Summary
致病突变的肌动蛋白可以改变细胞骨架的功能。细胞骨架动力学是通过利用全内荧光显微镜荧光标记蛋白成像量化。作为一个例子，细胞骨架蛋白，Aip1p，已经改变了定位和运动在细胞中表达突变的肌动蛋白同种型，R256H。
Abstract
在肌动蛋白基因突变引起一系列由于特定的分子变化，往往改变细胞骨架功能的人类疾病。在这项研究中，荧光的成像标签的使用总的内部荧光（TIRF）显微镜是用于可视化和量化改变的细胞骨架动力学的蛋白质。 TIRF显微镜和使用荧光标记的也允许在肌动蛋白的突变引起的变化，细胞骨架动力学的定量。使用这种技术，在活细胞中的细胞骨架功能的定量有价值的补充在蛋白质功能的体外研究。作为一个例子，影响肌动蛋白残基R256的错义突变已经确定在3人肌动蛋白异构体表明该氨基酸起着调节的相互作用中起重要作用。利用酵母模型的骨架运动的肌动蛋白基因突变R256H的影响进行了研究。蛋白质，AIP1，这是众所周知的协助丝切蛋白在肌动蛋白解聚，是具有标记的绿色荧光蛋白（GFP）在N-末端和使用TIRF显微镜追踪体内 。 Aip1p运动的野生型和突变株的速率进行定量。在细胞中表达R256H突变的肌动蛋白，Aip1p运动被限制，并且移动速度是近一半在野生型细胞中测得（0.88±0.30微米/秒，R256H细胞相比，1.60速度±0.42微米/秒在野生型细胞中，对<0.005）。
Introduction
肌动蛋白是一种包括细胞骨架的主要蛋白质，参与关键的细胞过程，包括细胞分裂，细胞器运动，细胞运动，收缩和信令。在过去的十年中，致病突变的肌动蛋白被发现在每一个六人肌动蛋白异构体，导致一系列的疾病的，从肌病冠状动脉疾病1-7。由肌动蛋白基因突变导致疾病的进程继续阐明。酵母模型仍然是金标准，研究由于单一基本肌动蛋白异构体，遗传易处理性和高保护肌动蛋白的序列和功能的优势在肌动蛋白功能的突变的生化效应。研究表明，个体的肌动蛋白基因突变导致分子的具体功能障碍与显性负效应8。例如，在γ-非肌肉肌动蛋白耳聋致病突变影响赖氨酸-118残基通过改变调节肌动蛋白结合蛋白ARP2 / 3 9。研究经常采用体外分析蛋白质：蛋白质相互作用。调查肌动蛋白突变对细胞生物学和，特别是肌动蛋白结合蛋白定位于细胞的效果是有限的。
体内的酵母细胞骨架的研究传统上依赖于固定细胞的倒置荧光显微镜10的图像。这些实验提供了约肌动蛋白细胞骨架的形态学基础数据。调查已自掺入三维共焦成像可视化的复杂的细胞骨架网络11，12。该成像允许肌动蛋白斑块和长丝的数量和相对位置的量化。薄膜部电子断层扫描已用于图像相对于保藏的亚细胞结构13致密的丝状网络的形态。拥挤的蜂窝s步具有小的横截面中可以检查细节与此技术。成像研究已经扩展到使用时间的推移荧光显微镜活细胞。当光漂白和背景荧光可以缓和，时间的推移成像可以研究到细胞骨架蛋白的动态和应对环境条件11，14。另外， 在体外微丝的动态可视化垫付引进全内反射荧光（TIRF）显微镜。相比宽视场显微镜，TIRF具有减少背景荧光的优点和增强的对比度以监测单丝15，16。凭借这些优势，全内反射荧光显微镜已经适应了细胞生物学家监测细胞结构在质膜17，18。细胞事件，包括改变的细胞骨架，可以被可视化的实时低光毒性，最大对比度和最小的背景荧光19。
为了更好地理解对移动，本地化和营业额在细胞内，全内反射荧光显微镜和蛋白标记细胞骨架蛋白肌动蛋白基因突变的影响进行了使用。这里，方法来研究在肌动蛋白上的在酿酒酵母中的细胞骨架动力学临床相关突变的影响进行说明。具体地说，肌动蛋白结合蛋白，Aip1p的定位和移动，被可视化和量化，在细胞中表达的R256H突变的肌动蛋白。这些技术配合体外生化研究，并允许蛋白质相互作用和功能的更深入的了解。
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Protocol
1，克隆入质粒PB1996
- 从寡核苷酸制造公司，侧翼的靶序列，并包含在所选择的亲本质粒独特的限制性酶切位点的设计和秩序的DNA引物。注意：在这种情况下，设计引物以扩增400个碱基对的AIP1序列的5'末端。该XhoI限制性位点掺入引物约20 bp的前AIP1序列，XmaI被包含在目标AIP1序列后约20个基点。用于克隆的质粒是PB1996，其中包含一个3XGFP标记为荧光，一个URA基因的酵母菌株的选择，和氨苄青霉素抗性基因对细菌的选择。
