Summary
يمكن الطفرات المسببة للمرض في الأكتين تغيير وظيفة هيكل الخلية. وكميا ديناميات هيكل الخلية من خلال التصوير من البروتينات الموسومة fluorescently باستخدام المجهر مضان مجموع الداخلية. على سبيل المثال، البروتين هيكل الخلية، Aip1p، غيرت التعريب والحركة في الخلايا معربا عن شكل الإسوي الأكتين متحولة، R256H.
Abstract
الطفرات في الأكتين يسبب مجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان بسبب التغيرات الجزيئية الخاصة التي غالبا ما يغير وظيفة هيكل الخلية. في هذه الدراسة، والتصوير من البروتينات الموسومة fluorescently باستخدام مجموع مضان الداخلي (TIRF) يستخدم المجهر لتصور وقياس التغيرات في ديناميات هيكل الخلية. المجهر TIRF واستخدام العلامات الفلورية يسمح أيضا لتقدير التغيرات في ديناميات هيكل الخلية التي تسببها طفرات في أكتين. باستخدام هذه التقنية، الكمي وظيفة هيكل الخلية في الخلايا الحية يكمل قيما في الدراسات المختبرية وظيفة البروتين. كمثال على ذلك، وقد تم تحديد الطفرات مغلطة التي تؤثر على بقايا الأكتين R256 في ثلاثة الإسوية الأكتين الإنسان مما يدل على هذه الأحماض الأمينية يلعب دورا مهما في التفاعلات التنظيمية. تمت دراسة الآثار المترتبة على الطفرة R256H الأكتين على تحركات هيكل الخلية باستخدام نموذج الخميرة. كان البروتين، Aip1، والذي يعرف لمساعدة cofilin في أكتين التحلل،الموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في N-محطة وتعقبها في الجسم الحي باستخدام TIRF المجهري. وكان كميا معدل حركة Aip1p في كل نوع البرية وسلالات متحولة. في الخلايا معربا عن R256H الأكتين متحولة، ويقتصر Aip1p الحركة ومعدل الحركة ما يقرب من نصف سرعة قياسها في خلايا النوع البري (0.88 ± 0.30 ميكرون / ثانية في الخلايا R256H مقابل 1.60 ± 0.42 ميكرون / ثانية في خلايا النوع البري، ص <0.005).
Introduction
الأكتين هو البروتين السائد يضم الهيكل الخلوي وتشارك في العمليات الخلوية الحرجة بما في ذلك انقسام الخلايا، وحركة عضية، حركية الخلية، والانكماش، والإشارات. على مدى العقد الماضي، تم اكتشاف الطفرات المسببة للمرض في الأكتين في كل من الأشكال الإسوية ستة الأكتين الإنسان مما يؤدي إلى مجموعة من الاضطرابات، من الاعتلالات العضلية لمرض الشريان التاجي 1-7. مواصلة العمليات التي الطفرات الأكتين يؤدي إلى مرض إلى توضيح. يبقى نموذج الخميرة معيار الذهب لدراسة آثار الطفرات البيوكيميائية على وظيفة الأكتين بسبب المزايا التي تتمتع بها واحدة الإسوي الأكتين الأساسية، والحفاظ على قابلية الإستطراق الجينية عالية من تسلسل الأكتين وظيفة. تشير الدراسات إلى أن الطفرات أكتين الفردية يؤدي إلى الخلل الجزيئي محددة مع الآثار السلبية المهيمنة 8. على سبيل المثال، والطفرات المسببة للالصمم في أكتين γ غير العضلات التي تؤثر على بقايا ليز-118 تغيير التنظيم من قبلأكتين البروتين ملزمة Arp2 / 3 9. وكثيرا ما تستخدم الدراسات في المختبر تحليل البروتين: تفاعلات البروتين. التحقيق في تأثير الطفرات على الأكتين بيولوجيا الخلية، وبوجه خاص، أكتين البروتين التوطين الملزمة في الخلية محدودة.
