Summary
Mutações causadoras de doenças em actina pode alterar a função do citoesqueleto. Dinâmica do citoesqueleto são quantificados através de imagens de proteínas fluorescentes marcados através de microscopia de fluorescência total de interna. Como exemplo, a proteína do citoesqueleto, Aip1p, alterou a localização e movimento em células que expressam a isoforma da actina mutante, R256H.
Abstract
Mutações em actina causar uma variedade de doenças humanas devido a alterações moleculares específicos que muitas vezes alteram a função do citoesqueleto. Neste estudo, a imagiologia por fluorescência utilizando proteínas marcadas com fluorescência interna total (TIRF) microscopia é usado para visualizar e quantificar as alterações na dinâmica do citoesqueleto. Microscopia TIRF e a utilização de marcadores fluorescentes também permite a quantificação das alterações na dinâmica do citoesqueleto causadas por mutações em actina. Usando esta técnica, a quantificação da função do citoesqueleto em células vivas complementa um valioso em estudos in vitro da função da proteína. Como um exemplo, as mutações que afectam a missense resíduo R256 actina foram identificadas três isoformas de actina em humanos, sugerindo este aminoácido desempenha um papel importante nas interacções reguladoras. Os efeitos da mutação R256H actina do citoesqueleto em movimentos foram estudadas utilizando o modelo de levedura. A proteína, AIP1, que é conhecido por auxiliar cofilina na despolimerização da actina, estavamarcado com proteína verde fluorescente (GFP) na extremidade N-terminal e rastreados in vivo utilizando microscopia TIRF. A taxa de movimento Aip1p, tanto do tipo selvagem e mutantes foi quantificada. Em células que expressam R256H actina mutante, Aip1p movimento é restringido e a velocidade do movimento é quase metade da velocidade medida em células do tipo selvagem (0,88 ± 0,30 mM / seg em células R256H em comparação com 1,60 ± 0,42 mM / seg em células de tipo selvagem, p <0,005).
Introduction
A actina é a proteína predominante, compreendendo o citoesqueleto e participa em processos celulares importantes, incluindo a divisão celular, movimento organelo, motilidade celular, a contracção, e de sinalização. Ao longo da última década, as mutações que causam doenças em actina foram descobertos em cada uma das seis isoformas de actina humanos que conduzem a uma variedade de desordens, a partir de miopatias para doença da artéria coronária 1-7. Os processos pelos quais as mutações que conduzem à doença de actina continuar a ser elucidados. O modelo de levedura continua sendo o padrão ouro para o estudo dos efeitos bioquímicos de mutações na função actina devido às vantagens da única isoforma de actina essencial, rastreabilidade genética e alta conservação de seqüência e função de actina. Estudos mostram que as mutações individuais de actina levar a disfunções específicas moleculares com efeitos negativos dominantes 8. Por exemplo, as mutações que causam surdez na actina γ não-músculo-que afetam o resíduo Lys-118 altera regulamentação pora proteína de ligação à actina Arp2 / 3 9. Estudos in vitro freqüentemente empregam análises de proteína: interações protéicas. As investigações sobre o efeito da actina mutações em biologia celular e, em particular, agindo localização da proteína de ligação na célula são limitados.
