Summary
Sjukdomsframkallande mutationer i aktin kan förändra cytoskeletal funktion. Cytoskelettala dynamik kvantifieras genom avbildning av fluorescerande taggade proteiner med hjälp av total inre fluorescensmikroskopi. Som ett exempel har den cytoskelettprotein, Aip1p, förändrad lokalisering och rörelse i celler som uttrycker den mutanta aktin isoformen, R256H.
Abstract
Mutationer i aktin orsaka en rad mänskliga sjukdomar på grund av specifika molekylära förändringar som ofta förändrar cytoskeletal funktion. I denna studie, avbildning av fluorescerande taggade proteiner med hjälp av total inre fluorescens (TIRF) mikroskopi används för att visualisera och kvantifiera förändringar i cytoskelettala dynamik. TIRF mikroskopi och användning av fluorescerande markörer möjliggör också kvantifiering av förändringarna i cytoskelettala dynamik som orsakas av mutationer i aktin. Med denna teknik, kvantifiering av cytoskelettala funktion i levande celler kompletterar värdefullt in vitro studier av proteiners funktion. Som ett exempel har missense-mutationer som påverkar aktin rest R256 identifierats i tre humana aktin isoformer antyder denna aminosyra spelar en viktig roll i reglerande interaktioner. Effekterna av aktin mutationen R256H på cytoskelettala rörelser studerades med hjälp av jästmodellen. Proteinet, Aip1, som är känd för att hjälpa till kofilin i aktin depolymerisation, vartaggade med grönt fluorescerande protein (GFP) vid N-terminus och spåras in vivo med användning TIRF mikroskopi. Hastigheten för Aip1p rörelse i både vildtyp-och mutantstammar kvantifierades. I celler som uttrycker R256H mutant aktin, är Aip1p rörelse begränsas och rörelsehastigheten är nästan hälften av den uppmätta i vildtyp celler (0,88 ± 0,30 ìm / sek i R256H celler jämfört med 1,60 hastigheten ± 0,42 nm / sek i vildtyp celler, p <0,005).
Introduction
Aktin är det dominerande proteinet består av cytoskelettet och deltar i viktiga cellulära processer, inklusive celldelning, organeller rörelse, cellmotilitet, kontraktion, och signalering. Under det senaste årtiondet har sjukdomsframkallande mutationer i aktin upptäckts i var och en av de sex mänskliga aktin isoformer som leder till en rad olika sjukdomar, från myopatier till kranskärlssjukdom 1-7. De processer genom vilka aktin mutationer leder till sjukdomar fortsätter att belysas. Jästen modellen fortfarande den gyllene standarden för att studera de biokemiska effekter av mutationer på aktin funktion på grund av fördelarna med den enda väsentliga aktin isoform, genetisk spårbarhet och hög bevarande av aktin sekvens och funktion. Studier visar att enskilda aktin mutationer leder till molekylära specifika dysfunktioner med dominanta negativa effekter 8. Till exempel dövhet framkallande mutationer i γ-non-muskel aktin som påverkar Lys-118 rest ändra regleringen avaktin bindande protein Arp2 / 3 9. Studier anställer ofta in vitro analyser av protein: protein interaktioner. Undersökningar av effekten av aktin mutationer på cellbiologi och, i synnerhet, aktinbindande protein lokalisering i cellen är begränsade.