دراسات الهيكل الخلوي الخميرة في الجسم الحي تعتمد تقليديا على الصور من خلايا ثابتة من مضان المجهر المقلوب 10. هذه التجارب تزويد البيانات الأساسية عن مورفولوجية الهيكل الخلوي الأكتين. التحقيقات منذ ذلك الحين أدرجت ثلاث التصوير متحد البؤر الأبعاد لتصور هيكل الخلية شبكة معقدة 11، 12. يسمح هذا التصوير الكمي وفرة، والمكان النسبي للبقع وخيوط الأكتين. وقد استخدم التصوير المقطعي رقيقة قسم الإلكترون لصورة مورفولوجية الشبكات الخيطية كثيفة النسبي للهياكل التحت خلوية الحفاظ على 13. ق الخلوية مزدحمةتسير مع شريحة صغيرة يمكن دراستها بتفصيل دقيق مع هذه التقنية. وقد تم تمديد دراسات التصوير لالخلايا الحية باستخدام الفاصل الزمني فلوري المجهر. عندما تبيض الصورة ومضان الخلفية يمكن خاضعة للإشراف، والوقت الفاصل بين التصوير يسمح التحقيقات لديناميات البروتينات هيكل الخلية واستجابة للظروف البيئية 11، 14. بشكل منفصل، وقد تقدمت تصور ديناميات خيوط الأكتين في المختبر من خلال إدخال مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري. مقارنة المجهر حقل واسع، TIRF في الاستفادة من انخفاض مضان الخلفية وتعزيز النقيض من رصد خيوط الفردية 15 و 16. مع هذه الصفات، وقد تم تكييف TIRF المجهر من قبل علماء الأحياء الخلايا لمراقبة الهياكل الخلوية في غشاء البلازما 17، 18. الأحداث الخلوية، بما في ذلك التغيرات في الهيكل الخلوي، ويمكنيمكن تصور الزمن الحقيقي مع الضيائية منخفضة، وعلى النقيض القصوى، والحد الأدنى من الإزهار الخلفية 19.
إلى فهم أفضل لتأثير الطفرات الأكتين على الحركة، والترجمة، ودوران من البروتينات هيكل الخلية في الخلية، المجهري TIRF والبروتين علامات استخدمت. هنا، يتم وصف أساليب لدراسة الآثار المترتبة على الطفرة ذات الصلة سريريا في أكتين على ديناميات هيكل الخلية في خميرة الخباز. على وجه التحديد، وتوطين وحركة بروتين ملزمة أكتين، Aip1p، تم تصور وكميا في الخلايا معربا عن الطفرة R256H في أكتين. تكمل هذه التقنيات في الدراسات البيوكيميائية المختبر والسماح لفهم أكبر للتفاعلات البروتين ووظائفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاستنساخ في PB1996 البلازميد
- تصميم والنظام الاشعال DNA من نيوكليوتيدات دقيقة تصنيع الشركة التي تكتنف تسلسل الهدف وتحتوي على مواقع فريدة من نوعها في تقييد البلازميد الأصل المحدد. ملاحظة: في هذه الحالة، تم تصميم الاشعال لتضخيم أزواج قاعدة 400 في 5 'نهاية تسلسل Aip1. تأسست الموقع تقييد XhoI في التمهيدي حوالي 20 سنة مضت قبل تسلسل Aip1، وأدرج XmaI حوالي 20 سنة مضت بعد تسلسل Aip1 الهدف. كان البلازميد المستخدمة في الاستنساخ PB1996، الذي يحتوي على علامة 3XGFP لمضان، جين URA لاختيار سلالة الخميرة، والجينات المقاومة لاختيار الأمبيسلين البكتيرية.
- تنقية الحمض النووي الجيني من أورا-الخميرة سلالة فرداني. ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لرسم تخطيطي لعملية الاستنساخ.