Estudos sobre o citoesqueleto de levedura in vivo convencionalmente dependem de imagens de células fixadas a partir de um microscópio de fluorescência invertido 10. Estas experiências forneceu dados fundamentais sobre a morfologia do citoesqueleto de actina. As investigações, desde então, incorporou três dimensional imagem confocal para visualizar a rede do citoesqueleto complexo 11, 12. Esta imagem permite a quantificação da abundância e localização relativa de manchas de actina e filamentos. A tomografia de electrões secção fina tem sido utilizado para a imagem da morfologia das redes filamentosas densas relativos a estruturas subcelulares conservados 13. Lotado s celularespassos com uma pequena seção transversal pode ser examinado em detalhes finos com esta técnica. Estudos de imagem foram estendidas para as células vivas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Quando branqueamento foto e fluorescência de fundo pode ser moderado, lapso de tempo de imagem permite que as investigações a respeito da dinâmica de proteínas do citoesqueleto ea resposta a condições ambientais 11, 14. Separadamente, a visualização da dinâmica dos filamentos de actina in vitro foi avançada pela introdução de reflexão total interna microscopia de fluorescência (TIRF). Em comparação com a microscopia de campo amplo, TIRF tem a vantagem da diminuição da fluorescência de fundo e contraste melhorado para controlar os filamentos individuais 15, 16. Com estas características, microscopia TIRF foi adaptado por biólogos celulares para monitorizar estruturas celulares na membrana de plasma 17, 18. Eventos celulares, incluindo mudanças no citoesqueleto, podeser visualizados em tempo real, com baixa fototoxicidade, máximo contraste e fundo mínimo de fluorescência 19.
Para entender melhor o efeito de mutações de actina sobre a movimentação, localização e volume de negócios de proteínas do citoesqueleto da célula, microscopia TIRF e proteína de marcação foram utilizados. Nisto, os métodos para estudar os efeitos de uma mutação clinicamente relevante em actina sobre a dinâmica do citoesqueleto em Saccharomyces cerevisiae, são descritos. Especificamente, a localização e movimento da proteína de ligação a actina, Aip1p, foi visualizada e quantificada em células que expressam a mutação R256H em actina. Estas técnicas complementares em estudos bioquímicos in vitro e permitir uma maior compreensão das interações protéicas e funções.
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Protocol
1. Clonagem no plasmídeo PB1996
- Planejar e ativar primers de DNA de um oligonucleotídeo empresa de fabricação que ladeiam a sequência alvo e contêm sítios de restrição únicos no plasmídeo pai selecionado. NOTA: neste caso, os iniciadores foram concebidos para amplificar os pares de base 400 na extremidade 5 'da sequência de AIP1. O local de restrição Xhol, foi incorporado no iniciador de cerca de 20 pb antes da sequência de AIP1, e Xmal foi incluído de cerca de 20 pb após a sequência alvo AIP1. O plasmídeo utilizado para a clonagem era PB1996, que contém uma marca 3XGFP por fluorescência, um gene URA para selecção da estirpe de levedura, e um gene de resistência à ampicilina para selecção bacteriano.
- Purificar o DNA genômico de um Ura-levedura haplóide. Nota: Consulte a Figura 1 para obter um diagrama de processo de clonagem.
- Executar uma reacção de PCR convencional utilizando os dois iniciadores e o ADN genómico de levedura para amplificar o gene Aip1p com os locais de restrição de cada brd. Digerir o produto de PCR e o plasmídeo PB1996 com as enzimas de restrição em reacções separadas por fabricante recomenda protocolos. Neste caso XmaI e XhoI foram utilizadas com o tampão de acompanhamento, a 37 ° C durante 1 hora.
- Executar um gel de electroforese de agarose a 0,8% para separar os fragmentos de ADN digeridos. Em um bem, coloque uma escada baixa massa de DNA e, em poços separados, coloque toda a reação de cada digestão. Submeter o gel a 100 volts durante cerca de 1 hora, até a frente do corante é próximo do final do gel. Visualizar o gel sob uma luz UV e purificar o segmento que corresponde ao segmento de proteína e o plasmídeo de corte.
- Ligar o segmento AIP1 digerido e PB1996 plasmídeo. Transformar o produto em células DH5a utilizando protocolos do fabricante (10 uL de ADN com 100 ul de células durante 30 minutos em gelo, choque térmico a 42 ° C durante 2 min, crescer em meio SOC, durante 2 horas a 37 ° C) e da placa em placas de cultura que incluem a antibiótico para a selecção, neste caso LB +Placas Amp. Selecione e crescer uma colônia em cultura líquida. Purificar o plasmídeo novo design.