Studier av jästen cytoskelettet in vivo förlitar konventionellt på bilder av fasta celler från ett inverterat fluorescensmikroskop 10. Dessa experiment levereras grundläggande data om morfologi aktin cytoskelettet. Undersökningar har sedan införlivats tredimensionell konfokal avbildning för att visualisera komplexa cytoskeletal nätet 11, 12. Denna avbildning möjliggör kvantifiering av överflödet och relativa placering av aktin patchar och filament. Tunna avsnitt elektron tomografi har använts för att bilden morfologi de täta trådformiga nätverk relativt bevarade subcellulära strukturer 13. Trång cellulära stakt med ett litet tvärsnitt kan undersökas i fina detaljer med denna teknik. Imaging studier har utvidgats till att levande celler med intervall fluorescerande mikroskopi. När fotoblekning och bakgrundsfluorescens kan modereras, möjliggör tidsförlopp avbildning undersökningar om dynamiken i cytoskelettproteiner och svar på miljöförhållanden 11, 14. Separat sattes visualisering av dynamiken hos aktinfilament in vitro avancerat genom införandet av total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Jämfört med brett fält mikroskopi, har TIRF fördelen av minskade bakgrundsfluorescens och förbättrad kontrast för att övervaka individuella filament 15, 16. Med dessa egenskaper har TIRF mikroskopi anpassats av cellbiologer att övervaka cellulära strukturer på plasmamembranet 17, 18. Cellulära händelser, inklusive förändring i cytoskelettet, kanvisualiseras i realtid med låg fototoxicitet, maximal kontrast och minimal bakgrunds blomningstid 19.
För att bättre förstå effekten av aktin mutationer på rörelsen, lokalisering, och omsättningen av cytoskelettproteiner i cellen, TIRF mikroskopi och proteintaggning användes. Häri finns metoder för att studera effekterna av en kliniskt relevant mutation i aktin på cytoskelettala dynamik i Saccharomyces cerevisiae beskrivs. Specifikt lokalisering och rörelse aktin bindande protein, Aip1p, visualiserades och kvantifieras i celler som uttrycker R256H-mutationen i aktin. Dessa tekniker komplement in vitro biokemiska studier och möjliggöra en större förståelse för proteininteraktioner och funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning in i PB1996 Plasmid
- Design och beställa DNA-primers från en oligonukleotid tillverkande företag som flankerar målsekvensen och innehåller unika restriktionsställen i den utvalda huvud plasmiden. OBS: I detta fall var primrar utformade för att amplifiera 400 baspar vid 5'-änden av den Aip1 sekvensen. Xhol-restriktionsställe infördes i primern omkring 20 bp före Aip1 sekvensen och Xmal ingick cirka 20 bp efter det att målet Aip1 sekvensen. Den plasmid som användes för kloning var PB1996, som innehåller en 3XGFP tagg för fluorescens, en URA-genen för selektion jäststam, och en ampicillinresistensgen för bakteriell val.
- Rena genomiskt DNA från en Ura-jäst haploida stammen. Obs: Se Figur 1 för ett diagram över kloningsprocess.
- Kör en standard PCR-reaktion med användning av de två primers och jäst genomiskt DNA för att amplifiera Aip1p genen med restriktionsställen på sig antingend. Digerera PCR-produkten och den PB1996 plasmiden med restriktionsenzymer i separata reaktioner per tillverkare rekommenderade protokoll. I detta fall användes Xmal och Xhol med bifogade buffert vid 37 ° C under 1 timme.
- Kör ett 0,8% agaros-elektrofores gelén för att separera de kluvna DNA-fragment. I en brunn, ladda en låg DNA mass stege och, i separata brunnar, ladda hela reaktionen från varje matsmältningen. Kör gelen vid 100 volt under ca 1 timme, tills färgen är nära slutet av gelén. Visualisera gelén under ett UV-ljus och rena ut det segment som motsvarar det proteinsegmentet och den skurna plasmiden.
- Ligera digere Aip1 segmentet och PB1996 plasmid. Omvandla produkten till DH5a-celler med användning av tillverkarens protokoll (10 | il DNA med 100 | il celler under 30 min på is, värmechock vid 42 ° C under 2 min, växa i SOC-media under 2 h vid 37 ° C) och plattan på odlingsplattor att innefatta antibiotikum för selektion, i detta fall LB +Amp-plattor. Välj och växa en koloni i flytande kultur. Rena nydesignade plasmiden.
