Summary
Sykdomsfremkallende mutasjoner i aktin kan endre cytoskeletal funksjon. Cytoskeletal dynamikk kvantifiseres gjennom avbildning av fluorescently merkede proteiner ved hjelp av total intern fluorescens mikroskopi. Som et eksempel har cytoskeletal protein, Aip1p, endret lokalisering og bevegelse i cellene som uttrykker mutant aktin isoform, R256H.
Abstract
Mutasjoner i aktin forårsake en rekke menneskelige sykdommer som skyldes spesifikke molekylære forandringer som ofte endrer cytoskeletal funksjon. I denne studien, avbildning av fluorescently tagget proteiner ved hjelp av total intern fluorescens (TIRF) mikroskopi brukes til å visualisere og kvantifisere endringer i cytoskeletal dynamikk. TIRF mikroskopi og ved bruk av fluorescerende koder gir også mulighet for kvantifisering av endringer i cytoskeletal dynamikk skyldes mutasjoner i aktin. Ved hjelp av denne teknikken, kvantifisering av cytoskeletal funksjon i levende celler valuably utfyller in vitro studier av protein funksjon. Som et eksempel, har missense mutasjoner som påvirker aktin residuum R256 blitt identifisert i tre humane aktin-isoformer som tyder på denne aminosyre spiller en viktig rolle i regulerings interaksjoner. Effektene av aktin mutasjon R256H på cytoskeletal bevegelser ble undersøkt ved hjelp av gjær modell. Proteinet, Aip1, som er kjent for å bistå cofilin i aktin depolymerisering, varmerket med grønt fluorescerende protein (GFP) ved N-terminus og sporet in vivo ved hjelp av TIRF mikroskopi. Frekvensen av Aip1p bevegelse i både villtype-og mutante stammer ble kvantifisert. I celler som uttrykker R256H mutant aktin, er Aip1p bevegelse begrenset og frekvensen av bevegelsen er nesten halvparten av hastigheten målt i vill type celler (0.88 ± 0.30 mikrometer / sek i R256H celler sammenlignet med 1,60 ± 0,42 mikrometer / sek i villtype celler, p <0.005).
Introduction
Actin er den dominerende protein bestående cytoskjelettet og deltar i kritiske cellulære prosesser, inkludert celledeling, organelle bevegelse, cellemotilitet, sammentrekning, og signalering. I løpet av det siste tiåret, har sykdomsfremkallende mutasjoner i aktin blitt oppdaget i hver av de seks menneskelige aktin isoformer som fører til en rekke lidelser, fra myopatier til koronarsykdom 1-7. De prosesser som aktin mutasjoner fører til sykdom fortsatt ikke klarlagt. Gjær modellen forblir gullstandarden for å studere de biokjemiske virkningene av mutasjoner på aktin-funksjon på grunn av fordelene med den eneste essensielle aktin isoform, genetisk tractability og høy konservering av aktin-sekvens og funksjon. Studier viser at enkelte aktin mutasjoner føre til molekylære spesifikke dysfunksjoner med dominerende negative effekter åtte. For eksempel, døvhet fremkallende mutasjoner i γ-ikke-muskel aktin som påvirker Lys-118 rester endre reguleringen avaktin bindende protein Arp2 / 3 9. Studier ofte ansette in vitro analyser av protein: protein interaksjoner. Undersøkelser i virkningen av aktin mutasjoner på cellebiologi og, spesielt, aktin bindende protein lokalisering i cellen er begrenset.