- تشغيل تفاعل PCR القياسية باستخدام اثنين الاشعال والحمض النووي الجيني الخميرة لتضخيم الجين Aip1p مع المواقع قيود على إما ENد. هضم المنتج PCR والبلازميد PB1996 مع إنزيمات التقييد في تفاعلات منفصلة لكل منتج أوصت البروتوكولات. في هذه الحالة استخدمت XmaI وXhoI مع المخزن المؤقت المرفقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تشغيل 0.8٪ الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي هضمها. في بئر واحدة، تحميل منخفضة الحمض النووي الشامل وسلم، في آبار منفصلة، تحميل كامل من كل رد فعل الهضم. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 1 ساعة، حتى الجبهة صبغ هو قرب نهاية الجل. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتنقية من الجزء الذي يتوافق مع شريحة البروتين وخفض البلازميد.
- Ligate الجزء Aip1 هضمها وPB1996 البلازميد. تحويل المنتج إلى الخلايا DH5α باستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة (DNA 10 ميكرولتر مع 100 ميكرولتر الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد، صدمة الحرارة على 42 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وتنمو في وسائل الإعلام SOC لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية) وعلى لوحات لوحة الثقافة التي تشمل المضادات الحيوية للاختيار، في هذه الحالة LB +لوحات أمبير. حدد وتنمو مستعمرة واحدة في الثقافة السائل. تنقية البلازميد المصممة حديثا.
2. المسخ الجيل سلالة الخميرة
- استخدام سلالة الخميرة فرداني التي أليل الأكتين قد تم حذفه لبناء سلالة الخميرة متحولة. ملاحظة: في هذه الحالة، كان من سلالة الأم هدية سخية من الدكتور بيتر روبنشتاين (جامعة أيوا)، ووصف البناء من قبل كوك وآخرون 20 هذه السلالة تفتقر إلى الجين الكروموسومات الأكتين ويحتوي على البلازميد الذي يشفر النوع البري الخميرة. الأكتين واليوراسيل.
- استخدام ترميز البلازميد PRS نوع الخميرة البرية الأكتين مع التربتوفان + اختيار كما البلازميد قاعدة لالطفرات 21.
- أداء الطفرات الموجهة الموقع على البلازميد PRS لمهندس طفرة مغلطة في أكتين.
- لالطفرة R256H في الأكتين، وجعل التمهيدي 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' لتغيير الارجنتين 256 لصاحب 256. تشغيل الطفرات القياسيةتفاعل PCR مع البلازميد من الخطوة 2.2.
- تحويل الأكتين البلازميد متحولة من PCR في الخلايا DH5α. عزل الحمض النووي البلازميد وتسلسل الجين الأكتين للتحقق من طفرة.
- تحويل ترميز البلازميد الخميرة متحولة الأكتين في سلالة الخميرة فرداني من الخطوة 2.1.
- ثقافة الخلايا تحولت على التربتوفان لوحات تحديد للخميرة تحتوي على التربتوفان + تحتوي على الخميرة متحولة الأكتين البلازميد.
- حدد الخلايا التي تفتقر إلى البلازميد الأصلي الذي يشفر النوع البري الأكتين واليوراسيل (موضح في 2.1) من خلال زرع خلايا الباطن من التربتوفان لوحات على لوحات تحتوي على 5 Fluoroorotic الحمضية (5-FOA). يتم تحويل 5 FOA إلى النموذج السامة، 5-flurouracil، في الاعوام سلالات التعبير عن الجينات URA3 الوظيفية. فإن الخلايا التي تنمو بعد اختيار تدريجي تحتوي فقط على الأكتين البلازميد متحولة.
- تنقية DNA البلازميد من سلالة جديدة الخميرة. تسلسل البلازميد لضمان الجينات الطافرة الأكتين موجود. استخدام هذا قتدريب في إجراء المزيد من الدراسات. وهذه العملية تخطيطي في الشكل 2.