2. Mutante geração da estirpe de levedura
- Use uma estirpe de levedura haplóide em que o alelo actina foi eliminado para construir uma estirpe de levedura mutante. Nota: Neste caso, a estirpe-mãe foi uma oferta generosa do Dr. Peter Rubenstein (Universidade de Iowa) e a construção foi descrita por Cook et al 20 Esta estirpe não tem o gene da actina cromossómico e contém um plasmídeo que codifica tipo selvagem de levedura. actina e uracilo.
- Use o pRS plasmídeo codificação tipo selvagem levedura actina com um Trp + seleção como o plasmídeo base para mutagênese 21.
- Realizar a mutagénese dirigida ao local no plasmídeo pRS para projectar a mutação sem sentido em actina.
- Para a mutação R256H em actina, fazer o iniciador 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' para alterar o Arg 256 a 256 Sua. Executar uma mutagênese padrãoReacção de PCR com o plasmídeo do passo 2.2.
- Transformar o plasmídeo mutante de actina a partir da PCR em células DH5a. Isolar o ADN de plasmídeo e sequenciar o gene da actina para verificar a mutação.
- Transformar o plasmídeo que codifica mutante actina levedura na cepa de levedura haplóides a partir do passo 2.1.
- Cultura as células transformadas em TRP-placas para selecionar para o fermento contendo o Trp + contendo plasmídeo mutante levedura actina.
- Seleccionar células a que falta o plasmídeo original que codifica tipo selvagem actina e uracilo (descrito em 2.1) através da sub-cultura de células a partir das placas de TRP-em placas que contêm 5-fluoroorï Ácido (5-FOA). 5-FOA é convertido para a forma tóxica, 5-fluorouracilo, em yeas estirpes que expressam o gene URA3 funcional. As células que crescem após a selecção gradual conterá apenas o plasmídeo actina mutante.
- Purifica-se o ADN do plasmídeo a partir da nova estirpe de levedura. Sequenciar o plasmídeo para assegurar o gene da actina mutante está presente. Utilize este streinar em estudos posteriores. Este processo está esquematizado na Figura 2.
3. Transformar o plasmídeo em células de levedura
- Digerir o plasmídeo Aip1p-GFP, com uma enzima de restrição para permitir a integração no cromossoma da levedura. NOTA: O local de restrição deve estar fora do bloco de sequência que contém o marcador fluorescente, o gene de interesse, e um marcador de selecção. Neste caso, usar 1 ul da enzima de restrição Hpal com 8 ul de DNA e 1 ul de tampão 10x a acompanha, durante 1 hora a 37 ° C.
- Cultura S. células cerevisiae (a partir do passo 2.5), que são incapazes de sintetizar o uracilo (Ura-tensão) durante a noite em 5 ml em meio de YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, e 2% de dextrose) em uma roda a 30 ° C. Girar 1 ml das células durante 5 min a 1000 x g.
- Faça mistura PLACA. Adicione 10XTE pela adição de 5 ml de Tris 1 M pH 7,5 e 2 ml de 250 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 43 ml de ddH 2 O. Adicionar 00,204 g de acetato de lítio e 20 ml de 1XTE, depois 8 g de polietileno glicol (PEG) (PM ~ 3300) e filtro de esterilizar.
- Decantar o sobrenadante das células centrifugadas no passo 3.2 e voltar a suspender as células no líquido restante. Para as células em suspensão, adicionar 2 mL de ADN de 10 mg / ml de transportador de testículos de salmão. Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo digerido a partir do passo 3.1 e vortex. Adicionar 0,5 ml de placa e de vórtice. Adicionar 20 mL de 1 M DTT e vortex.
