Summary
Ziekte-veroorzakende mutaties in actine kan cytoskelet functie veranderen. Cytoskelet dynamiek worden gekwantificeerd door beeldvorming van fluorescent gelabelde eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie microscopie. Als voorbeeld heeft het cytoskelet eiwit Aip1p, lokalisatie en beweging gewijzigd cellen die de mutant actine isovorm, R256H.
Abstract
Mutaties in actine leiden tot een scala van menselijke ziekten door specifieke moleculaire veranderingen die vaak veranderen cytoskelet functie. In deze studie, weergave van fluorescent gemerkte eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie (TIRF) microscopie gebruikt visualiseren en kwantificeren veranderingen in het cytoskelet dynamiek. TIRF microscopie en het gebruik van fluorescente markeringen maakt ook de kwantificering van veranderingen in het cytoskelet dynamica veroorzaakt door mutaties in actine. Met deze techniek kwantificering van cytoskelet functie in levende cellen een waardevolle aanvulling in vitro studies van eiwitfunctie. Als voorbeeld hebben missense mutaties die de actine residu R256 geïdentificeerd in drie humane actine isovormen suggereert dit aminozuur een belangrijke rol speelt regulerende interacties. De effecten van het actine cytoskelet mutatie R256H op bewegingen werden bestudeerd door gistmodel. Het eiwit, Aip1, waarvan bekend is dat cofilin helpen actine depolymerisatie wasgelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP) en de N-terminus en bijgehouden in vivo in TIRF microscopie. De snelheid van Aip1p beweging in beide wild-type en mutante stammen werd gekwantificeerd. In cellen die R256H mutant actine, wordt Aip1p beweging beperkt en de snelheid van de beweging is bijna de helft van de snelheid gemeten in wild-type cellen (0,88 ± 0,30 micrometer / sec in R256H cellen in vergelijking tot 1,60 ± 0,42 micrometer / sec in wild-type cellen, p <0,005).
Introduction
Actine is de dominante eiwit dat het cytoskelet en participeert in kritieke cellulaire processen zoals celdeling, organel beweging, celbeweeglijkheid, krimp, en de signalering. In het afgelopen decennium, hebben ziekteverwekkende mutaties ontdekt actine in elk van de zes menselijke actine isovormen die tot een reeks van aandoeningen, van myopathieën coronaire hartziekte 1-7. De processen waardoor actine mutaties leiden tot ziekte verder worden toegelicht. De gist model blijft de gouden standaard voor de biochemische effecten van mutaties op actine functie vanwege de voordelen van de interne essentiële actine isovorm, genetische traceerbaarheid en hoge behoud van actine sequentie en functie te bestuderen. Studies tonen aan dat individuele actine mutaties leiden tot moleculaire specifieke disfuncties met dominant negatieve effecten 8. Bijvoorbeeld,-doofheid veroorzaken mutaties in γ-niet-spieractine dat de Lys-118 residu beïnvloeden veranderen regulering doorhet actine bindend eiwit Arp2 / 3 9. Studies vaak te gebruiken in vitro analyses van eiwit: eiwit interacties. Onderzoeken naar het effect van actine mutaties celbiologie en met name actine bindend eiwit lokalisatie in de cel beperkt.