3. تحويل البلازميد إلى خلايا الخميرة
- هضم البلازميد Aip1p-GFP مع انزيم تقييد للسماح الاندماج في كروموسوم الخميرة. ملاحظة: يجب أن يكون الموقع تقييد خارج كتلة تسلسل الذي يحتوي على علامة الفلورسنت، والجينات في المصالح، واختيار علامة. في هذه الحالة، استخدم 1 ميكرولتر من الإمراض انزيم التقييد مع 8 ميكرولتر الحمض النووي و 1 ميكرولتر من العازلة 10X المرافق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- ثقافة S. خلايا خميرة (من الخطوة 2.5) التي هي غير قادرة على تجميع اليوراسيل (أورا سلالة) بين عشية وضحاها في 5 مل في وسائل الإعلام YPD (1٪ خلاصة الخميرة، ببتون 2٪، و 2٪ سكر العنب) على عجلة في 30 درجة مئوية. تدور باستمرار 1 مل من الخلايا لمدة 5 دقائق في ز × 1،000.
- جعل الخليط لوحة. جعل 10XTE بإضافة 5 مل من 1 M تريس درجة الحموضة 7.5 و 2 مل من حمض 250 ملي ethylenediaminetetraacetic (EDTA) إلى 43 مل من DDH 2 O. إضافة 00.204 غرام من خلات الليثيوم إلى 20 مل من 1XTE، ثم 8 غرام من البولي ايثيلين جلايكول (PEG) (MW ~ 3،300) وفلتر تعقيم.
- صب طاف من الخلايا نسج أسفل في الخطوة 3.2 و resuspend الخلايا في السائل المتبقي. إلى الخلايا مع وقف التنفيذ، إضافة 2 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الخصيتين السلمون الحمض النووي الناقل. إضافة 10 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد هضمها من الخطوة 3.1 و دوامة. إضافة 0.5 مل من طبق ودوامة. إضافة 20 ميكرولتر من 1 M DTT ودوامة.
- احتضان الخليط لمدة 6-8 ساعة عند 25 درجة مئوية. حرارة صدمة الخلايا في حمام الماء عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا من الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge حيث استقروا بها على لوحة-أورا. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام أو حتى شكل مستعمرات.
- حدد المستعمرات الفردية، ومسحة من الصعود إلى-أورا لوحة. ملاحظة: هذه الخلايا تحتوي على البلازميد مع Aip1-GFP وأورا الجين دمجها في كروموسوم، مما يسمح للنمو. وبعد ذلك يتم استخدام هذه الخلايا في microscoPY.
4. تصور حركة البروتين Aip1p عن طريق التأمل إجمالي الداخلية الإسفار الميكروسكوب
- تنمو ثقافة من خلايا الخميرة مع دمج Aip1p-GFP في YPD بين عشية وضحاها على عجلة في 30 درجة مئوية. ثقافة فرعية 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها في 9 مل من أورا سائل الإعلام. تنمو الخلايا لساعة إضافية 3-4 على شاكر عند 30 درجة مئوية لضمان أن تكون في مرحلة النمو السجل.
- إضافة 3 ميكرولتر من الخلايا على شريحة المجهر والزجاج، وإضافة ساترة. تسمح للخلايا ليستقر على الشريحة لمدة 5 دقائق. ضع الشريحة في قوس من لوحة المرحلة.
- مراقبة البروتين GFP-Aip1p مع ما مجموعه انعكاس مضان الداخلي (TIRF) المجهر (488 نانومتر) باستخدام الغمر النفط 100X TIRF الهدف وكاميرا CCD الرقمية. باستخدام SlideBook 5.0 البرمجيات، والحصول على صور لمدة 20 ثانية بمعدل 5 إطارات / ثانية (يتم عرض إطارات الصور الفردية المكتسبة في الشكل 2A).
- التركيز على جأذرع، مفتوحة SlideBook 5.0 برنامج وانقر على زر التركيز النوافذ في شريط الأدوات للوصول إلى ضوابط التركيز. حدد علامة التبويب نطاق وحدد الهدف 100X-TIRF. تشغيل مصباح على وحرك شريط مصباح إلى 15٪. تغيير الإعداد بن ل2 × 2. تغيير فلتر لحقل مشرق.