2. Mutant jäststam i Generation
- Använd en haploid jäststam i vilken aktin allelen har raderats för att bygga upp en mutant jäststam. OBS: I detta fall moderstammen var en generös gåva från Dr Peter Rubenstein (University of Iowa) och byggandet beskrevs av Cook et al 20 Denna stam saknar kromosomala aktin genen och innehåller en plasmid som kodar för vildtyp jäst. aktin och uracil.
- Använd pRS plasmid som kodar vildtyp jäst aktin med ett Trp + val som bas plasmid för mutagenes 21.
- Genomför riktad mutagenes på pRS plasmiden att konstruera den missense mutation i aktin.
- För R256H-mutationen i aktin, gör primern 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' för att ändra Arg 256 till hans 256. Kör en standardmutagenesPCR-reaktionen med plasmiden från steg 2,2.
- Förvandla den muterade aktin plasmiden från PCR in i DH5a-celler. Isolera plasmid-DNA och sekvensera aktingenen för att kontrollera mutationen.
- Förvandla den plasmid som kodar mutant jäst aktin i den haploida jäststam från steg 2.1.
- Kultur de transformerade cellerna på TRP-plattor för att selektera för jäst innehåller Trp + innehåller mutant jäst aktin plasmid.
- Välj för celler som saknar den ursprungliga plasmid som kodar för vildtyp aktin och uracil (beskrivet i 2.1) genom att sub-odling av celler från TRP-skyltar på plattor som innehåller 5-fluororotsyra (5-FOA). 5-FOA omvandlas till giftiga formen, 5-flurouracil, i yeas stammar som uttrycker den funktionella URA3-genen. De celler som växer efter stegvis val kommer att innehålla endast den muterade aktin plasmiden.
- Rena den plasmid-DNA från den nya jäststammen. Sekvensera plasmid för att säkerställa den mutanta aktin-genen är närvarande. Använd denna sträna i fortsatta studier. Denna process är schematiskt i figur 2.
3. Att omvandla plasmiden i jästceller
- Digerera Aip1p-GFP-plasmiden med ett restriktionsenzym för att möjliggöra integration i jästkromosomen. OBS:-restriktionsställe måste vara utanför den sekvens block som innehåller den fluorescerande etikett, genen av intresse och selektionsmarkören. I så fall, använd 1 l av Hpal restriktionsenzym med 8 l DNA och 1 l av den medföljande 10x buffert under 1 timme vid 37 ° C.
- Kultur S. cerevisiae-celler (från steg 2,5) som är oförmögen att syntetisera uracil (Ura-stam) över natten i 5 ml i YPD-medium (1% jästextrakt, 2% pepton och 2% dextros) på ett hjul vid 30 ° C. Centrifugera ner 1 ml av cellerna under 5 min vid 1000 x g..
- Gör PLATE blandning. Gör 10XTE genom tillsats av 5 ml 1 M Tris pH 7,5 och 2 ml av 250 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 43 ml DDH 2 O. Lägg 00,204 g litium-acetat till 20 ml av 1XTE, därefter 8 g polyetylenglykol (PEG) (MW ~ 3300) och filtrera sterilisera.
- Dekantera supernatanten från cellerna centrifugerades ned i steg 3,2 och resuspendera cellerna i den återstående vätskan. Till de suspenderade cellerna, tillsätt 2 l av 10 mg / ml lax testiklar bärar-DNA. Tillsätt 10 l av den smälta plasmid-DNA från steg 3.1 och virvel. Lägg till 0,5 ml av plattan och skaka. Tillsätt 20 ul av 1 M DTT och skaka.
- Inkubera blandningen under 6-8 timmar vid 25 ° C. Värmechock cellerna i ett vattenbad vid 42 ° C under 10 min. Plate 100 pl av cellerna från botten av mikrocentrifugrör där de har bosatt sig ut på en-Ura-platta. Inkubera vid 30 ° C under 2-3 dagar eller till dess att kolonier form.