- 净化从浦 - 酵母单倍体菌株的基因组DNA。注：请参考图1进行克隆过程的示意图。
- 使用两个引物和酵母基因组DNA扩增Aip1p基因与在任恩的限制性酶切位点上运行一个标准的PCR反应ð。消化PCR产物和PB1996质粒在每个制造商独立的反应限制性内切酶推荐的协议。在这种情况下XmaI和XhoI，在37℃下进行1小时使用所附缓冲液中。
- 跑0.8％琼脂糖凝胶电泳分离消化的DNA片段。在一个良好，加载一个低质量的DNA阶梯，在不同的孔，装入每个消化整个反应。运行该凝胶在100伏约1小时，直到染料前沿接近凝胶的末端。可视化的凝胶在UV光并纯化出对应于该蛋白片段的链段和切质粒。
- 结扎消化AIP1段和PB1996质粒。变换成产品制造商使用的协议（10微升的DNA用100微升的细胞在冰上，热休克30分钟，在42℃进行2分钟，2小时，在37℃生长在SOC培养基）和平板上培养板DH5α细胞包括抗生素选择，在这种情况下，LB +功放板。选择并在液体培养基中生长一个菌落。纯化的新设计的质粒。
2，突变酵母菌株产生
- 使用，其中肌动蛋白基因已被删除构建突变酵母菌株单倍体酵母菌株。注意：在这种情况下，亲本菌株是从彼得·鲁宾斯坦博士（爱荷华大学）一份厚礼，建筑是由库克等人 20描述这株缺乏染色体肌动蛋白基因，并包含一个质粒编码的野生型酵母。肌动蛋白和尿嘧啶。
- 使用PRS质粒编码的野生型酵母肌动蛋白与色氨酸+选择为基础的质粒诱变21。
- 在PRS质粒进行定点突变工程师的错义突变成肌动蛋白。
- 为R256H突变的肌动蛋白，使引物的5'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3'的Arg 256更改为他的256。运行一个标准的诱变与来自步骤2.2的质粒的PCR反应。
- 从PCR改造的突变体肌动蛋白的质粒转化DH5α细胞。分离质粒DNA并测序的肌动蛋白基因，以验证该突变。
- 变换编码突变酵母肌动蛋白为来自步骤2.1的单倍体酵母菌株的质粒。
- 文化对TRP-板的转化细胞来选择含有含有突变的酵母肌动蛋白的质粒色氨酸+酵母。
- 选择细胞缺乏，通过从在包含5 - 氟乳清酸（5-FOA）的平板色氨酸板传代培养的细胞编码的野生型肌动蛋白和尿嘧啶（在2.1中所述）的原始质粒中。 5-FOA转化为有毒的形式，5 - 氟尿嘧啶，在yeaS的菌株表达功能URA3基因。逐步选择后生长的细胞只含有突变的肌动蛋白的质粒。
- 纯化的新的酵母菌株的质粒DNA。序列的质粒，以确保该突变的肌动蛋白基因的存在。使用这个S训练中进一步研究。这个过程是在图2。
3，转变成质粒酵母细胞
- 消化Aip1p-GFP的质粒用限制性内切酶，以允许整合到酵母染色体中。注：限制性酶切位点必须是包含荧光标记，目的基因和选择标记的序列块外。在这种情况下，使用1微升高致病性禽流感限制性内切酶与8μLDNA和1微升的陪同10x缓冲液1小时，在37°C。
- 文化学酵母细胞（来自步骤2.5），它们无法在车轮过夜合成尿嘧啶（URA-菌株）在5毫升的YPD培养基（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖），于30℃下降速将1ml细胞5分钟的1000×g的。
- 制版混合物。使10XTE加入5毫升1M的Tris pH值7.5和2ml的250mM的乙二胺四乙酸（EDTA）以43毫升双蒸2 O的添加00.204克的乙酸锂至20ml 1XTE的，然后按8克聚乙二醇（PEG）（分子量〜3300）和过滤消毒。
- 从在步骤3.2离心下来的细胞弃去上清，重悬的细胞中残留的液体。以悬浮细胞，加入2微升10毫克/毫升鲑鱼睾丸载体的DNA。加10微升来自步骤3.1和涡流消化的质粒DNA。加入0.5毫升板和旋涡。加入20微升1M的DTT和旋涡。
- 孵育6-8小时，将混合物在25℃下热休克的细胞在水浴中于42℃10分钟。板100微升的微量离心管中，他们已经解决了上一浦板的底部的细胞。孵化在30℃2-3天，或直至菌落形态。
- 选择单个菌落和条纹出到浦板块。注意：这些细胞含有与AIP1-GFP和浦基因整合到染色体中的质粒，允许增长。这些细胞然后在microsco使用PY。