- على المجهر، واستخدام الاتصال الهاتفي التركيز غرامة لجعل الخلايا في التركيز كما رأينا على شاشة الكمبيوتر.
- باستخدام عناصر التحكم ضمن إطار التركيز، تشغيل مصباح قبالة، وتغيير فلتر لايف، وانقر على زر TIRFM.
- على إضاءة TIRFM تعلق على الحق ميناء جانب المجهر، وتحويل الانبعاثات الليزر لتشغيل.
- حدد علامة التبويب تيار داخل إطار التركيز، والتحقق من المربع المجاور لبدء التسجيل ثم انقر فوق زر الحقل مشرق.
- على إضاءة TIRFM، وتحويل ميكرومتر لضبط زاوية حادثة الليزر. ويستخدم هذا لتحسين الانبعاثات مضان من بؤر Aip1-GFP وتقليل مضان الخلفية منخلايا والشريحة.
- عندما يتم عرض الصورة المطلوبة، اضغط ابدأ. بعد 20 ثانية، وإيقاف الصحافة. حفظ الصور. تحت علامة التبويب ملف على شريط القائمة الرئيسية، حدد حفظ الشرائح كما وأدخل موقع الملف واسمه.
- استخدام البرمجيات يماغيج لتحليل الصور. استخدام البرنامج المساعد ماكرو "المقتفي يدوي" لتعقب الحركة ومعدل من Aip1p بؤر الفلورسنت. تغيير الوقت الفاصل المعلمة إلى 0.2 ثانية.
- باستخدام التحديد الوظيفة المسار، وتحديد وتعقب بروتين فلوري الفردية من خلال 4-8 إطارات الضام. استخدام الأمر نهاية المسار وسوف سرعة حركة البروتين بين كل إطار عرض في نافذة النتائج.
- تحديد سعر متوسط بين كل الإطار باستخدام جدول بيانات Microsoft Excel. استخدام القيم لحساب متوسط سرعة حركة Aip1p لكل سلالة خلية من الفائدة. ويرد مؤامرة مبعثر من معدل الحركة Aip1p ومتوسط سرعة غير الخطية في فيقو ملاحظة:إعادة 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد ديناميات هيكل الخلية البروتينات في الخلية وهناك طريقة لصورة. تم الموسومة البروتين ملزمة أكتين، Aip1p، مع GFP. يظهر تصميم لالبلازميد ترميز المنتج الموسومة في الشكل 1. ثم تحولت البلازميد إلى خلايا الخميرة. التعبير عن الموسومة fluorescently Aip1p يسمح التصور من سلوك البروتين في الخلية. Aip1p يموضع عادة إلى بقع الأكتين في مواقع الإلتقام 22. لقياس حركة Aip1p، تم تعقب أكثر من 50 البؤر Aip1p الفلورسنت في أكثر من 10 خلايا، كما هو مبين في الشكل 2A. تم حساب متوسط السرعة في كل مجال Aip1p الفلورسنت (انظر الشكل 2B). في خلايا النوع البري، تتراوح الحركات Aip1p عبر الخليوي، وتختفي في وقت لاحق. متوسط سرعة حركة Aip1p في خلايا النوع البري هو 1.60 ± 0.42 ميكرون / ثانية. الخلايا معربا عن الأكتين متحولة R256H، والمعروف أن يكون التشكل غير طبيعي للقبرصي الأكتينtoskeleton 23، لديها Aip1p النمط الظاهري تغييرها. في سلالة متحولة، حركة Aip1p هو مقيد وأبطأ. متوسط سرعة حركة Aip1p هو 0.88 ± 0.30 ميكرون / ثانية (ع <0.005). هجرة Aip1p يقتصر على المنطقة المجاورة، مع بؤر تدور حول بعضها البعض بدلا من عبور الخلية. بالإضافة إلى ذلك، Aip1p مرئيا أطول مما يدل على دوران أبطأ من البروتين Aip1.