- Incubar a mistura durante 6-8 horas a 25 ° C. Choque térmico das células em banho-maria a 42 ° C durante 10 min. Placa de 100 ul de células a partir do fundo do tubo de microcentrífuga em que se instalaram-se para uma placa-Ura. Incubar a 30 ° C durante 2-3 dias ou até se formarem colónias.
- Selecione colônias individuais e raia-se para uma placa-Ura. NOTA: As células contêm o plasmídeo com o gene GFP e AIP1-Ura integrado no cromossoma, permitindo o crescimento. Estas células serão então utilizados em microscopiapy.
4. Visualizando o Movimento Protein Aip1p Usando Total Internal Reflection microscopia de fluorescência
- Crescer uma cultura de células de levedura com o incorporadas Aip1p-GFP em YPD durante a noite sobre uma roda a 30 ° C. Subcultura 1 ml da cultura durante a noite em 9 ml de-Ura meios. Crescer as células para um 3-4 horas adicionais num agitador a 30 ° C, para assegurar que eles estão em fase de crescimento log.
- Adicione 3 mL de células para uma lâmina de microscópio de vidro e adicionar uma lamela. Permitir que as células para resolver sobre o slide para 5 min. Coloque o slide no suporte da placa de palco.
- Observe a proteína Aip1p-GFP com uma reflexão interna total de fluorescência (TIRF) microscópio (488 nm), utilizando uma imersão em óleo 100X TIRF objetivo e uma câmera CCD digital. Usando o software Slidebook 5.0, para obter imagens de 20 segundos a uma taxa de 5 quadros / seg (quadros individuais de imagens obtidas são apresentadas na Figura 2A).
- Para se concentrar no cvaras, software Slidebook 5.0 aberto e clique no botão Janela Foco na barra de ferramentas para acessar os controles de foco. Selecione a guia Escopo e selecione o objetivo 100X-TIRF. Ligue a lâmpada e deslize a barra de lâmpada para 15%. Altere a configuração para Bin 2 x 2. Troque o filtro de campo claro.
- No microscópio, use o dial foco fino para trazer as células em foco, como visto na tela do computador.
- Usando os controles dentro da janela Focus, desligar a lâmpada, mudar o filtro para se viver, e clique no botão TIRFM.
- Por iluminador TIRFM conectado à porta do lado direito do microscópio, vire a emissão de laser para Ligado.
- Selecione a guia Fluxo dentro da janela de foco, marque a caixa ao lado para iniciar a gravação e, em seguida, clique no botão de campo claro.
- Por iluminador TIRFM, gire o micrômetro para ajustar o ângulo de incidência do laser. Esta é utilizada para optimizar a emissão de fluorescência a partir de focos AIP1-GFP e minimizar a fluorescência de fundo docélulas e slide.
- Quando a imagem desejada for exibida, pressione Start. Depois de 20 segundos, pressione Parar. Salve as imagens. Na guia Arquivo na barra de menu principal, selecione Salvar slide como e digite o local do arquivo eo nome.
- Use o software ImageJ para analisar as imagens. Use o plugin macro "Rastreador Manual" para rastrear o movimento eo ritmo dos focos Aip1p fluorescente. Alterar o parâmetro de intervalo de tempo de 0,2 s.
- Usando a seleção add pista, selecionar e acompanhar uma proteína fluorescente indivíduo através de 4-8 quadros conjuntivos. Use o comando pista final ea velocidade do movimento de proteínas entre cada quadro será exibido em uma janela de resultados.
- Determine a taxa média entre cada quadro usando uma planilha do Microsoft Excel. Usar os valores para calcular a velocidade média de movimento Aip1p para cada estirpe de células de interesse. Observação: Uma dispersão de a velocidade do movimento e a velocidade Aip1p não linear média é mostrada na Figure 2B.