4，可视化Aip1p蛋白质运动使用全内反射荧光显微镜
- 生长的酵母细胞与结合Aip1p-GFP在YPD培养过夜的车轮在30℃下继代培养将1ml过夜培养成9毫升浦介质。生长的细胞额外3-4小时在摇床上于30℃，以确保它们处于对数生长期。
- 加入3微升细胞至玻璃显微镜载片上，并加盖玻片。使细胞定居在幻灯片上5分钟。将滑动舞台板的支架。
- 观察Aip1p-GFP蛋白与全内反射荧光（TIRF）显微镜（488纳米），使用油浸渍100X TIRF物镜和一个数字CCD照相机。使用SlideBook 5.0软件，获取图像，持续20秒以5帧/秒的（获取的图像的各个帧被示于图2A）的速率。
- 把重点放在了C英语学习者，开放SlideBook 5.0软件，然后单击工具栏上的焦点的窗口按钮，进入重点监控。选择范围选项卡，然后选择100X-TIRF目标。打开灯，灯条滑动到15％。更改彬设置以2×2，改变过滤器明场。
- 在显微镜下，使用精细调焦旋钮，使细胞成为关注的焦点看到电脑屏幕上。
- 使用对焦窗口中的控件，可将灯泡熄灭，更换过滤器到Live，然后单击TIRFM按钮。
- 在连接到显微镜的右侧端口的TIRFM照明器，开启激光发射为开。
- 选择焦点的窗口内的流选项卡中，选中该框旁边开始录制，然后单击亮场按钮。
- 在TIRFM照明器，转动千分尺，以调整激光的入射角度。这是用来从AIP1-GFP荧光点优化的荧光发射和从尽量减少背景荧光细胞和幻灯片。
- 当显示所需的图像，然后按开始键。经过20秒，按停止。保存图像。在主菜单栏上的文件选项卡上，选择保存幻灯片作为并输入文件的位置和名称。
- 使用ImageJ的软件分析图像。使用宏插件“手动跟踪器”追踪荧光Aip1p灶的运动和速度。时间间隔参数更改为0.2秒。
- 使用add曲目选择，选择并通过七时五十六结缔组织帧跟踪单个荧光蛋白。使用结束track命令和每帧之间的运动蛋白质的速度将在结果窗口中显示。
- 确定使用的是Microsoft Excel电子表格的每一帧之间的平均速率。使用该值来计算Aip1p运动的平均速度为每个感兴趣的细胞株。注：Aip1p运动和平均非线性速度率的散点图如图FIGU重新2B。
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Representative Results
一种方法，以图像中的细胞骨架蛋白的动态呈现。肌动蛋白结合蛋白，Aip1p，被标记为绿色荧光蛋白。设计用于编码标记产物的质粒示于图1中。然后将所述质粒转化到酵母细胞中。的荧光的表达标签Aip1p允许的蛋白的行为的可视化中的单元格。 Aip1p通常定位于肌动蛋白斑块在细胞内吞22的网站。量化Aip1p运动，超过50荧光Aip1p灶被跟踪在超过10个细胞中， 如图2A所示 。平均速度计算各荧光Aip1p区域（参见图2B）。在野生型细胞，Aip1p运动范围在小区，后来又消失了。 Aip1p在野生型细胞中的运动的平均速度为1.60±0.42微米/秒。细胞表达R256H突变的肌动蛋白，已知有微丝骨架的形态异常toskeleton 23，有一个改变Aip1p表型。在所述突变体菌株，Aip1p运动是受限制的并且比较慢。 Aip1p运动的平均速度为0.88±0.30微米/秒（P <0.005）。该Aip1p迁移仅限于眼前的区域，与周围互相灶盘旋，而不是穿越细胞。此外，Aip1p可见不再提示周转AIP1蛋白的慢。
质粒构建的图1。图A）的AIP1片段通过PCR扩增显示被消化用限制性内切酶（黄色螺栓），B）的质粒，PB1996，是用限制酶以除去基因Abp140。C）上消化AIP1和PB1996片段连接吨o形式，所述质粒PB1996 AIP1 D）的PB1996 AIP1质粒线性化，并转化到酵母细胞中，其中所述DNA被整合到染色体中。
图2。框图 突变酵母菌株的肌动蛋白的结构。编码突变的肌动蛋白异构体的质粒，然后转化成一个细胞系，并根据上生长介质缺乏色氨酸的能力选择的。绿线表示染色体DNA。黑圈是质粒。棕色的圆圈代表一个酵母细胞。每个框表示一个特定的基因：黄色的是肌动蛋白，橘子是亮氨酸，棕色是尿嘧啶，和粉红色是色氨酸。在框X表示基因已被删除从染色体DNA。在步骤2.3和2.4，黑星上的肌动蛋白基因Indicates的R256H突变。