الشكل 1. مخطط البناء البلازميد. A) ويظهر جزء Aip1 تضخيمها عبر PCR يتم هضمها من قبل الإنزيمات قيود (مسامير صفراء). ب) البلازميد، PB1996، ويتفاعل مع تقييد الانزيمات لإزالة الجين Abp140. C) ويهضم و تربط Aip1 وPB1996 شظايا رس تشكيل البلازميد PB1996 Aip1. D) البلازميد PB1996 Aip1 هو خطي وتحويلها إلى خلايا الخميرة حيث تم دمج الحمض النووي في الصبغي.
الشكل 2. مخطط لبناء الخميرة سلالة متحولة الأكتين. البلازميد ترميز أكتين الإسوي متحولة ثم يتم تحويلها إلى خط الخلية واختيارها على أساس القدرة على النمو على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان. خطوط خضراء تشير إلى الحمض النووي الصبغي. الدائرة السوداء هي البلازميد. يمثل دائرة بني خلية الخميرة. مربعات كل تشير إلى وجود جين معين: الأصفر هو الأكتين والبرتقالي هو ليسين، والبني هو اليوراسيل، وردي هو التربتوفان. وX على المربع يشير تم حذف الجينات من الحمض النووي الصبغي. في الخطوات 2.3 و 2.4، النجم الأسود على ط أكتين الجينndicates الطفرة R256H.
الرقم 3. يتم إظهار حركة Aip1p-GFP في خلايا الخميرة الحية. أ) صور من نوع البرية والخلايا R256H معربا عن GFP الموسومة Aip1p. الخلايا هي في أوائل مرحلة النمو سجل وتم الحصول على صور كل 0.2 ثانية لمدة 15 ثانية. الأسهم تدل على مكان وجود التركيز الفلورسنت الفردية مع مرور الوقت، والأزرق لنوع البرية والأحمر لسلالات متحولة الأكتين. ويبين الإطار الأخير مسار بؤر Aip1 بمثابة الخط الأخضر. شريط النطاق المعروضة 5 ميكرون. B) وقد تم قياس معدل الحركة Aip1p باستخدام يماغيج. يعرض الرسم البياني مؤامرة مبعثر معدل لبؤر الفلورسنت الفردية. يشير شريط أفقي متوسط السرعة لنوع البرية (الازرق) ومتحولة (الحمراء) الأكتين السلالات.Aip1p يتحرك في 1.60 ± 0.42 ميكرون / ثانية في خلايا النوع البري مقارنة مع 0.88 ± 0.30 ميكرون / ثانية لالخلايا معربا عن R256H الأكتين متحولة (ع <0.005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت استراتيجية فعالة لتصور ديناميات الهيكل الخلوي والأداة المساعدة في التحقيقات على الطفرات المسببة للأمراض هنا. خلقت طرائق التصوير المتقدمة فرصا جديدة لفهم حركة الخلايا من البروتينات بالقرب من غشاء الخلية. مجموع المجهري مضان التأمل الداخلي (TIRF) هي تقنية الحساسة للدراسات وظيفية في الخلايا الحية. يستخدم ليزر TIRF الإثارة الزاوية التي تخلق حقل زائل بسبب الفرق في الفهارس الانكسار ساترة ووسط مائي. الطاقة من الحقل زائل يثير fluorophores ولكن يقلل بشكل كبير مع مسافة واجهة بين ساترة والماء. هذه النتائج في إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء والقرار قوية 50-250 نانومتر فوق واجهة ساترة / متوسطة. هذه الصفات تجعل TIRF المجهري أداة قوية لتصور البروتينات هيكل الخلية على مستوى جزيء واحد في الخلايا الحية مع أقلالضيائية وعلى النقيض تعزيز نسبة إلى غيرها من التقنيات 24-26.