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Representative Results
Um método para a imagem dinâmica das proteínas do citoesqueleto da célula é apresentado. A proteína de ligação à actina, Aip1p, foi marcado com GFP. O projeto para o plasmídeo que codifica para o produto marcado é mostrado na Figura 1. O plasmídeo foi então transformado em células de levedura. Expressão do fluorescentemente marcado Aip1p permitiu a visualização do comportamento da proteína na célula. Aip1p normalmente localiza a patches de actina em locais de endocitose 22. Para quantificar o movimento Aip1p, mais de 50 focos Aip1p fluorescentes foram rastreados em mais de 10 células, como mostrado na Figura 2A. A velocidade média foi calculada para cada área Aip1p fluorescente (ver Figura 2B). Em células selvagens, movimentos Aip1p variar através de uma célula, e depois desaparecem. A velocidade média do movimento de Aip1p em células do tipo selvagem é 1,60 ± 0,42 mM / seg. As células que expressam o mutante actina R256H, conhecido por ter morfologia anormal do cy actinatoskeleton 23, tem um fenótipo Aip1p alterada. Na estirpe mutante, o movimento Aip1p é restrito e mais lento. A velocidade média do movimento Aip1p é de 0,88 ± 0,30 mM / seg (p <0,005). A migração Aip1p é limitado à área imediata, com focos circulando em torno um do outro, em vez de atravessar a célula. Além disso, é visível Aip1p mais sugerindo rotação mais lenta de proteína AIP1.
Figura 1. Diagrama de construção do plasmídeo. A) O fragmento de AIP1 amplificado através de PCR é mostrado a ser digerido por enzimas de restrição (parafusos amarelo). B) O plasmídeo, PB1996, é digerido com as enzimas de restrição para remover o gene Abp140. C) O digerido fragmentos AIP1 e PB1996 são ligados to formar o plasmídeo PB1996 AIP1. D) O plasmídeo é linearizado AIP1 PB1996 e transformado em células de levedura em que o DNA é integrado no cromossoma.
Figura 2. Diagrama de construção levedura actina estirpe mutante. Se o plasmídeo que codifica para a isoforma da actina mutante é então usado para transformar uma linha de células e seleccionado com base na capacidade para crescer em meio sem triptofano. As linhas verdes indicam DNA cromossômico. O círculo preto é um plasmídeo. O círculo marrom representa uma célula de levedura. As caixas de cada um indica um gene específico: o amarelo é a actina, a laranja é a leucina, marrom é uracila, eo rosa é triptofano. O X sobre a caixa indica gene foi excluído do DNA cromossômico. Nos passos 2.3 e 2.4, a estrela preta no i gene actinandicates a mutação R256H.
Figura 3. Movimento Aip1p-GFP em células de levedura ao vivo. A) Imagens de tipo selvagem e células R256H expressando GFP Aip1p são mostrados. As células estão em crescimento inicial fase log e imagens foram obtidas a cada 0,2 s por 15 s. As setas indicam a localização de um foco fluorescente indivíduo ao longo do tempo, azul para o tipo selvagem e vermelho para as estirpes mutantes de actina. O último quadro mostra o caminho dos focos AIP1 como uma linha verde. Barra de escala mostrado é de 5 m. B) A taxa de movimento Aip1p foi medida usando ImageJ. O gráfico gráfico de dispersão mostra a taxa de focos fluorescentes individual. A barra horizontal indica a velocidade média para o tipo selvagem (azul) e mutante (vermelho) agindo cepas.Aip1p move a 1,60 ± 0,42 mM / seg em células do tipo selvagem em comparação com 0,88 ± 0,30 mM / seg para células que expressam R256H actina mutante (p <0,005).