Studier av gjæren cytoskjelettet in vivo konvensjonelt avhengige bilde av anleggs celler fra en invertert fluorescensmikroskop 10.. Disse eksperimentene leveres grunndata om morfologi av aktin cytoskjelettet. Undersøkelser har siden innlemmet tredimensjonal confocal imaging å visualisere komplekse cytoskeletal nettverk 11, 12. Dette bildebehandling tillater kvantifisering av overflod og relative plasseringen av aktin patcher og filamenter. Tynn-delen elektron-tomografi er blitt brukt til å avbilde morfologien til de tette trådformede nett i forhold til konserverte subcellulære strukturer 13. Crowded cellulære sskritt med et lite tverrsnitt kan undersøkes i fine detaljer med denne teknikken. Imaging studier har blitt utvidet til levende celler ved hjelp av tidsinnstilte fluorescerende mikroskopi. Når foto bleking og bakgrunnsfluoresens kan bli moderert, gir tid lapse avbildning undersøkelser som til dynamikken i cytoskeletal proteiner og responsen på miljøforhold 11, 14. Hver for visualisering av dynamikken i aktin filamenter in vitro ble ført ved innføringen av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Sammenlignet med bredt felt mikroskopi, har TIRF fordelen av redusert bakgrunnsfluorescens og forbedret kontrast til overvåking av de enkelte filamenter 15, 16. Med disse kvalitetene, har TIRF mikros blitt bearbeidet av cellebiologer å overvåke cellulære strukturer på plasma membran 17, 18. Cellulære hendelser, herunder endringer i cytoskjelettet, kanvisualiseres sanntid med lav fototoksisitet, maksimal kontrast og minimal bakgrunns florescence 19.
For bedre å forstå virkningen av aktin mutasjoner på bevegelsen, lokalisering, og omsetning av cytoskeletal proteiner i cellen, TIRF mikroskopi og protein merking ble anvendt. Heri beskrives det metoder for å studere virkningene av en klinisk relevant mutasjon i aktin i cytoskeletal dynamikk i Saccharomyces cerevisiae er beskrevet. Nærmere bestemt lokalisering og bevegelse av den aktin-bindende protein, Aip1p, ble visualisert og kvantifisert i celler som uttrykker R256H mutasjon i aktin. Disse teknikkene utfyller in vitro biokjemiske studier og gi rom for en større forståelse av protein interaksjoner og funksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Kloning inn i PB1996 Plasmid
- Design og ordre DNA primere fra en oligonukleotid produksjonsbedrift som flankerer målet sekvensen og inneholder unike restriksjonsseter i den valgte forelder plasmid. NB: I dette tilfelle ble primere laget for å forsterke de 400 basepar ved 5'-enden av Aip1 sekvensen. Den XhoI-restriksjonssete ble innlemmet i primer omtrent 20 bp før Aip1 sekvens, og XmaI ble tatt med omtrent 20 bp etter at målet Aip1 sekvensen. Plasmidet som brukes for kloning var PB1996, som inneholder en 3XGFP tag for fluorescens, et URA-genet for gjærstamme valg, og et ampicillinresistens-genet for bakteriell markering.
- Rense genomisk DNA fra en Ura-gjær haploid belastning. Merk: Se Figur 1 for et diagram av kloning prosessen.
- Kjør en standard PCR-reaksjon ved bruk av de to primerne og gjær genomisk DNA for å forsterke Aip1p genet med restriksjonsseter på hver nod.. Fordøye PCR produkt og PB1996 plasmid med restriksjonsenzymer i egne reaksjoner pr produsenten anbefalte protokoller. I dette tilfelle XmaI og XhoI ble brukt sammen med den medfølgende buffer ved 37 ° C i 1 time.
- Kjør en 0,8% agarose-gel-elektroforese for å skille de fordøyde DNA-fragmenter. I ett godt, legger en lav DNA masse stige og, i egne brønner, legger hele reaksjonen fra hver fordøyelsen. Kjør gelen ved 100 volt i omtrent 1 time, inntil fargestoffet foran er nær enden av gelen. Visual gelen under UV-lys og rense ut det segment som tilsvarer den proteinsegment, og kuttet plasmid.
- Ligate fordøyd Aip1 segmentet og PB1996 plasmid. Transformering produktet inn DH5α celler ved hjelp av produsentens protokoller (10 pl DNA med 100 ul celler i 30 minutter på is, varmesjokk ved 42 ° C i 2 min, vokse i SOC-media i 2 timer ved 37 ° C), og plate på kulturplater som omfatter antibiotika for seleksjon, i dette tilfellet LB +Amp plater. Velg og vokse en koloni i flytende kultur. Rens den nydesignede plasmid.