ينطوي على العديد من البروتينات الهيكل الخلوي العاملة في الحفل على التكيف مع احتياجات الخلوية. تأثير الأوعية الدموية من الأمراض المسببة للطفرات في أكتين على التنظيم من قبل cofilin تمت دراسة مؤخرا من قبل مجموعتنا 27. استنادا إلى النتائج الأولية لدينا، وكان التحقيق Aip1p، وهو أكتين البروتين الذي يسهل تعتمد على cofilin الأكتين فك الربط،. في الدراسات الأولية، الخلايا معربا عن الطفرة R256H الأكتين النمو ضعيفا في غياب Aip1p، وخاصة في ظل ظروف الإجهاد. هذا يشير إلى أن تنظيم Aip1p من الهيكل الخلوي الأكتين متحولة يتم تغييرها. لدينا تحليلات للحركة وتوطين Aip1p في سلالة R256H باستخدام علامات الفلورسنت وTIRF المجهر يعزز ديناميكية غير طبيعية. في المستقبل، ونحن نخطط لوضع علامة بروتينات إضافية، مثل cofilin، مع fluorophores مختلفة لتصور حركة بروتينات متعددةفي وقت واحد من أجل فهم أفضل البروتين: تفاعلات البروتين.
هناك بعض القيود لتوليد البروتين الموسومة fluorescently وبعض الحالات التي تكون فيها هذه التقنية ليست مجدية. ويمكن لعلامة فلوري تعطيل النشاط من البروتين أو تغيير التفاعل مع الشركاء ملزمة. وقد واجه هذا في محاولات لوضع علامة cofilin، الأكتين آخر بروتين ملزمة. وقد تم التعبير عن بناء الموسومة تنجح في الخميرة فرداني بسبب تعطل وظيفة cofilin. Cofilin هو بروتين أساسي في الخميرة. وبالتالي، حذف cofilin دون ما يصاحب ذلك إعادة إدخال قاتلة؛ منع إدخال اللاحقة على البلازميد. طريقة واحدة لتجنب هذا القيد هو استخدام الخميرة مضاعفا. وقد طرقت نسخة واحدة من الجين cofilin بها، نسخة الموسومة قدم خارجيا على البلازميد، ومن ثم اختيار الخلايا الوليدة التي تفتقر cofilin الجيني ولكنها تحتوي على البلازميد 22 وكان القدرة على علامة fluorescently البروتيناكتسبت عن طريق إضافة علامة إلى بقايا الداخلية في البروتين التي عرضت سابقا ليكون لها تأثير كبير على التفاعلات البروتين البروتين. وN-أو C-محطة هي مواقع الأفضل لإضافة العلامة ما لم يعرف المناطق ذات الصلة للتأثير البروتين: تفاعلات البروتين. إذا كان هذا لا تسفر عن البروتين وظيفية، ومحطة بديلة أو بقايا الداخلية يمكن حاولت.
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في تنفيذ تقنيات وصفها. واحد هو تحديد الموقع المناسب لوضع علامة على البروتين الذي يحفظ وظيفة. يجب تضمين ضوابط قوية للتحقق من أن يتم الاحتفاظ ظيفة البروتين. الثانية، يجب أن تراقب الشريحة لضمان الخلايا لا يجفف أثناء التصوير. الشمع يمكن استخدامها حول حواف الغطاء زلة لمنع الجفاف إذا لزم الأمر. هذه الخطوات لضمان نجاح هي صنع هذا النهج واضحة لين العريكة والمفيد لهياكل صورة بالقرب من غشاء البلازما. القدرة على رابعا علىntify توطين البروتين والحركة في الخلايا الحية يمكن أن تعزز فهم الوظائف الخلوية. كما يتم تحديد الطفرات التي تؤثر على البروتينات هيكل الخلية والتعبير عن الموسومة fluorescently البروتينات وTIRF المجهري يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية مرض الإنسان الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر بيتر روبنشتاين للمناقشة مفيدة والمشورة الفنية وديفيد Pellman لاستنساخ PB1996 الأصلي. وأيد هذا العمل من خلال منحة من آذار من مليم وبتمويل من ركوب للأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