- Välj enskilda kolonier och strimma ut på en-Ura platta. OBS: Dessa celler innehåller plasmiden med Aip1-GFP och Ura-genen integrerad i kromosomen, vilket möjliggör tillväxt. Dessa celler kommer sedan att användas i microscopy.
4. Visualisera Aip1p Protein rörelsen Använda Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi
- Odla en kultur av jästcellerna med den inkorporerade Aip1p-GFP i YPD över natten på ett hjul vid 30 ° C. Subkultur 1 ml av natten kultur i 9 ml-Ura media. Odla cellerna under ytterligare 3-4 h på en skakapparat vid 30 ° C för att säkerställa att de är i log-tillväxtfasen.
- Lägg 3 | il av celler till en glasmikroskopskiva och lägga ett täckglas. Låt cellerna sedimentera på sliden under 5 min. Placera bilden i fästet på scenen plattan.
- Observera Aip1p-GFP-proteinet med en total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskop (488 nm) med hjälp av en oljeimmersions 100X TIRF objektiv och en digital CCD-kamera. Med hjälp av Slidebook 5,0 programvara, få bilder för 20 sekunder med en hastighet på 5 bilder / sek (Individuella ramar av förvärvade bilderna presenteras i figur 2A).
- Att fokusera på calnar, öppna Slidebook 5,0 programvara och klicka på knappen Fokus Fönster i verktygsfältet för att komma åt kontrollerna fokus. Välj fliken Scope och välj 100X-TIRF mål. Vrid lampan på och skjut lampan bar till 15%. Ändra inställningen Bin till 2 x 2. Byt filter på ljusa fält.
- På mikroskop, använder fina fokusratten för att bringa cellerna i fokus som kan ses på datorskärmen.
- Använda kontrollerna inom fokusfönstret stänger av lampan, byta filter för att leva, och klicka på TIRFM knappen.
- På TIRFM belysningen sitter på höger sida hamnen i mikroskop, vrid lasern utsläpp till On.
- Välj fliken Stream inom fokusfönstret, markera rutan bredvid för att starta inspelningen och sedan på fältknappen ljus.
- Å TIRFM illuminator vrider mikrometer för att justera infallsvinkeln för lasern. Detta används för att optimera fluorescensemissionen från Aip1-GFP foci och minimera bakgrundsfluorescens frånceller och bildspel.
- När önskad bild visas trycker du på Start. Efter 20 sekunder, trycker du på Stopp. Spara bilderna. Under fliken Arkiv i menyraden, välj Spara bild som och ange filens plats och namn.
- Använd ImageJ mjukvara för att analysera bilderna. Använd makro plugin "Manuell Tracker" för att följa utvecklingen och graden av det fluorescerande Aip1p härdar. Ändra tidsintervallet parametern till 0,2 sek.
- Med hjälp av urvals add spår, välja och spåra ett enskilt fluorescerande protein genom 4-8 bind ramar. Använd kommandot slutspåret och hastigheten av proteinrörelse mellan varje bild visas i ett resultatfönster.