Studies van de gist cytoskelet in vivo gewoonlijk afhankelijk beelden van gefixeerde cellen van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop 10. Deze experimenten verstrekte fundamentele gegevens over de morfologie van het actine cytoskelet. Onderzoeken hebben sindsdien opgenomen driedimensionale confocale beeldvorming om de complexe cytoskelet netwerk 11, 12 te visualiseren. Deze beeldvorming maakt kwantificering van de overvloed en de relatieve locatie van actine patches en filamenten. Dunne gedeelte electron tomography is gebruikt om het imago van de morfologie van de dichte draadvormige netwerken ten opzichte van bewaarde subcellulaire structuren 13. Crowded cellulaire spassen met een kleine doorsnede kan tot in detail worden onderzocht met deze techniek. Imaging studies zijn uitgebreid tot levende cellen met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie. Wanneer foto bleken en achtergrond fluorescentie kunnen worden gemodereerd, time lapse imaging laat onderzoeken met betrekking tot de dynamiek van het cytoskelet eiwitten en de reactie op omgevingsfactoren 11, 14. Afzonderlijk visualisatie van de dynamiek van actine filamenten in vitro werd bevorderd door de invoering van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Vergeleken met brede microscopie, TIRF het voordeel van verminderde achtergrondfluorescentie en verbeterd contrast individuele filamenten 15, 16 volgen. Met deze kwaliteiten, is TIRF microscopie is aangepast door celbiologen om cellulaire structuren controleren bij de plasmamembraan 17, 18. Cellulaire gebeurtenissen, waaronder veranderingen in het cytoskelet, kangevisualiseerd worden real time met lage fototoxiciteit, maximale contrast en minimale achtergrond bloei 19.
Om een beter begrip van het effect van actine mutaties op de beweging, lokalisatie en omzet cytoskelet eiwitten in de cel, TIRF microscopie en eiwit tagging gebruikt. Hierin methoden om het effect van een klinisch relevante mutatie in actine cytoskelet van dynamica in Saccharomyces cerevisiae wordt beschreven. Bijzonder de lokalisatie en beweging van het actine bindend eiwit, Aip1p, werd gevisualiseerd en gekwantificeerd in cellen die de R256H mutatie in actine. Deze technieken vullen in vitro biochemische studies en zorgen voor een beter begrip van eiwit interacties en functies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonering in de PB1996 Plasmide
- Ontwerpen en bestellen DNA primers van een oligonucleotide productiebedrijf dat de doelsequentie flankeren en bevatten unieke restrictie sites in de gekozen basismotor plasmide. Opmerking: In dit geval primers werden ontworpen voor het 400 basenparen amplificeren einde de Aip1 de sequentie 5 '. De Xhol restrictie plaats werd in de primer verwerkt ongeveer 20 bp voor de Aip1 sequentie en XmaI werd opgenomen ongeveer 20 bp na het doelwit Aip1 volgorde. Het plasmide gebruikt voor het klonen was PB1996, die een 3XGFP tag voor fluorescentie, een URA gen voor giststam selectie, en een ampicillineresistentiegen voor bacteriële selectie bevat.
- Zuiver het genomisch DNA van een Ura-gist haploïde stam. Opmerking: Zie Figuur 1 voor een diagram van klonen.
- Voer een standaard PCR-reactie met de twee primers en de gist genomisch DNA om de Aip1p gen amplificeren met de restrictieplaatsen aan beide end. Verteren van het PCR-product en de PB1996 plasmide met de restrictie-enzymen in afzonderlijke reacties per fabrikant aanbevolen protocollen. In dit geval Xmal en Xhol werden gebruikt met de bijbehorende buffer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Voer een 0,8% agarose gel elektroforese om de gedigereerde DNA-fragmenten te scheiden. In een goed, laadt een lage DNA massa ladder en, in afzonderlijke putten, laadt u de hele reactie van elke spijsvertering. Laat de gel bij 100 volt gedurende 1 uur, totdat de kleurstof voorkant is aan het einde van de gel. Zichtbaar de gel een UV licht en zuiveren uit het segment dat overeenkomt met de eiwitsegment en gesneden plasmide.
- Ligeren de verteerde Aip1 segment en PB1996 plasmide. Transformeer het product in DH5a cellen met protocollen van de fabrikant (10 pl DNA met 100 ul cellen gedurende 30 min op ijs, hitteschok bij 42 ° C gedurende 2 min, groeien in SOC-medium gedurende 2 uur bij 37 ° C) en plaat op kweekplaten dat het antibioticum Voor selectie, in dit geval LB +Amp platen. Selecteren en te groeien een kolonie in vloeibare cultuur. Zuiver het nieuw ontworpen plasmide.
2. Mutant giststam Generation
- Gebruik een haploïde giststam waarin de actine allel is verwijderd een mutante giststam bouwen. Opmerking: In dit geval, de stam was een gulle gift van Dr Peter Rubenstein (Universiteit van Iowa) en de constructie is beschreven door Cook et al. 20 Deze stam mist het chromosomale actine-gen en bevat een plasmide dat wildtype gist codeert. actine en uracil.
- Gebruik de pRS plasmide coderend voor wild-type gist actine met een Trp + selectie als basis plasmide voor mutagenese 21.
- Voer plaatsgerichte mutagenese de pRS plasmide de missense mutatie in actine ingenieur.
- Voor de R256H mutatie in actine, maken de primer 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' van de Arg 256 veranderen naar Zijn 256. Voer een standaard mutagenesePCR reactie met het plasmide uit stap 2.2.
- Transformeer de mutant actine plasmide uit de PCR in DH5a cellen. Isoleer het plasmide-DNA sequentie en de actine-gen de mutatie controleren.
- Transformeer het plasmide dat codeert voor mutant gist actine in de haploïde giststam uit stap 2.1.
- Cultuur de getransformeerde cellen op Trp-platen om te selecteren voor gist met de Trp + met mutant gist actine plasmide.
- Selecteren op cellen die niet de originele plasmide dat wild type actine en uracil (in 2.1 beschreven) codeert door sub-kweken van cellen van de Trp-platen op platen die 5-fluororotinezuur (5-FOA) bevatten. 5-FOA wordt omgevormd tot de toxische vorm, 5-flurouracil, in yeas stammen die het functionele URA3-gen. De cellen die groeien na de stapsgewijze selectie zal alleen de mutant actine plasmide bevatten.
- Zuiver het plasmide DNA van de nieuwe giststam. Sequence het plasmide te zorgen voor de mutante actine gen aanwezig is. Gebruik dit strainen in verdere studies. Dit proces wordt schematisch weergegeven in figuur 2.
3. Omzetting van het plasmide in gistcellen
- Verteren de Aip1p-GFP plasmide met een restrictie-enzym om de integratie mogelijk te maken in de gist chromosoom. OPMERKING: De beperking site moet worden buiten de sequentie blok dat de tl-tag, gen van belang, en de selectie marker bevat. In dit geval gebruikt 1 ui restrictie-enzym HpaI met 8 pi DNA en 1 pi van de begeleidende 10x buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Cultuur S. cerevisiae cellen (uit stap 2.5) dat geen uracil (Ura-stam) overnacht synthetiseren in 5 ml YPD medium (1% gistextract, 2% pepton en 2% dextrose) op een wiel bij 30 ° C zijn Verminderde snelheid 1 ml van de cellen gedurende 5 min bij 1000 x g.
- Maak PLAAT mengsel. Voeg 10XTE door toevoeging van 5 ml van 1 M Tris pH 7,5 en 2 ml van 250 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) aan 43 ml van DDH 2 O. 0 Voeg0,204 g lithium acetaat 20 ml 1XTE dan 8 g polyethyleenglycol (PEG) (MW ~ 3300) en filter steriliseren.
- Schenk de supernatant van de cellen afgedraaid in stap 3.2 en resuspendeer de cellen in de resterende vloeistof. De gesuspendeerde cellen, voeg 2 ui 10 mg / ml zalm testes drager DNA. Voeg 10 ul van de gedigereerde plasmide DNA uit stap 3.1 en vortex. Voeg 0,5 ml van de plaat en vortex. Voeg 20 ul van 1 M DTT en vortex.
- Incubeer het mengsel gedurende 6-8 uur bij 25 ° C. Heat shock de cellen in een waterbad bij 42 ° C gedurende 10 minuten. Plaat 100 pl cellen van de bodem van de microcentrifugebuis waar ze zijn uitgerold op een-Ura plaat. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen of totdat kolonies vormen.
- Selecteer individuele kolonies en streak uit op een-Ura plaat. OPMERKING: Deze cellen bevatten het plasmide met de Aip1-GFP en Ura gen geïntegreerd in het chromosoom, waardoor de groei. Deze cellen worden vervolgens gebruikt microscopy.
4. Visualiseren van de Aip1p Eiwit Beweging Met behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie
- Kweek een kweek van de gistcellen met de opgenomen Aip1p-GFP YPD overnacht op een wiel bij 30 ° C. Subcultuur 1 ml van de kweek van een nacht over in 9 ml-Ura media. Kweek de cellen nog eens 3-4 uur op een schudinrichting bij 30 ° C zodat ze log groeifase.
- Voeg 3 ul van cellen om een glas microscoop glijbaan en voeg een dekglaasje. Laat de cellen om zich te vestigen op de dia gedurende 5 minuten. Plaats de dia in de beugel van het podium plaat.
- Let op de Aip1p-GFP-eiwit met een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop (488 nm) met behulp van een olie-immersie 100X TIRF doelstelling en een digitale CCD-camera. Met SlideBook 5.0 software afbeeldingen voor 20 seconden verkrijgen met een snelheid van 5 beelden / sec (Onafhankelijke frames van verkregen beelden zijn weergegeven in figuur 2A).
- Te richten op de cellen, geopend SlideBook 5.0-software en klik op de knop Focus Venster in de werkbalk om toegang te krijgen tot de focus controles. Selecteer het tabblad Bereik en selecteer de 100X-TIRF doelstelling. Zet de lamp aan en zet de lamp bar tot 15%. Verander de Bin instelling in 2 x 2. Filter Wissel naar helder veld.
- Op de microscoop, gebruik het scherpstellen draaiknop om de cellen in beeld te brengen zoals te zien op het computerscherm.
- Met behulp van de controles binnen de Focus venster, zet de lamp uit, verander de filter te leven, en klik op de knop TIRFM.
- Op de TIRFM hulplicht aan de rechter kant poort van de microscoop, draait u de laser emissie naar On.
- Selecteer het tabblad Stroom binnen de Focus venster, vinkt u het vakje naast de opname te starten en klik vervolgens op helder veld knop.
- Op de TIRFM hulplicht, draai de micrometer om de invalshoek van de laser aan te passen. Dit wordt gebruikt om de fluorescentie-emissie te optimaliseren van de Aip1-GFP foci en het minimaliseren van de achtergrond fluorescentie van decellen en glijbaan.
- Wanneer het gewenste beeld wordt weergegeven, drukt u op Start. Na 20 sec, drukt u op Stop. Sla de beelden. Selecteer op het tabblad Bestand op het hoofdmenu Slide Opslaan als en geef het bestand locatie en naam.
- Gebruik ImageJ software om de beelden te analyseren. Gebruik de macro-plugin "Manual Tracker" om de beweging en de snelheid van de fluorescerende Aip1p brandpunten volgen. Het tijdsinterval parameter tot 0,2 sec.
- Met behulp van de add-track selectie, selecteren en volgen een individueel fluorescerend eiwit door 4-8 bindweefsel frames. Gebruik het eind spoor commando en de snelheid van eiwit beweging tussen elk frame wordt in een resultaat-venster weer te geven.
- Bepaal de gemiddelde snelheid tussen elk frame met behulp van een Microsoft Excel spreadsheet. Gebruik de waarden van de gemiddelde snelheid van Aip1p beweging voor elke cel stam van rente berekenen. OPMERKING: Een scatter plot van de snelheid van Aip1p beweging en de gemiddelde niet-lineaire snelheid wordt weergegeven in Figure 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Werkwijze voor beeld de dynamiek van cytoskelet eiwitten in de cel wordt gegeven. De actine-bindend eiwit, Aip1p, werd gelabeld met GFP. Het ontwerp van het plasmide codeert het gelabelde product is weergegeven in Figuur 1. Het plasmide werd vervolgens getransformeerd in de gistcellen. Expressie van de fluorescent gelabeld Aip1p toegelaten visualisatie van het eiwit gedrag in de cel. Aip1p lokaliseert doorgaans naar actine plekken op plaatsen van endocytose 22. Om Aip1p beweging te kwantificeren, werden meer dan 50 fluorescente Aip1p foci bijgehouden in meer dan 10 cellen, zoals getoond in figuur 2A. De gemiddelde snelheid werd berekend voor elke fluorescerende Aip1p gebied (zie figuur 2B). In wild-type cellen, Aip1p bewegingen zich over een cel, en later verdwijnen. De gemiddelde snelheid van de beweging van Aip1p in wild-type cellen is 1,60 ± 0,42 micrometer / sec. Cellen die de R256H mutant actine, bekend om abnormale morfologie van de actine cy hebbentoskeleton 23, hebben een veranderde Aip1p fenotype. In de mutante stam, Aip1p beweging is beperkt en langzamer. De gemiddelde snelheid van Aip1p beweging 0,88 ± 0,30 um / sec (p <0,005). De Aip1p migratie beperkt tot de directe omgeving, met brandpunten omcirkelen rond elkaar plaats die de cel. Bovendien Aip1p zichtbaar langer suggereert langzamer omzet Aip1 eiwit.
Figuur 1. Schema van plasmide constructie. A) Aip1 fragment geamplificeerd via PCR wordt verteerd met restrictie-enzymen (geel bouten). B) Het plasmide, PB1996, werd met restrictie-enzymen om de Abp140 gen verwijderen. C) Het gedigereerde Aip1 en PB1996 fragmenten worden geligeerd to vormen het plasmide PB1996 Aip1. D) De PB1996 Aip1 plasmide gelineariseerd en getransformeerd in gist cellen waarin het DNA is geïntegreerd in het chromosoom.
Figuur 2. Schema van mutante stam gist actine constructie. Het plasmide codeert voor de mutante actine isovorm wordt dan omgezet in een cellijn gekozen gebaseerd op het vermogen om te groeien op medium zonder tryptofaan. De groene lijnen geven chromosomaal DNA. De zwarte cirkel is een plasmide. De bruine cirkel stelt een gistcel. De boxen geven elk een specifiek gen: geel is het actine, oranje is leucine, bruin is uracil, en roze is tryptofaan. De X in het vakje geeft gen is verwijderd uit het chromosomale DNA. In de stappen 2.3 en 2.4, de zwarte ster op de actinegen indicates de R256H mutatie.
Figuur 3. Aip1p-GFP beweging in levende gistcellen. A) afbeeldingen van wild-type en R256H cellen die GFP-gelabelde Aip1p worden getoond. Cellen zijn in de vroege log-fase groei en de beelden werden elke 0,2 sec verworven gedurende 15 sec. De pijlen duiden de locatie van een individu fluorescerende aandacht na verloop van tijd, blauw voor wild-type en rood voor mutante actine stammen. De laatste ziet u het pad van de Aip1 brandpunten als een groene lijn. Schaalbalk getoond is 5 micrometer B.) De snelheid van Aip1p beweging werd gemeten met behulp van ImageJ. De scatterplot grafiek geeft de koers voor individuele fluorescerende brandpunten. De horizontale balk geeft de gemiddelde snelheid voor het wild-type (blauw) en mutant (rood) actine stammen.Aip1p beweegt met 1,60 ± 0,42 micrometer / sec in wild-type cellen in vergelijking met 0,88 ± 0,30 micrometer / sec voor cellen die R256H mutant actine (p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een effectieve strategie om de dynamiek van het cytoskelet en de bruikbaarheid visualiseren onderzoeken op pathogene mutaties is beschreven. Geavanceerde beeldvormende technieken zijn er nieuwe mogelijkheden om de intracellulaire beweging van eiwitten in de buurt van het celmembraan begrijpen gecreëerd. Totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRF) is een gevoelige techniek voor functionele studies in levende cellen. TIRF gebruikt een schuine excitatie laser die een verdwijnende veld door het verschil in brekingsindices van het dekglaasje en waterig medium creëert. De energie van het verdwijnende veld wekt fluoroforen maar neemt exponentieel af met de afstand van de interface tussen het dekglaasje en water. Dit resulteert in een hoge signaal-ruisverhouding en krachtige resolutie 50-250 nm boven het dekglaasje / medium interface. Deze kwaliteiten maken TIRF microscopie een krachtig hulpmiddel om cytoskeleteiwitten visualiseren op een enkel molecuul in levende cellen met minderfototoxiciteit en verbeterd contrast ten opzichte van andere technieken 24 - 26.
