하나 이상의 코퍼스 근위 이동하려고 낸다면 압력의 양은 epididym 통해 다시 밀어 정자 필요알 덕트는 부고환에 손상이 필연적으로 발생, 종종 너무 높다.
부고환 역세 전통적 정자 22-25을 제거하기 위해 물을 포화 광유 매체로서 주사기 자체 평형 염 용액을 사용하여 수행된다. 두 절차는 LC-MS의 잠재적 문제가있다. 첫째, 미네랄은 그 어느 것도 절차에 이월되지 않도록주의해야한다 기본적으로 프로테옴 분석 및 관리에 전 세계적으로 사용되는 나노 C18 나노 열을 차단하는 것입니다. 이 경우, 그것은 계속 불가능하고 샘플을 본질적으로 손실된다. 이것은이 성공적이지만, 조만간 BWW 용액을 접촉한지 마자 정자 많은 운동성되어 있다고 인식하고, 꼬리 부고환 혼합 그러나 BWW 또는 주사기 다른 균형 염 용액의 사용에 의해 극복 될 수있다 세포. 이 문제를 회피하기 위해 우리는 단순히 공기와 정자를 백 플러시. 뿐만 아니라이다 QUAL액체 기반의 방법에 필적 정자의 성만하지만, 양이 동일하다.
Phosphoproteomics 아마도 신호 전달 경로가 정자 포스트 사정에서 발생되는 확립 할 수있는 유일한 방법 중 하나입니다. 우리가 조사중인 주요 경로 중 하나는 capacitation하는 과정입니다. 이 난자에 결합 할 전에 정자는 "capacitation"을 거쳐야. 실제로, 이는 시간 동안 인큐베이션하여 정자 기본적으로 달성된다 (랫트에서 1.5 시간, 40 분 마우스 인간 3-24 시간) 혈청 알부민 용액 BWW. 이전에, 우리와 다른 capacitation에 관련된 여러 키나제의 역할을 보여 주었다. 관심, PKA의 삭제 II는 누구의 정자를 체외에서 자발적으로 수영 마우스를 생산하지만, hyperactivation (26)를받을 수 없습니다 μ. 후자는 정자가 낮은, 높은 속도, 낮은 진폭에서 자신의 수영 패턴을 변경함으로써, capacitation의 특징이다속도, 높은 진폭은 주파수를 이겼다. 우리는이 과정에 참여 다운 스트림 키나제가 pp60-CSRC (SRC)를 포함 보여 주었다 13,27 C-예 (28)와 C-ABL (14). 흥미롭게도, SRC의 억제는 capacitation에 의존하는 티로신 인산화 (13)를 중지합니다. 그러나, 이는 SRC 직접 티로신 인산화 (29)의 일반적인 발병에 관여하지 않고, 29 포스파타제 조절할 수 있음을 시사 okadaic 산으로 극복 될 수있다. 부고환에서 정자를 강제로 매체로 BWW 사용에 문제는 한 번 활성화, 마우스 정자 만 …의 자격을 주다 약 40 분 소요됩니다. 정자의 분리가 5 분 / 마우스와 종종 여러 생쥐 실험에서 사용되는 걸릴 수 있음을 감안할 때, 다음 정자 실험의 시작 성숙의 다른 단계에있을 것입니다. 이것을 극복하기 위해, 공기 압력은 유리로 꼬리 정맥에서 부고환 정자 푸시 할 수있다. 뿐만 아니라 모든 정자 INACT 있습니다필자 그들이 꼬리 환경에서 발견되는 바와 본질적으로, 그것이 가능 운동성 및 운동성 phosphoproteomics과 비교한다.
