Summary
Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.
Abstract
Intracellulare di Ca 2 + segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca 2 + indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l'analisi quantitativa di Ca 2 + dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca 2 + di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l'open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l'esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l'uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca 2 + segnalazione.
Introduction
Ca 2 + è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca 2 + citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca 2 + segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde 1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca 2 + è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l'analisi di Ca 2 + modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi 5.
Coloranti Ca 2 + indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurare Ca2 + intracellulare segnali con fluorescenza microscopia 5-12. Tipicamente, temporali Ca 2 + segnali vengono valutati come cambia il tempo-dipendenti medio di fluorescenza all'interno di un'area definita dall'utente, o regione di interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Attualmente, analisi del ROI manuale sia in termini di tempo e di lavoro intensiva perché richiede agli utenti di identificare molti ROI ed eseguire calcoli ripetitivi 17 - 19. Queste tecniche possono essere soggette a notevoli errori degli utenti, compresa l'introduzione di modalità di segnali artificiali e l'esclusione di segnali diffusi 18,20 bassa ampiezza o.
Algoritmi di rilevamento ROI automatizzati sono stati precedentemente implementato utilizzando una varietà di approcci statistici per determinare il posizionamento ottimale ROI, ma sono stati generalmente limitata all'analisi della scansione linea o pseudo-line immagini di scansione, che limita l'analisi ad una sola dimensione spaziale nel tempo 17, 19-22. Inoltre, molti algoritmi esistenti non sono sufficienti per comprendere la diversità di Ca 2 + eventi di rilascio che vanno da periodici, transitori localizzati di onde che si propagano 23,24. Valutazione complessiva delle fisiologiche Ca 2 + segnali è spesso ulteriormente complicata dalla presenza di una significativa artif immagineatto che confonde il segnale alla discriminazione rumore in molti sistemi sperimentali.
In precedenza, una soluzione algoritmo di rilevamento ROI automatizzato per Ca 2 + segnale di rilevamento transitorio, implementato come plugin per il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), è stato sviluppato e convalidato 25,26. Questo algoritmo, chiamato LC_Pro, è stato progettato per identificare e analizzare ROI comprende Ca 2 + transitori di segnale bidimensionali time lapse sequenze di immagini. Qui un protocollo sperimentale e dimostrazione pratica rappresentativo di una applicazione dell'algoritmo in porcino coronarico endotelio è fornito, con postprocessing aggiuntiva utilizzando l'open source software di elaborazione statistica R per generare output grafico utilizzabile.
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Protocol
1. Dissezione della nave e Imaging
- Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al 27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS).
- Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell'arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbici molla rimuovendo il segmento del vaso dalle circostanti strati di tessuto cardiaco. NOTA: Fare attenzione a non forare la parete del serbatoio.
- Collocare un blocco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) nel piatto dissezione, e utilizzare un ago al pin al fondo. Tagliare un filo di tungsteno di circa 40 micron di diametro in dodici ~ segmenti di lunghezza 0,3 centimetri, formando micropins, e inserire questi nel piatto. Utilizzando pinze, fissare una estremità del segmento del vaso al blocco con un MICROPIn.
- Inserire con cautela piccole forbici primavera nel lume del vaso, e tagliare longitudinalmente su un lato della nave per aprirlo completamente. Orientare il segmento di vaso aperto con l'endotelio alto.
- Utilizzare i restanti micropins per fissare i confini del segmento del vaso aperto per bloccare tale che la nave si forma un rettangolo piatto. NOTA: piani MicroPin devono essere piegate a 90 ° e inseriti a filo con la superficie del blocco. Si deve prestare attenzione per allungare la preparazione natante senza pressioni eccessive; larghezza finale dovrebbe essere ~ 1.5X la larghezza di partenza non deformato.
- Preparare un piccolo volume (~ 1 ml) di Fluo-4 soluzione AM loading mescolando Fluo-4 AM (10 mM) disciolto in DMSO con Pluronic (0,03%) in un tamponata con HEPES PSS (contenente in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10, 10 HEPES glucosio), e inserire l'intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Dopo il caricamento, lavare il blocco in HEPES bufferizzatiPSS per 5-10 min.