- Bestäm medelhastigheten mellan varje bildruta med hjälp av en Microsoft Excel-kalkylblad. Använd värdena för att beräkna den genomsnittliga hastigheten hos Aip1p rörelse för varje cellstam av intresse. NOTERA: Ett spridningsdiagram av hastigheten för Aip1p rörelse och det genomsnittliga icke-linjär hastighet visas i Figure 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En metod för att avbilda dynamiken i cytoskelettala proteiner i cellen presenteras. Den aktin-bindande protein, Aip1p blev taggade med GFP. Designen för den plasmid som kodar för den märkta produkten visas i Figur 1. Plasmiden transformerades sedan in i jästceller. Expression av den fluorescensmärkta Aip1p tillåtet visualisering av proteinet beteende i cellen. Aip1p lokaliserar vanligtvis till aktin fläckar på platser av endocytos 22. För att kvantifiera Aip1p rörelse, var mer än 50 fluorescerande Aip1p foci spåras i mer än 10 celler, såsom visas i figur 2A. Medelhastigheten beräknas för varje fluorescerande Aip1p område (se Figur 2B). I vildtypsceller, Aip1p rörelser övergriper en cell, och sedan försvinner. Den genomsnittliga hastigheten för rörelsen av Aip1p i vildtyp celler är 1,60 ± 0,42 ìm / sek. Celler som uttrycker R256H mutant aktin, känd för att ha onormal morfologi av aktin cytoskeleton 23, har en förändrad Aip1p fenotyp. I den muterade stammen, är Aip1p rörelse begränsad och långsammare. Medelhastigheten för Aip1p rörelsen är 0,88 ± 0,30 nm / sek (p <0,005). Den Aip1p migration är begränsad till närområdet, med fokus cirklar runt varandra snarare än att korsa cellen. Dessutom är Aip1p syns längre tyder på lägre omsättning på Aip1 protein.
Figur 1. Diagram av plasmid-konstruktion. A) Aip1 fragmentet amplifierades via PCR visas som smälts av restriktionsenzymer (gula bultar). B) Plasmiden, PB1996, digereras med restriktionsenzymer för att avlägsna Abp140 genen. C) Det digere Aip1 och PB1996 fragmenten ligeras to bilda plasmiden PB1996 Aip1. D) Den PB1996 Aip1 plasmiden är linjäriserade och omvandlas till jästceller där DNA integreras i kromosomen.
Figur 2. Diagram av mutant jäst aktin stamkonstruktion. Plasmiden som kodar för den mutanta aktin isoformen transformeras sedan in i en cellinje och väljas baserat på förmågan att växa på media som saknar tryptofan. De gröna linjerna indikerar kromosomala DNA. Den svarta cirkeln är en plasmid. Den bruna cirkeln representerar en jästcell. Lådorna var och anger en specifik gen: gul är aktin, orange leucin, brunt är uracil, och rosa är tryptofan. X över rutan indikerar genen har tagits bort från kromosomalt DNA. I steg 2.3 och 2.4, den svarta stjärnan på aktingenen jagndicates den R256H mutationen.
Figur 3. Aip1p-GFP rörelse i levande jästceller. A) Bilder av vildtyp och R256H celler som uttrycker GFP-tagged Aip1p visas. Cellerna är i tidig logfastillväxt och bilder förvärvades var 0,2 sek efter 15 sek. Pilarna anger placeringen av en enskild fluorescerande fokus över tiden, blå för vildtyp och röd för mutanta aktin-stammar. Den sista bilden visar sökvägen till Aip1 foci som en grön linje. Skala bar som visas är 5 um. B) Graden av Aip1p rörelse mättes med ImageJ. Den spridningsdiagram grafen visar hastigheten för enskilda fluorescerande foci. Den horisontella stapeln visar medelhastigheten för vildtypen (blå) och mutant (röd) aktin stammar.Aip1p rör sig 1,60 ± 0,42 ìm / sek i vildtyp celler jämfört med 0,88 ± 0,30 ìm / sek för celler som uttrycker R256H mutant aktin (p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En effektiv strategi för att visualisera dynamiken i cytoskelettet och nyttan i utredningar om patogena mutationer har beskrivits här. Avancerade avbildningsmetoder har skapat nya möjligheter att förstå den intracellulära rörelsen av proteiner nära cellmembranet. Total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRF) är en känslig teknik för funktionella studier i levande celler. TIRF använder en vinklad excitation laser som skapar ett evanescent fält på grund av skillnaden i brytningsindex för täckglas och vattenhaltigt medium. Energin hos det evanescenta fältet exciterar fluoroforer men minskar exponentiellt med avståndet från gränsytan mellan täckglas och vatten. Detta resulterar i ett högt signal-brusförhållande och kraftfull upplösning 50-250 nm ovanför täck / medel gränssnitt. Dessa egenskaper gör TIRF mikroskopi ett kraftfullt verktyg för att visualisera cytoskelettproteiner vid enda molekyl nivå i levande celler med mindrefototoxicitet och förbättrad kontrast i förhållande till andra tekniker 24-26.