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Discussion
Uma estratégia eficaz para visualizar a dinâmica do citoesqueleto e a utilidade em investigações sobre mutações patogénicas tem sido descrito aqui. Modalidades de imagem avançadas criaram novas oportunidades para entender o movimento intracelular de proteínas, perto da membrana celular. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica sensível para estudos funcionais em células vivas. TIRF usa um laser de excitação angular que cria um campo evanescente, devido à diferença nos índices de refracção do meio aquoso e a lamela. A energia do campo evanescente excita fluoróforos, mas diminui exponencialmente com a distância da interface entre a lamela e água. Isto resulta numa alta relação sinal-ruído e poderoso resolução 50-250 nm acima da interface lamela / meio. Estas qualidades tornam microscopia TIRF uma ferramenta poderosa para visualizar as proteínas do citoesqueleto no nível de uma única molécula de células vivas com menosfototoxicidade e contraste melhorado em relação a outras técnicas de 24-26.
O citoesqueleto envolve inúmeras proteínas que trabalham em conjunto para se adaptar às necessidades celulares. O efeito da doença vascular-causando mutações em actina de normatização por cofilina foi recentemente estudado por nosso grupo 27. Com base em nossos resultados iniciais, Aip1p, uma proteína actina que facilita-dependente cofilina actina corte de ligação, foi investigada. Em estudos preliminares, as células que expressam a mutação R256H actina crescer mal na ausência de Aip1p, especialmente sob condições de estresse. Isto sugere que a regulação Aip1p do citoesqueleto de actina mutante é alterada. Nossas análises do movimento e localização de Aip1p na cepa R256H usando marcação fluorescente e microscopia TIRF corrobora a dinâmica anormais. No futuro, pretendemos marcar proteínas adicionais, como cofilina, com diferentes fluoróforos para visualizar o movimento de múltiplas proteínassimultaneamente para entender melhor a proteína: interações protéicas.
Existem algumas limitações para a geração de uma proteína fluorescente etiquetado e alguns casos em que a técnica não é viável. Um marcador fluorescente pode perturbar a actividade da proteína nem altere a interacção com os parceiros de ligação. Este foi encontrada nas tentativas de marcar cofilina, outra proteína de ligação da actina. Expressão da construção marcado sido vencida em leveduras haplóides devido à função cofilina interrompido. Cofilin é uma proteína essencial para a levedura. Assim, a exclusão de cofilina sem concomitante re-introdução é letal; restrição posterior introdução em um plasmídeo. Uma maneira de evitar esta limitação é a utilização de levedura diplóide. Uma cópia do gene cofilina foi nocauteado, uma versão marcado foi introduzida exogenamente em um plasmídeo, e, em seguida, a seleção para as células filhas que não possuem cofilina genômica mas contêm o plasmídeo 22 A capacidade de codificar a proteína fluorescente foiganhou, adicionando a tag para resíduos internos na proteína que antes eram mostrados para ter pouco impacto em suas interações proteína-proteína. O C-terminal N-ou são sites preferível adicionar a tag a menos que as regiões são conhecidos por influenciar proteína pertinente: interações protéicas. Se este não produzir uma proteína funcional, o terminal alternativo ou resíduos internos podem ser tentada.
Existem alguns passos críticos na implementação das técnicas descritas. Uma é a determinação do local apropriado para marcar a proteína que conserva função. Controlos sólidos deve ser incluída para validar que a função da proteína seja mantida. Em segundo lugar, a lâmina tem de ser monitorizada para assegurar que as células não se desidratar durante a imagiologia. Cera pode ser usado em torno dos bordos da lâmina de cobertura para evitar a desidratação, se necessário. Estes passos para garantir o sucesso são simples tomada esta abordagem dócil e vantajoso para as estruturas de imagem perto da membrana plasmática. A capacidade de qualocalização de proteínas ntify e movimento em células vivas pode aumentar a compreensão das funções celulares. Como as mutações que afectam proteínas do citoesqueleto são identificados, a expressão de proteínas marcadas com fluorescência e microscopia TIRF podem ser úteis para investigar a patofisiologia da doença humana subjacente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Peter Rubenstein para discussão útil e assessoria técnica e David Pellman para o clone PB1996 originais. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da March of Dimes e financiamento do passeio para as crianças.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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