- Montare il blocco sul 50-100 micron distanziali di spessore in una camera inferiore coprioggetti contenente HEPES tamponata PSS. NOTA: perni metallici possono essere usati come distanziatori e garantiscono il segmento del vaso è rivolta verso il basso e non toccare i distanziali.
- Posizionare la camera sul palcoscenico di un microscopio invertito attrezzato per l'imaging confocale, e concentrarsi sul livello delle cellule endoteliali.
- Sequenze di immagini lasso di tempo la cattura di basale fluorescenza relativa per ~ 3 min a 20X di ingrandimento e un frame rate di ~ 8 fotogrammi al secondo con immagine confocale software sequenza di acquisizione.
- Dopo circa 3 minuti di registrazione fluorescenza basale, sostituire HEPES soluzione tamponata PSS con lo stesso volume (~ 1 ml) di sostanza P (100 pM) disciolto in tampone HEPES PSS, e record per un supplementare 3 min.
2. Analisi automatizzata
- Render sequenza di immagini (s) di attività del calcio fluorescente da software di acquisizione confocale come 8 bit, g'. tif' files rayscale formato senza informazioni di scala.
- Aperto ImageJ, clicca su 'aperto' nel menu File, e selezionare la sequenza di immagini appropriato nella finestra di Explorer per visualizzare la sequenza di immagini (s) in ImageJ.
- Determinare un diametro ROI appropriato utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiori e inferiori della distribuzione spaziale di attività all'interno della sequenza di immagini (s). NOTA: Il diametro rettangolare media è una scelta adatta per diametro ROI.
- Creare una nuova cartella sul disco rigido del computer, e aggiungere la sequenza di immagini (s) nella directory della cartella.
- In ImageJ, fare clic su finestra "plugins", quindi fare clic su 'LC_Pro' per avviare l'analisi.
- Inserire il valore del diametro ROI e selezionare il valore di soglia del filtro (sia 0.05 o 0.01).
- Fare clic sulla casella di controllo 'di trattamento della droga' e inserire i valori del punto di tempo immediatamente prima e dopo l'aggiunta del farmaco (in secondi).
- Fare clic su 'ok', einserire la directory sequenza di immagini nella finestra di file explorer.
3. Uscita grafica
- Scarica R versione 3.0.2 da http://www.r-project.org/ .
- Aprire la versione a 32 bit di R.
- Fare clic su "file", quindi 'script open' e selezionare script 'traceplot.R' R per la generazione di report grafici sperimentali.
- Installare la calibrazione, e gplots pacchetti tramite la scelta "pacchetti", 'installare i pacchetti ", e selezionando i pacchetti giustificativo utile.
- Fare clic su 'file', poi 'change directory' comando, e utilizzare la finestra di esplorazione per selezionare la directory che corrisponde all'uscita analisi LC_Pro.
- Cliccate sulla finestra dello script e poi il 'eseguire tutti' comando per eseguire lo script.
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Representative Results
Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l'analisi automatizzata di Ca 2 + dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l'algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p <0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell'intensità media di fluorescenza a ROI per determinare i parametri di eventi specifici. Una panoramica grafica dell'algoritmo è mostrata utilizzando generato dal computer impulsi gaussiani di intensità e posizione nota (Figura 2). Impulsi di segnale (figure 2A e B) sono stati convertiti in binario utilizzando lo z-score per una distribuzione normale standard, e ellissi best-fit sono stati assegnati a loci pixel sopra la soglia del segnale (Figura 2C). Un algoritmo di ordinamento ellisse è stato usato per determinazionene posizionamento ROI ottimale (Figura 2D). ROI intensità media in funzione del tempo è stata poi misurata e parametri di ampiezza, durata e distribuzione spaziale del segnale sono stati calcolati (Figura 2E). Questo approccio di analisi è stato applicato per valutare cellulare Ca 2 + dinamiche in intatta endotelio vascolare. In particolare, confocale è stata eseguita in aperte arterie coronarie suina come descritto nella Figura 3, e l'algoritmo è stato impiegato offline quantificare distinte Ca 2 + parametri. Per questi esperimenti, continue registrazioni sono state effettuate prima e dopo l'aggiunta dello stimolo endoteliale, sostanza P (SP, 100 pM), e analisi LC_Pro è stato effettuato poi. Per segnale scalatura all'interno di ogni ROI, linee di base sono stati ottenuti come regressioni lineari di intensità ROI nel corso tempo sperimentale (Figura 4). Medio di valori di intensità del segnale sono stati calcolati per ogni ROI (Figura 4A), e valori superiori alla media sono stati trunc ato alla media e una regressione lineare è stata effettuata per approssimare segnale basale (Figura 4B). Infine, i valori di intensità grezzi sono stati divisi per il valore della linea di regressione per convertire i valori di piegare cambiamento rispetto al basale (Figura 4C). Figura 5 mostra un esperimento rappresentativo, comprese le immagini di Ca 2 + fluorescenza dipendente nella (Figura 5A) endotelio, accumulare maschere binarie di segnale totale Ca 2 + rilevato all'interno del campo campionata (Figura 5B), e registrazioni di fluorescenza media per ogni ROI (Figura 5C) prima e dopo il trattamento SP. Analisi parametro successivo è stata effettuata utilizzando il software R. Istogrammi risultanti mostrano l'effetto di amplificazione della SP dall'ampiezza evento, durata e distribuzione spaziale (Figura 6).