Cytoskelettet innebär många proteiner som arbetar i samförstånd för att anpassa sig till cellulära behov. Effekten av kärl-sjukdom som orsakar mutationer i aktin på reglering av kofilin nyligen studerats av vår grupp 27. Baserat på våra första resultaten, var Aip1p, en aktin-bindande protein som underlättar kofilin beroende aktin avskärande, utreds. I preliminära studier, celler som uttrycker aktin-mutationen R256H växa dåligt i frånvaro av Aip1p, i synnerhet under stressförhållanden. Detta tyder på att Aip1p reglering av den mutanta aktincytoskelettet ändras. Våra analyser av rörelsen och lokalisering av Aip1p i R256H stammen med hjälp av fluorescerande märkning och TIRF mikroskopi bekräftar de onormala dynamik. I framtiden planerar vi att märka ytterligare proteiner, såsom kofilin, med olika fluoroforer att visualisera flödet av flera proteinersamtidigt för att bättre förstå protein: protein interaktioner.
Det finns vissa begränsningar för att generera en fluorescerande taggade protein och några fall där tekniken inte är möjlig. En fluorescerande markör kan störa aktiviteten för proteinet eller förändra växelverkan med bindningspartners. Detta har stött på i försök att tagga kofilin, en annan aktin bindande protein. Redovisning av taggade konstruktionen har tappat målet i haploid jäst på grund av störd kofilin funktion. Kofilin är ett viktigt protein i jäst. Således är strykningen av kofilin utan samtidig återinförande dödliga; spärra senare införande på en plasmid. Ett sätt att undvika denna begränsning är att använda diploid jäst. Ett exemplar av kofilin genen slås ut, en taggad version exogent introducerades på en plasmid, och efter det val till dotterceller som saknar genomisk kofilin men innehåller plasmiden 22 Förmågan att fluorescerande märka proteinet varvunnits genom att lägga till taggen till interna rester i proteinet som tidigare visat sig ha liten inverkan på dess protein-protein-interaktioner. Den N-eller C-terminalen är att föredra platser att lägga taggen om inte regionerna är kända för att påverka relevant protein: protein interaktioner. Om detta inte resulterar i ett funktionellt protein, kan den alternativa terminalen eller interna rester försökas.
Det finns några viktiga steg i genomförandet av de tekniker som beskrivs. En är att bestämma lämplig plats för att märka det protein som bevarar funktion. Robusta kontroller måste ingå för att validera att proteiners funktion bevaras. För det andra måste glid övervakas för att säkerställa att cellerna torka inte ut under avbildning. Vax kan användas runt kanterna på täckglas för att förhindra uttorkning om det behövs. Dessa åtgärder för att säkerställa framgång är enkla att göra detta tillvägagångssätt lätthanterlig och fördelaktigt att bildstrukturer nära plasmamembranet. Förmågan att quantify protein lokalisering och rörelse i levande celler kan öka förståelsen av cellulära funktioner. Eftersom mutationer som påverkar cytoskelettproteiner identifieras, uttryck av fluorescerande taggade proteiner och TIRF mikroskopi kan vara bra att undersöka patofysiologi underliggande mänskliga sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Peter Rubenstein för nyttig diskussion och teknisk rådgivning och David Pellman för den ursprungliga PB1996 klon. Detta arbete stöddes av ett bidrag från March of Dimes och finansiering från Ride för ungarna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