Het cytoskelet bestaat talrijke eiwitten werken in overleg aan te passen aan cellulaire behoeften. Het effect van vasculaire ziekte-veroorzakende mutaties in actine op regulering door cofilin werd onlangs onderzocht door onze groep 27. Op basis van onze eerste bevindingen, Aip1p, een actine bindend eiwit dat cofilin-afhankelijke actine verbreken vergemakkelijkt, werd onderzocht. In preliminaire studies, cellen die de mutatie actine R256H slecht groeien in afwezigheid van Aip1p, vooral onder stress omstandigheden. Dit suggereert dat de Aip1p regulering van de mutant actine cytoskelet is veranderd. Onze analyses van de beweging en de lokalisatie van Aip1p in de R256H stam met fluorescerende tagging en TIRF microscopie bevestigt de abnormale dynamiek. In de toekomst zijn we van plan om extra eiwitten, zoals cofilin, taggen met verschillende fluoroforen om de beweging van meerdere eiwitten te visualiserentegelijkertijd beter te begrijpen het eiwit: eiwit interacties.
Er zijn beperkingen voor het genereren van een fluorescent gelabeld eiwit en enkele gevallen waarin de techniek niet mogelijk. Een TL-tag kan de activiteit van het eiwit te verstoren of te wijzigen de interactie met bindende partners. Dit werd ondervonden bij pogingen cofilin tag, een actine-bindend eiwit. Expressie van de gelabelde construct het ongelijk is gesteld in haploïde gist te wijten aan verstoorde cofilin functie. Cofilin een essentieel eiwit in gist. Zo schrapping van cofilin zonder gelijktijdige herintroductie is dodelijk; behoudens latere invoering op een plasmide. Een manier om deze beperking te vermijden is diploïde gist. Een kopie van de cofilin gen werd uitgeschakeld, een tag versie werd exogeen ingevoerd op een plasmide, en vervolgens selectie voor dochtercellen die genomische cofilin missen, maar bevatten het plasmide 22 De mogelijkheid om fluorescent labelen het eiwit wasverkregen door het toevoegen van de tag interne residuen in het eiwit dat eerder aangetoond weinig invloed op de eiwit-eiwit interacties. De N-of C-terminus de voorkeur locaties die het label toe zonder de regio's bekend relevante eiwitten beïnvloeden: eiwit interacties. Als dit niet leveren een functioneel eiwit, kan de alternatieve terminus of interne residuen worden geprobeerd.
Er zijn een paar kritische stappen in de uitvoering van de beschreven technieken. Een daarvan is het bepalen van de juiste locatie aan de proteïne die functie bespaart taggen. Robuuste controles moeten worden opgenomen om te valideren dat eiwit functie behouden blijft. Ten tweede moet de schuif worden gecontroleerd om ervoor te zorgen de cellen niet uitdrogen tijdens de beeldvorming. Was kan worden gebruikt om de randen van het dekglaasje om uitdroging te voorkomen indien nodig. Deze stappen om succes te garanderen zijn eenvoudig te maken deze aanpak handelbaar en voordelig op de foto om structuren in de buurt van het plasmamembraan. De mogelijkheid om toe quantify eiwit lokalisatie en beweging in levende cellen kan begrip van cellulaire functies te verbeteren. Als mutaties die cytoskeleteiwitten worden geïdentificeerd, expressie van fluorescent gelabelde eiwitten en TIRF microscopie kan nuttig zijn om de pathofysiologie onderliggende ziekte bij de mens te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Peter Rubenstein voor nuttige discussie en technisch advies en David Pellman voor de originele PB1996 kloon. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de March of Dimes en de financiering van de Ride for the Kids.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