图3显示在活酵母细胞中野生型和R256H细胞表达GFP标记Aip1p的A）图片Aip1p-GFP的运动 。细胞是在早期的对数期生长和图像被获取的每0.2秒15秒。的箭头表示的单个荧光灶的位置随着时间的推移，蓝色为野生型，红色表示突变体的肌动蛋白的菌株。最后一帧显示AIP1灶作为绿线的路径。示比例尺为5μmB）使用ImageJ Aip1p运动的速率进行测定。散点图显示的速度为单个荧光灶。单杠表示平均速度为野生型（蓝色）和突变型（红色）肌动蛋白的菌株。相比于0.88 Aip1p移动在1.60±0.42微米/秒在野生型细胞±0.30微米/秒为细胞表达R256H突变的肌动蛋白（P <0.005）。
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Discussion
以可视化的细胞骨架和实用程序的动态，对致病基因突变研究一种有效的策略已经在这里描述。先进的成像方式创造了新的机会，了解蛋白质在细胞内的运动靠近细胞膜。全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种灵敏的技术用于在活细胞中的功能性研究。 TIRF使用创建由于在盖玻片和水性介质的折射率差的渐逝场的角度的激励激光器。渐逝场的能量激发荧光团，但与盖玻片和水之间的界面的距离呈指数下降。这导致了高的信噪比，并从上面的盖玻片/介质界面50-250纳米强大的分辨率。这些特性使全内反射荧光显微镜的强有力的工具，以可视化细胞骨架蛋白在活细胞单分子水平少光毒性和对比度相对于其他技术增强24 - 26。
细胞骨架涉及许多协同工作，以适应细胞需要的蛋白质。最近研究了本组27血管疾病引起突变的肌动蛋白在调控丝切蛋白的效果。根据我们的初步调查结果，Aip1p，肌动蛋白结合蛋白，有利于丝切蛋白依赖性肌动蛋白切断，进行了调查。在初步研究中，细胞表达肌动蛋白基因突变R256H增长不佳的情况下Aip1p的，尤其是在胁迫条件。这表明，该突变体的肌动蛋白细胞骨架的Aip1p调节被改变。我们在使用荧光标记和全内反射荧光显微镜R256H应变的运动和Aip1p本地化的分析证实了异常动态。在未来，我们计划额外的标记蛋白，如丝切蛋白，用不同的荧光可视化多种蛋白质的运动同时更好地了解蛋白质：蛋白质相互作用。
有一定的局限性，以产生荧光标记的蛋白质和某些情况下的技术中是不可行的。荧光标记可以破坏蛋白质的活性或改变的相互作用与结合配偶体。这已经遇到在尝试来标记丝切蛋白，另一种肌动蛋白结合蛋白。标记的结构的表达一直不成功的，由于打乱丝切蛋白功能单倍体酵母。丝切蛋白在酵母中一个重要蛋白。因此，丝切蛋白缺失不伴重新引入是致命的;除非随后推出的质粒。为了避免这种限制的一种方法是使用二倍体酵母。该丝切蛋白基因的一个拷贝被淘汰，一个标记的版本外源性引入的质粒，然后选择对于缺少基因组丝切蛋白，但含有质粒22到荧光标记蛋白质的能力是子细胞通过添加标签，以在蛋白质内部残基，以前显示出具有在其蛋白质 - 蛋白质相互作用的影响很小获得。 N-或C-末端是优选的位点添加标记，除非该区域是众所周知的影响相关的蛋白：蛋白相互作用。如果这不产生功能性蛋白，备用末端或内部残基，可以尝试。
目前正在实施中描述的技术的几个关键步骤。其一是确定适当的位置来标记节约功能的蛋白质。强大的控制必须包括验证蛋白质的功能得以保留。二，幻灯片必须进行监测，以保证细胞成像过程中不会变干。蜡可以围绕盖片的边缘被用于防止脱水如果需要的话。这些步骤，以确保成功是直接制造这种方法易于处理，并利于附近的质膜图像结构。至之四的能力ntify蛋白定位和运动的活细胞可以增强细胞功能的理解。作为影响细胞骨架蛋白的突变被确定，荧光的表达标记蛋白和TIRF显微镜可以是有用的，调查的病理生理基础的人类疾病。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢彼得·鲁宾斯坦的有益的讨论，并提供技术咨询和大卫Pellman原PB1996克隆。这项工作是由March of Dimes的赠款，并从乘驾为孩子的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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