2. Mutant gjær Strain Generation
- Bruk en haploid gjærstamme som aktin allelet er sløyfet for å bygge en mutant gjærstamme. Merk: I dette tilfelle moderstammen var en generøs gave fra dr. Peter Rubenstein (University of Iowa), og konstruksjonen er beskrevet av Cook et al 20. Denne stamme mangler kromosomalt aktin-genet og inneholder et plasmid som koder for villtype gjær. aktin og uracil.
- Bruk PRS plasmid koding vill type gjær aktin med et Trp + utvalg som base plasmid for mutagenese 21.
- Utfør seterettet mutagenese på PRS plasmid til ingeniør på missense mutasjon i aktin.
- For R256H mutasjon i aktin, gjør primer 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' for å endre Arg 256 til hans 256. Kjør en standard mutagenesisPCR-reaksjon med plasmid fra trinn 2.2.
- Transform mutant aktin plasmid fra PCR inn DH5α celler. Isolere plasmid DNA og sekvensere aktin genet å verifisere mutasjonen.
- Transform plasmidet koder mutant gjær aktin inn i haploid gjærstamme fra trinn 2.1.
- Kultur de transformerte celler på Trp-plater for å selektere for gjær som inneholder Trp + inneholdende mutant gjær aktin plasmid.
- Selektere for celler som mangler det opprinnelige plasmid som koder for villtype-aktin-og uracil (beskrevet i 2.1) ved sub-dyrking celler fra Trp-platene på plater som inneholder 5-Fluoroorotic Acid (5-FOA). 5-FOA omdannes til giftige formen, 5-flurouracil, i yeas stammer som uttrykker den funksjonelle URA3 genet. Cellene som vokser etter trinnvis utvalg vil inneholde bare det mutante aktin plasmid.
- Rens det plasmid-DNA fra den nye gjærstamme. Sekvensere plasmidet for å sørge for den muterte aktin-genet er til stede. Bruk denne strene i videre studier. Denne prosessen er vist skjematisk i figur 2..
Tre. Transforming the Plasmid i gjærceller
- Fordøye Aip1p-GFP plasmid med en begrensning enzym for å tillate integrering i gjær kromosom. MERK: restriksjonssete må være utenfor sekvensen blokken som inneholder fluorescerende tag, genet av interesse, og seleksjonsmarkør. I dette tilfellet kan en pl av HpaI restriksjonsenzym med 8 pl DNA og 1 pl av de medfølgende 10 x buffer i 1 time ved 37 ° C.
- Kultur S. cerevisiae-celler (fra trinn 2.5) som er ute av stand til å syntetisere uracil (Ura-stamme) over natten i 5 ml i YPD-medier (1% gjærekstrakt, 2% pepton og 2% dekstrose) på et hjul ved 30 ° C. Spinn ned 1 ml av cellene i 5 min ved 1000 x g.
- Gjør PLATE blanding. Lag 10XTE ved tilsetning av 5 ml 1 M Tris pH 7,5, og 2 ml av 250 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til 43 ml av DDH 2 O. Legg 00,204 g litium-acetat i 20 ml 1XTE, deretter 8 g polyetylen-glykol (PEG) (MW ~ 3.300) og filtersteriliser.
- Dekanter supernatanten fra cellene spunnet ned i trinn 3.2, og resuspender cellene i den gjenværende væske. Til de suspenderte celler, tilsett 2 pl av 10 mg / ml lakse testes bærer DNA. Tilsett 10 pl av den fordøyde plasmid-DNA fra trinn 3.1 og virvle. Legg 0,5 ml PLATE og virvle. Tilsett 20 pl av 1 M DTT og virvle.
- Inkuber blandingen i 6-8 timer ved 25 ° C. Varmesjokk cellene i et vannbad ved 42 ° C i 10 min. Plate 100 ul av celler fra bunnen av mikrosentrifugerør hvor de har slått seg ut til en-Ura plate. Inkuber ved 30 ° C i 2-3 dager eller helt til kolonier form.
- Velg individuelle kolonier og strek ut på a-Ura plate. MERK: Disse cellene inneholder plasmidet med Aip1-GFP og Ura genet integrert i kromosomet, noe som åpner for vekst. Disse cellene blir deretter brukt i mikroskoppy.
4. Visualisere Aip1p Protein Movement Bruke Total Internal Reflection fluorescens mikroskopi
- Dyrk en kultur av gjærceller med innarbeidet Aip1p-GFP i YPD overnatter på et hjul ved 30 ° C. Subkultur 1 ml av kulturen natten over i 9 ml av-ura medium. Dyrk celler for ytterligere 3-4 timer på en rystemaskin ved 30 ° C for å sikre at de er i logaritmisk vekstfase.
- Legg 3 mL av celler til et glass objektglass og legge et dekkglass. La cellene til å bosette seg på lysbildet for 5 min. Plasser lysbildet i braketten av scenen plate.
- Observer Aip1p-GFP protein med en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop (488 nm) ved hjelp av en olje nedsenking 100X TIRF objektiv og en digital CCD kamera. Bruke SlideBook 5,0 programvare, skaffe bilder for 20 sek med en hastighet på 5 bilder / sek (enkeltbilder fra oppkjøpte bilder er presentert i figur 2A).
- Å fokusere på calen, åpen SlideBook 5.0-programvaren og klikk på Focus vindu-knappen på verktøylinjen for å få tilgang til de fokuskontrollene. Velg fanen Omfang og velg 100X-TIRF objektiv. Slå på lampen og skyv lampe bar til 15%. Endre Bin innstillingen til 2 x 2. Bytt filter for å lyse felt.
- På mikroskopet, bruker den fine fokusen hjulet for å bringe cellene i fokus som sett på dataskjermen.
- Ved hjelp av kontrollene i Focus Window, slå av lampen, endre filteret til Live, og klikk på TIRFM knappen.
- På TIRFM lyset festet på høyre side port av mikroskopet, snu laser utslipp til På.
- Velg fanen Stream innenfor fokusvinduet, merk av for å starte opptaket og klikk deretter lyse felt knappen.
- På TIRFM lyset, slår mikrometer å justere hendelsen vinkelen på laser. Dette brukes til å optimalisere fluorescensemisjonen fra Aip1-GFP foci og minimere bakgrunnsfluorescens fraceller og lysbilde.
- Når det ønskede bildet vises, trykker du på Start. Etter 20 sek, trykker du på Stopp. Lagre bildene. Under kategorien Fil på hovedmenyen, velg Lagre lysbilde som og angi filens plassering og navn.
- Bruk ImageJ programvare for å analysere bildene. Bruk makro plugin "Manuell Tracker" for å spore bevegelser og hastighet på den fluorescerende Aip1p fokus. Endre tidsintervallet parameter til 0,2 sek.
- Bruke valg add spor, spore en individuell fluorescerende protein gjennom 07:56 connective rammer. Bruk enden spor kommando og hastigheten av protein bevegelse mellom hver ramme, vises i et vindu med resultater.
- Bestem gjennomsnittshastighet mellom hver ramme ved hjelp av et Microsoft Excel-regneark. Bruk verdiene for å beregne den gjennomsnittlige hastighet av Aip1p bevegelse for hver cellestamme av interesse. MERK: Et spredningsdiagram av frekvensen av Aip1p bevegelsen og den gjennomsnittlige ikke-lineær hastighet vises i Figure 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En metode for å image dynamikken i cytoskeletal proteiner i cellen blir presentert. Aktin-bindende protein, Aip1p, ble merket med GFP. Motivet for plasmidet som koder for det kodede produktet er vist i figur 1.. Plasmidet ble deretter transformert inn i gjærceller. Ekspresjon av fluorescensmerket Aip1p tillot visualisering av proteinet oppførsel i cellen. Aip1p lokaliserer vanligvis til aktin flekker på områder av endocytose 22. For å kvantifisere Aip1p bevegelse, ble mer enn 50 fluorescerende Aip1p foci spores i mer enn 10 celler, som vist i figur 2A. Den gjennomsnittlige hastigheten ble beregnet for hvert fluorescerende Aip1p område (se figur 2B). I villtype celler, Aip1p bevegelser strekker seg over en celle, og senere forsvinner. Den gjennomsnittlige hastigheten på bevegelsen av Aip1p i villtype celler er 1,60 ± 0,42 mikrometer / sek. Celler som uttrykker R256H mutant aktin, kjent for å ha unormal morfologi av aktin cytoskeleton 23, har en endret Aip1p fenotype. I mutant belastningen, er Aip1p bevegelse begrenset og tregere. Den gjennomsnittlige hastigheten Aip1p bevegelsen er 0.88 ± 0.30 mikrometer / sek (p <0.005). Den Aip1p migrasjon er begrenset til nærområdet, med fokus sirkle rundt hverandre i stedet for å krysse cellen. I tillegg er Aip1p synlig lenger tyder tregere omsetning på Aip1 protein.
Figur 1. Diagram av plasmid konstruksjon. A) Aip1 fragment amplifisert via PCR er vist som blir fordøyet med restriksjonsenzymer (gule bolter). B) Et plasmid, PB1996 blir spaltet med restriksjonsenzymer for å fjerne det Abp140 genet. C) Den fordøyde Aip1 og PB1996 fragmenter ligeres to danne plasmid PB1996 Aip1. D) PB1996 Aip1 plasmid er lineært og forvandlet til gjærceller hvor DNA er integrert i kromosomet.
Figur 2. Diagram av mutant gjær aktin belastning konstruksjon. Plasmidet koder for den muterte aktin isoform blir så omdannet til en cellelinje, og valgt basert på evnen til å vokse på media som mangler tryptofan. De grønne linjene indikerer kromosomal DNA. Den svarte sirkelen er et plasmid. Den brune sirkelen representerer en gjærcelle. Boksene hver indikere et bestemt gen: gult er aktin, er oransje leucine, brun er uracil, og rosa er tryptofan. The X over boksen indikerer genet har blitt slettet fra kromosomal DNA. I trinn 2,3 og 2,4, svart stjerne på aktin genet indicates den R256H mutasjon.
Aip1p-GFP bevegelse i levende gjærceller. A) Bilder av villtype og R256H celler uttrykker GFP-merket Aip1p vises. Figur 3.. Cellene er i tidlig log fase vekst og bildene ble anskaffet hvert 0,2 sek for 15 sek. Pilene betegner plassering av en enkelt fluorescerende fokus over tid, blå for villtype-og rødt for aktin mutante stammer. Det siste bildet viser banen til Aip1 foci som en grønn linje. Scale bar vist er 5 mikrometer. B) Satsen for Aip1p bevegelsen ble målt ved hjelp ImageJ. Punktplottet Grafen viser satsen for enkelte fluorescerende fokus. Den vannrette linjen viser den gjennomsnittlige hastigheten for villtype (blå) og mutant (rød) aktin stammer.Aip1p flytter på 1,60 ± 0,42 mikrometer / sek i vill type celler sammenlignet med 0,88 ± 0,30 mikrometer / sek for celler som uttrykker R256H mutant aktin (p <0.005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En effektiv strategi for å visualisere dynamikken i cytoskjelettet og nytten i undersøkelser om sykdomsfremkallende mutasjoner har blitt beskrevet her. Avansert bildediagnostikk har skapt nye muligheter for å forstå den intracellulære bevegelse av proteiner nær cellemembranen. Total indre refleksjon fluorescensmikroskopi (TIRF) er en følsom teknikk for funksjonelle studier i levende celler. TIRF benytter en vinklet eksitasjon laser som skaper en flyktig felt på grunn av forskjellen i brytningsindekser av dekkglass og vandig medium. Energien i det svinnende felt begeistrer fluoroforene men avtar eksponentielt med avstanden av grensesnittet mellom dekkglass og vann. Dette resulterer i et høyt signal til støy-forhold og kraftig oppløsning 50-250 nm over dekkglass / medium grensesnitt. Disse kvalitetene gjør TIRF mikros et kraftig verktøy for å visualisere cytoskeletal proteiner på ett molekyl nivå i levende celler med mindrefototoksisitet og forbedret kontrast i forhold til andre teknikker 24-26.
Cytoskjelettet involverer mange proteiner som arbeider sammen for å tilpasse seg cellulære behov. Effekten av vaskulær-sykdomsfremkallende mutasjoner i aktin på regulering av cofilin ble nylig studert av vår gruppe 27. Basert på våre første funnene ble Aip1p, en aktin bindende protein som forenkler cofilin avhengig aktin adskillelses undersøkt. I innledende studier, celler som uttrykker aktin mutasjon R256H vokser dårlig i fravær av Aip1p, spesielt under stress-betingelser. Dette tyder på at Aip1p regulering av mutant aktin cytoskjelettet endres. Våre analyser av bevegelse og lokalisering av Aip1p i R256H belastningen ved hjelp av fluorescerende merking og TIRF mikros bekrefter de unormale dynamikk. I fremtiden planlegger vi å tagge flere proteiner, slik som cofilin, med forskjellige fluoroforene å visualisere bevegelse av flere proteinersamtidig for å bedre forstå protein: protein interaksjoner.
Det er noen begrensninger for å generere en fluorescently tagget protein og noen tilfeller der teknikken er ikke gjennomførbart. En fluoriserende kode kan forstyrre aktiviteten av proteinet eller endre interaksjon med bindingspartnere. Dette er blitt påtruffet i forsøk på å merke cofilin, en annen actin-bindende protein. Uttrykk for den merkede konstruere har vært mislykket i haploid gjær på grunn av forstyrret cofilin funksjon. Cofilin er et essensielt protein i gjær. Dermed er sletting av cofilin uten samtidig re-introduksjon dødelige; sperring påfølgende introduksjon på et plasmid. En måte å unngå denne begrensningen er å bruke diploid gjær. Ett eksemplar av cofilin genet ble slått ut, et tagget versjonen ble eksogent introdusert på et plasmid, og deretter valg for datterceller som mangler genomisk cofilin men inneholder plasmidet 22 Evnen til fluorescently tagge proteinet varoppnådd ved å legge koden til interne rester i protein som tidligere ble vist å ha liten innvirkning på sine protein-protein interaksjoner. Den N-eller C-terminalen er å foretrekke områder å legge til tag mindre regionene er kjent for å påvirke relevante protein: protein interaksjoner. Hvis dette ikke gir et funksjonelt protein, kan den alternative terminus eller interne rester bli forsøkt.
Det er noen viktige skritt i gjennomføringen av de teknikkene som beskrives. Ett er å avgjøre riktig sted å tagge proteinet som bevarer funksjon. Robuste kontroller må være inkludert for å validere at protein funksjon er bevart. For det andre må glide overvåkes for å sikre at cellene ikke tørke ut under avbildning. Voks kan brukes rundt kantene av dekkglass for å hindre dehydrering hvis nødvendig. Disse trinnene for å sikre suksess er enkel å lage denne tilnærmingen medgjørlig og fordelaktig til bilde strukturer nær plasmamembranen. Evnen til å quantify protein lokalisering og bevegelse i levende celler kan øke forståelsen av cellulære funksjoner. Ettersom mutasjoner som påvirker cytoskeletal proteiner er identifisert, ekspresjon av fluorescensmerket kodede proteiner og TIRF mikros kan være nyttig for å undersøke patofysiologien underliggende sykdom hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Peter Rubenstein for nyttig diskusjon og teknisk rådgivning og David Pellman for den opprinnelige PB1996 klone. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra March of Dimes og finansiering fra Ride for Kids.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