두 개의 상이한 기능에 정자 상태를 비교할 때 phosphoproteomics 핸들링 샘플을 최소로 유지되어야한다. 단백질 침전 1)의 다른 전통적인 방법에 비해 메탄올의 클로로포름을 사용하는 2) 염 및 지방의 거의 모든 흔적을 제거하고 3) TCA (19) 위에 낮은 풍부한 단백질을 침전 입증 된 능력을 가지고, 추가적인 세척 단계에 대한 필요성을 감소시킨다. 트립신 소화하기 전에 단백질 침전 단백질 (트립신 에이즈 소화하는) 변성이 도움을 수행하지만 세포에 존재하는 MS와 호환되지 않는 대사 산물의 대부분을 제거뿐만 아니라 이후 좋습니다.
정자 포스 포의 비교는 다수의 방식으로 수행 될 수있다. 다른 것과의 기본 레벨, 하나의 샘플에서의 포스 포 식별 단순 비교에서"스펙트럼 계수"로 알려진 과정에서 샘플은 행해질 수있다. 초기 단백질체 연구는 낮은 복제물을 사용하고 있기 때문에 비판은 기본적으로이 방법에있다 (풀러 논의 Lundren 등. 30 참조). 더 정교한 접근은 펩티드 모 질량의 강도를보고, 다른 샘플 (라벨없는 비교 예)와이를 비교하는 것이다. 도 4에 도시 된 예에서, m / z 650-670에서 운동성에서 (도 4 위)로부터 존재하지만 운동성 존재 펩티드 (도 4 하단) 정자는 알 수있다. MS 기반의 라벨없는 정량화라고도이 프로세스는, 라벨없는 전략이다.
일반적 단백체 실행에 필요한 정량의 양을 감소시키기 위해 사용 들여서는 동위 원소를 사용하는 것이다. 동위 원소의 질량이 다르므로, 질량 분석기는 엘 루트의 세기를 비교하기 위해 사용될 수있다펩티드를 보내고. 그러나, 대부분의 다른 세포 유형과 달리, 일부 동위 원소 표지는 정자 적용 할 수 없다. 조직 배양에 사용될 수있는 예를 들면, 안정 동위 원소를 첨가 (버전이 다른 점화기에 첨가되는 동안 하나의 무거운 동위 원소, 하나의 샘플에 더해진다). 동위 원소가 혼입 된 단백질 얻을 때, 단백질 체학 분석은 두 샘플 (다중화)을 조합함으로써 수행 될 수있다. 그러나 정자의 경우, 이는, 1) 동위 원소 표지가 조직 배양에서 (~ 8)까지 여러 통로를 필요로하며, 2) 정자 세포가없고 따라서 핵 유전자 전사와 번역이없고, 단순히 사실 덕분에, 수행 할 수없는 어쨌든 그들은 모든 단백질에 동위 원소를 포함 할 수 없습니다. 이 주위에 한 가지 방법은 방사성 동위 원소를 마우스를 주문하는 것입니다, 그러나, 이러한 악명 비싸다. 대안적인 접근은 화학적 태그를 사용하는 것이다. 이 비 capacitated 마우스를 capacitated 마우스와 비교했을 때 수행되었습니다. 이 경우, D와 D 0에서 <sub> 3 -label이 질량 분석기 (31)과 다른 하나의 샘플을 구별하기 위해 사용되었다. 다른 접근 방법은 라이신이 다른 질량 동위 원소와 화학적으로 표시되어있다 iTRAQ (상대 및 절대 정량 압법 태그)의 사용을 포함 할 수있다; 시스테인이 다른 질량 동위 원소 무거운 빛 물 라벨에 표시되어있다 스패 터 주입 및 분사기 TMS-VI (동위 원소 코딩 선호도 태그).
각각의 모든 경우에, 그러나, 한가지 명심해야한다. MS는 샘플에 존재하는 것을보고, 이것은 그 시점에 그 샘플까지 일어난 모든 것을 반영한다. 각 단계에서의 수율을 최대화하는 동안 시료 처리를 최소화하는 것이 성공적인 프로테옴 분석을 위해 필요하다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |