Summary
アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。
Abstract
アクチンの変異は、多くの場合、細胞骨格の機能を変更する特定の分子変化によるヒト疾患の範囲を引き起こす。本研究では、全内部蛍光を用いて、蛍光タグ化タンパク質のイメージングは（TIRF）顕微鏡法は、細胞骨格の力学の変化を視覚化し、定量化するために使用される。 TIRF顕微鏡および蛍光タグの使用はまた、アクチンの突然変異によって引き起こされる細胞骨格の力学の変化の定量化を可能にする。この技術を用いて、生細胞中の細胞骨格機能の定量化は、常に時代のタンパク質機能のインビトロ研究で補完する。一例として、アクチン残基R256に影響するミスセンス変異は、このアミノ酸は、相互作用の調節に重要な役割を果たしている示唆して3つのヒトアクチンアイソフォームが同定されている。細胞骨格アクチンの運動に突然変異R256Hの効果は酵母モデルを用いて検討した。アクチン脱重合にコフィリンを補助することが知られているタンパク質、AIP1があったN-末端緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識しTIRF顕微鏡法を用いてインビボで追跡した。野生型および変異株の両方でAip1pの移動速度を定量化した。 R256H変異型アクチンを発現する細胞では、Aip1p運動は制限され、移動速度が1.60に比べR256H細胞で0.88±0.30ミクロン/秒（野生型細胞で測定されたほぼ半分の速度では±0.42、野生型細胞ではミクロン/秒、P <0.005）。
Introduction
アクチンは細胞骨格を構成する支配的なタンパク質であり、細胞分裂、細胞小器官の動き、細胞の運動性、収縮、およびシグナリングを含む重要な細胞プロセスに参加しています。過去10年間で、アクチンにおける疾患の原因となる変異は、筋障害の冠動脈疾患1-7に、障害の範囲につながる6ヒトアクチンアイソフォームの各々で発見されました。アクチン変異が疾患につながるそれによってプロセスが解明され続けています。酵母モデルは、単一の本質的なアクチンアイソフォーム、遺伝従順とアクチン配列及び機能の高い保存性の利点により、アクチン機能の変異の生化学的効果を研究するためのゴールドスタンダードのまま。研究では、個々のアクチン変異がドミナントネガティブ効果8との分子の特定の機能不全につながることを示している。たとえば、のLys-118残基に影響を与え、γ-非筋アクチンにおける難聴の原因となる変異はによって規制を変えるアクチン結合タンパク質ARP2 / 3 9。研究は、しばしば、インビトロで用いるタンパク質の分析：タンパク質相互作用。細胞中のタンパク質の局在化結合細胞生物学上のアクチン変異の効果の調査、特に、アクチンは限られている。
生体内での酵母細胞骨格の研究では、従来、倒立蛍光顕微鏡10からの固定された細胞の画像に依存しています。これらの実験は、アクチン細胞骨格の形態学についての基礎的なデータを提供しました。調査は複雑なので、細胞骨格網11,12を可視化する三次元共焦点イメージングを組み込んでいる。この撮影は、豊かさとアクチンパッチやフィラメントの相対的な位置の定量化を可能にします。薄いセクションの電子線トモグラフィーは保存細胞内構造13と比較して密な線維状のネットワークの形態画像に使用されてきた。混雑した携帯S小断面のペースは、この技術を用いて微粒子を詳細に調べることができる。イメージング研究は、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて生細胞に拡張されている。光退色およびバックグラウンド蛍光を緩和することができる場合には、タイムラプスイメージングは、細胞骨格タンパク質の動力学および環境条件11,14に対する応答として調べることができる。これとは別に、 インビトロでのアクチンフィラメントのダイナミクスの可視化は、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法を導入することにより進めた。広視野顕微鏡法と比較して、TIRFが減少バックグラウンド蛍光と個々のフィラメント15,16を監視するための造影という利点を有する。これらの特性により、TIRF顕微鏡法は、原形質膜17,18で細胞構造を監視するために、細胞生物学者によって適合されている。細胞骨格の変化を含む細胞事象、、することができます低光毒性、最大コントラスト、最小のバックグラウンド蛍光19でリアルタイムに可視化すること。
より良いセル、全反射顕微鏡およびタンパク質のタグ付けに動き、ローカリゼーション、および細胞骨格タンパク質のターンオーバーにアクチン変異の影響を理解するために使用された。ここで、 サッカロミセス·セレビシエにおける細胞骨格アクチン動態における臨床的に関連する突然変異の効果を研究するための方法が記載されている。具体的には、アクチン結合タンパク質、Aip1pの局在化および運動は、アクチンにおけるR256H変異を発現する細胞中で可視化し、定量した。これらの技術は、in vitro生化学的研究で補完し、タンパク質相互作用や機能をより深く理解することを可能にする。
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Protocol
1。PB1996プラスミドへのクローニング
- デザインと注文DNA標的配列に隣接し、選択した親プラスミド中のユニークな制限部位を含むオリゴヌクレオチド製造会社からのプライマー。注：この場合、プライマーは、AIP1配列の5 '末端に400塩基対を増幅するように設計した。 XhoI制限部位は、約20bpのAIP1配列の前にプライマーに組み込んだ、とXmaI AIP1は、標的配列の後に約20塩基対を含めた。クローニングに用いたプラスミドは、蛍光用3XGFPタグ、酵母株選択のためのURA遺伝子、および細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含むPB1996であった。
- 裏酵母一倍体株からゲノムDNAを精製する。注：クローン作成プロセスの図については図1を参照してください。
- いずれかの専用の制限部位とAip1p遺伝子を増幅するために二つのプライマーおよび酵母ゲノムDNAを用いた標準的なPCR反応を実行D。推奨されるプロトコルをメーカーごとに別々の反応において制限酵素でPCR産物およびPB1996プラスミドを消化する。この場合のXmaIおよびXhoIで1時間37℃で添付の緩衝液で使用した。
- 消化されたDNA断片を分離するために、0.8％アガロースゲル電気泳動を実行する。 1ウェル内に、低いDNA質量ラダーをロードして、別々のウェルに、各々の消化から全反応をロードします。色素の先端がゲルの終わり近くになるまで、約1時間、100ボルトでゲルを実行します。 UV光下でゲルを視覚化し、タンパク質のセグメントに対応するセグメントと切断プラスミドを精製した。
- 消化AIP1セグメントとPB1996プラスミドを連結。製造元のプロトコルを用いてDH5α細胞中に製品を変換（2分間42℃で、氷、熱ショックで30分間、100μlの細胞を有する10μlのDNA、37℃で2時間SOC培地中で増殖）と、培養プレート上にプレートつまり、この場合のLB +で、選択のための抗生物質を含んでAmpプレート。液体培養で1コロニーを選択し、成長する。新たに設計されたプラスミドを精製する。
2。変異酵母株の生成
- アクチン対立遺伝子変異酵母株を構築するために削除された半数体酵母株を使用してください。注意：この株は染色体アクチン遺伝子を欠いており、野生型酵母をコードするプラスミドが含まれているこの場合、親株は、ピーター·ルーベンスタイン（アイオワ大学）からの寛大な贈り物だったと建設はCook ら 20により記述されていた。アクチンとウラシル。
- 突然変異誘発の21のベースプラスミドとしてのTrp +選択とのPRSコードするプラスミド野生型酵母のアクチンを使用してください。
- アクチンにミスセンス変異を設計するのPRSプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行う。
- アクチンにおけるR256H変異について、彼の256のArg 256を変更するために、プライマー5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3」を作る。標準の突然変異誘発を実行ステップ2.2からのプラスミドを用いたPCR反応。
- DH5α細胞中にPCRから、変異アクチンプラスミドを変換します。プラスミドDNAを単離し、変異を確認するために、アクチン遺伝子を配列決定する。
- ステップ2.1からの半数体酵母株に変異酵母のアクチンをコードするプラスミドを変換します。
- 文化TRP-プレート上の形質転換細胞は変異酵母アクチンプラスミドを含むのTrp +を含む酵母を選択した。
- 5 - フル酸（5-FOA）を含有するプレート上TRP-プレートから継代培養細胞による野生型アクチンと（2.1で説明）ウラシルをエンコードし、元のプラスミドを欠いた細胞を選択する。 5-FOAは、機能的URA3遺伝子を発現賛否株で、毒性型、5 - フルオロウラシルに変換される。段階的に選択した後に成長した細胞のみが、変異アクチンプラスミドが含まれています。
- 新しい酵母株からのプラスミドDNAを精製する。アクチン遺伝子変異体が存在する保証するために、プラスミドを配列決定。このS使用さらなる研究で訓練。このプロセスを図2に図解されている。
3。酵母細胞にプラスミドの変換
- 酵母染色体への組込みを可能にする制限酵素でAip1p-GFPプラスミドを消化する。 NOTE：制限部位は、蛍光タグ、目的の遺伝子、および選択マーカーを含むシーケンスブロックの外でなければならない。この場合、37℃で8μlのDNAを、1時間に伴う10倍の緩衝液1μlでのHpaI制限酵素の1μlを使用する
- 文化S. 30℃でのホイールのYPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース）中の5mlの一晩ウラシル（裏株）を合成することができない（工程2.5からの） セレビシエ細胞千X gでダウン5分間の細胞の1ミリリットルを紡ぐ。
- プレートの混合物を作る。のddH 2 Oで43 mlの1 MトリスpH7.5、5mlの250mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）2 mlを添加することにより10XTEを作る0を追加20mlの1XTEに酢酸リチウムの0.204グラム、次いで8ポリエチレングリコール（PEG）（MW〜3,300）のg及びフィルター滅菌し。
- ステップ3.2でスピンダウンした細胞から上清を除去し、残りの液体中の細胞を懸濁します。懸濁した細胞を、10 mg / mlのサケの精巣キャリアーDNAの2を添加する。ステップ3.1渦から消化したプラスミドDNAの10を添加する。プレートと渦の0.5ミリリットルを追加します。 1 M DTTおよび渦の20を添加する。
- 25℃で6〜8時間にわたって混合物をインキュベート熱は、10分間42℃の水浴中の細胞に衝撃を与える。彼らは、裏板に沈降してきたマイクロ遠心管の底部からの細胞のプレートを100μl。 2〜3日間、またはコロニーが形成されるまで30℃で培養する。
- 外裏板に個々のコロニーと連勝を選択します。注：これらの細胞は、成長を考慮して、染色体に組み込まAIP1-GFPおよび裏遺伝子を有するプラスミドを含んでいる。次いで、これらの細胞をmicroscoで使用されるPY。
4。全反射蛍光顕微鏡を用いてAip1pタンパク質運動の可視化
- 30℃で一晩ホイールにYPD中で組み込まAip1p-GFPで酵母細胞の培養を育てる9ミリリットルの浦のメディアへのサブカルチャー一晩培養物1ミリリットルを。それらが対数増殖期にあることを確実にするために、30℃でシェーカー上でさらに3〜4時間、細胞を増殖させる。
- ガラス顕微鏡スライドに細胞の3μLを加え、カバースリップを追加します。細胞は5分間スライドに解決することができます。ステージプレートの金具でスライドを置きます。
- 客観的な油浸100X TIRFとデジタルCCDカメラを用いて全反射蛍光（TIRF）顕微鏡（488ナノメートル）でAip1p-GFPタンパク質を観察します。 SlideBook 5.0ソフトウェアを使用して、（取得された画像の個々のフレームは、 図2Aに示されている）5コマ/秒の速度で20秒間の画像を得る。
- Cに集中するのエル、オープンSlideBook 5.0ソフトウェアとフォーカスコントロールにアクセスするには、ツールバーにフォーカスウィンドウのボタンをクリックします。 [スコープ]タブを選択し、100X-TIRF目的を選択します。上のランプの電源を入れ、15％、ランプバーをスライドさせます。 2×2にビンの設定を変更します。明視野にフィルタを変更してください。
- 顕微鏡、コンピュータの画面上で見られるように焦点に細胞を持って来るためにファインフォーカスダイヤルを使用しています。
- ランプをオフにし、フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用して、ライブフィルタを変更し、TIRFM]ボタンをクリックします。
- 顕微鏡の右側ポートに接続されたTIRFM照明に、Onにレーザ発光を回す。
- フォーカスウィンドウ内のストリーム]タブを選択し、録音を開始してから、明視野]ボタンをクリックして次のチェックボックスをオンにします。
- TIRFM照明に、レーザーの入射角を調整するマイクロメータを回す。これは、AIP1-GFP病巣からの蛍光発光を最適化し、バックグラウンド蛍光を最小化するために使用される細胞とスライド。
- 所望の画像が表示されたら、[スタート]を押します。 20秒後、停止ボタンをクリックします。画像を保存します。メインメニューバーの[ファイル]タブの下で、名前を付けて保存するスライドを選択し、ファイルの場所と名前を入力します。
- 画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用してください。蛍光Aip1p病巣の動きとレートを追跡するために、マクロプラグイン「手動トラッカー」を使用してください。 0.2秒の時間間隔のパラメータを変更します。
- 追加トラックの選択を使用して、四から八結合フレームを通じて、個々の蛍光タンパク質を選択し、追跡します。終了トラックコマンドを使用して、各フレーム間のタンパク質の動きの速度が結果ウィンドウに表示されます。
- Microsoft Excelスプレッドシートを使用して、各フレーム間の平均速度を決定する。目的の各細胞株のためのAip1p運動の平均速度を計算するための値を使用します。 NOTE：Aip1p運動の速度および平均非線速度の散布図は、 ふぃぎゅに示されている図2（b）再。
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Representative Results
画像への方法は、細胞内の細胞骨格タンパク質のダイナミクスを提示されている。アクチン結合タンパク質、Aip1pは、GFPでタグ付けされた。タグ付けされた生成物をコードするプラスミドのデザインを図1に示す。プラスミドは、次いで酵母細胞に形質転換した。蛍光の発現はAip1p、細胞内でのタンパク質の挙動の可視化を可能にしたタグ付けされた。 Aip1pは、一般的にエンドサイトーシス22のサイトで、アクチンパッチに局在する。 図2Aに示すように、Aip1pの動きを定量化するために、50以上の蛍光Aip1p病巣は、10以上の細胞中で追跡した。平均速度は、各蛍光Aip1p領域（ 図2Bを参照）を算出した。野生型細胞では、Aip1pの動きは、セル間での範囲であり、それ以降表示されなくなります。野生型細胞におけるAip1pの移動の平均速度は1.60±0.42ミクロン/秒である。 cyのアクチンの異常な形態を有することが知られてR256H変異アクチンを発現する細胞、23 toAllでは、変更されたAip1p表現型を持っている。変異株では、Aip1pの動きが制限され、時間がかかります。 Aip1p運動の平均速度は0.88±0.30ミクロン/秒（P <0.005）である。 Aip1pの移行は巣が互いの周りを旋回ではなく、セルを横切ると、すぐ近くに制限されています。また、Aip1pはAIP1タンパク質のより遅い回転率を示唆している表示になる。
プラスミド構築の図1図。A）PCRによって増幅AIP1断片を制限酵素（黄色ボルト）。B）プラスミド、PB1996は、制限酵素で消化することによって消化されるように示されているAbp140遺伝子を除去する酵素。C）消化AIP1とPB1996の断片は、Tを連結するOプラスミドPB1996 AIP1を形成している。D）PB1996 AIP1プラスミドは線状化DNAが染色体に組み込まれている酵母細胞に形質転換する。
酵母突然変異体株アクチン構築の図2は図。突然変異アクチンアイソフォームをコードするプラスミドを細胞株に形質転換し、トリプトファンを欠く培地上で増殖する能力に基づいて選択される。緑の線は、染色体DNAを示している。黒丸はプラスミドである。茶色の円は、酵母細胞を表している。ボックスは、それぞれ特定の遺伝子を示します。黄色はアクチンである、オレンジ、茶色がウラシルである、ロイシンであり、ピンクはトリプトファンである。ボックスの上にXは遺伝子が染色体DNAから削除されていることを示します。ステップ2.3および2.4において、アクチン遺伝子I ONブラックスターR256H変異をndicates。
GFPタグAip1pを表現する野生型およびR256H細胞の生酵母細胞中の図3。Aip1p-GFPの動きであって、a）画像が表示されます。細胞は、早期対数増殖期にあり、画像は15秒ごとに0.2秒を取得した。矢印は、変異アクチン株について野生型および赤青時間をかけて個々の蛍光焦点の位置を、表している。最後のフレームには、緑の線としてAIP1病巣の経路を示している。示されたスケールバーはAip1p移動の速度はImageJを使用して測定した5μmである。B）である。散布図のグラフは、個々の蛍光焦点のためのレートを表示します。水平バーは、野生型（青）と変異体（赤）アクチン株に対する平均速度を示している。Aip1pはR256H変異型アクチン（P <0.005）を発現する細胞について0.88±0.30ミクロン/秒に比べて、野生型細胞では1.60±0.42ミクロン/秒で移動する。
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Discussion
病原性の変異による検査において細胞骨格と実用性のダイナミクスを可視化するための効果的な戦略は、ここに記載されている。高度な画像診断法は、細胞膜の近くにタンパク質の細胞内の動きを理解するための新しい機会を作成しました。全反射蛍光顕微鏡（TIRF）は、生きた細胞内の機能研究のための高感度の技法である。 TIRFはカバーガラスと、水性媒体の屈折率の差によるエバネッセント場を作成する角度のついた励起レーザーを使用しています。エバネッセント場のエネルギーは、フルオロフォアを励起するが、カバーガラスと水の間の界面の距離と共に指数関数的に減少する。これは、信号対雑音比及びカバースリップ/媒体界面上記50-250ナノメートルから強力な分解能と高い信号が得られる。これらの資質は、全反射顕微鏡を少なくして、生きた細胞内の単一分子レベルでの細胞骨格タンパク質を可視化するための強力なツールを作る光毒性および他の技術24に対して強化されたコントラスト- 26。
細胞骨格は、細胞のニーズに適応するために協調して取り組んで多数のタンパク質が含まれます。コフィリンによる規制上のアクチンに突然変異を引き起こす血管疾患の効果は、最近になって我々のグループ27によって検討した。私たちの最初の調査結果に基づいて、Aip1p、コフィリン依存アクチン切断を容易にし、アクチン結合タンパク質は、調査した。予備的研究において、アクチン変異R256Hは、特にストレス条件下で、Aip1pの非存在下であまり増殖を発現する細胞。これは、変異アクチン細胞骨格のAip1p規制が変更されることを示唆している。蛍光タグ付けと全反射顕微鏡を用いてR256H株の動きとAip1pの局在の我々の分析は、異常なダイナミクスを裏付ける。今後は、複数のタンパク質の移動を視覚化するために、異なる蛍光体で、例えばコフィリンなどの追加のタンパク質をタグ付けすることを計画タンパク質相互作用：同時に優れたタンパク質を理解する。
技術は実現可能ではない蛍光標識タンパク質といくつかのインスタンスを生成するにはいくつかの制限があります。蛍光タグは、タンパク質の活性を破壊または結合パートナーとの相互作用を変更することができます。これはコフィリン、他のアクチン結合タンパク質をタグ付けするための試みで発生しました。タグ付けされた構築物の発現は、破壊されたコフィリン機能による半数体酵母に成功していない。コフィリンは、酵母に不可欠なタンパク質である。このように、併用再導入せずにコフィリンの削除は致命的である。プラスミド上、その後の導入がなければ。この制限を回避する1つの方法は、2倍体酵母を使用することである。コフィリンの遺伝子の一方のコピーは、タグ付けされたバージョンは、外因的プラスミドに導入されました、ノックアウトした後、ゲノムコフィリンが不足しているが、蛍光タンパク質をタグ付けする機能だったプラスミド22が含まれて娘細胞の選択した以前は、そのタンパク質 - タンパク質相互作用にほとんど影響を有することが示されたタンパク質中の内部残基にタグを追加することによって得られる。タンパク質相互作用：N-又はC-末端は、領域が適切なタンパク質に影響を与えることが知られていない限り、タグを追加するための好ましい部位である。これは機能的タンパク質を生じない場合、代替の末端または内部残基を図ることができる。
説明された技術を実装するいくつかの重要なステップがあります。一つは、関数を節約するタンパク質をタグ付けするために適切な場所を決定することである。堅牢なコントロールは、タンパク質の機能が保存されていることを確認するために包含されている必要があります。第二に、スライドは、細胞が撮像中に乾燥させるならないようにするため、監視する必要があります。ワックスは、必要に応じて脱水を防ぐために、カバースリップの縁部の周りに使用することができる。成功を確実にするためにこれらのステップは、細胞膜の近くに画像構造へのこのアプローチは扱いやすいし、有利なことは簡単である。 QUA能力生きた細胞内のntifyタンパク質の局在や動きは細胞機能の理解を向上させることができます。細胞骨格タンパク質に影響を与える変異が特定されているように、蛍光標識されたタンパク質と全反射顕微鏡の発現は、ヒトの疾患の根底にある病態生理を研究するのに役立ちます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、元PB1996クローンするための有用な議論と技術的なアドバイスのためのピーター·ルーベンスタイン、デビッドPellmanに感謝します。この作品は、ダイムの月からの助成金や子供のためのライドからの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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