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Figura 1. Segnale diagrammi di flusso dei processi algoritmo (questa cifra è stata ottenuta con il permesso di Francis et al.) 24. L'algoritmo è stato organizzato in tre sezioni: l'elaborazione delle immagini, elaborazione di eventi, e la regione di interesse (ROI) di elaborazione. Sequenze di immagini vengono immessi nella catena del flusso e statistiche di eventi sono generati come output finale. L'elaborazione delle immagini (A) subroutine dell'algoritmo converte la sequenza di immagini in ingresso in una lista di ellissi best-fit di soglia, utilizzando lo z-score per una distribuzione normale standard e l'analisi delle particelle ImageJ. Elaborazione evento (B) è una subroutine di ordinamento utilizzato per determinare la posizione ottimale ROI organizzando località ellisse in eventi "siti" di tempo. Dopo significano misure di intensità vengono prese a ogni ROI, parametri statistici per ogni evento e il sito sono calcolati dal subroutine di elaborazione ROI (C </ Strong>) per generare l'output finale. BKGD, sfondo; AVG, media. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Dimostrazione di acquisizione ROI automatizzate e rilevazione del segnale utilizzando un impulso gaussiano generata dal computer (questa cifra è stato adattato con il permesso di Francis et al.) 24. Un singolo impulso di segnale generati dal computer (A) è stato incorporato in casuale rumore di fondo. La sequenza di immagini in scala di grigi è stata filtrata per rimuovere i valori di pixel sfondo statico (B) e convertito in binario utilizzando valori di intensità dei pixel di soglia P <0.05 calcolato il punteggio standard (C). ImageJ analisi di particelle algoritmoms sono stati poi applicati alla sequenza di immagini di assegnare ellissi di best-fit per pixel loci all'interno di ogni fotogramma. Un nuovo algoritmo è stato usato per ellissi raggruppare in discrete "eventi" temporali e determinare la posizione ottimale per ogni ROI basato sulla media centro dell'ellisse (D). Un ROI del raggio definito dall'utente viene quindi posto in ciascuna posizione (cerchio tratteggiato). Valori medi di intensità all'interno di un ROI sono calcolati per ogni fotogramma e scalati con un'approssimazione di base lineare. Ampiezza picco è identificato come massimi locali sopra P <0.05 come definito dal punteggio standard per un corrispondente tracciato ROI (E). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Porci ne protocollo dissezione dell'arteria coronaria. Circa 0,5 mm di diametro x lunghezza 8 mm rami discendente anteriore dell'arteria coronaria (prima immagine, cerchio tratteggiata) sono stati sezionati dal miocardio circostante. Segmenti di flotta sono stati tagliati del tessuto circostante avventiziale e tagliare longitudinalmente con piccole forbici (seconda immagine). Successivamente, i vasi aperti erano state riposte piatta per un blocco PDMS con fili di tungsteno sottili (terza immagine). Segmenti di flotta montati sono stati caricati con Fluo-4 Ca 2 + colorante indicatore, lavate, e poi messo in una camera di imaging coprioggetti fondo. Le immagini sono state raccolte a 20X di ingrandimento (488 ex., 510 em.) Al 8,0 fotogrammi al secondo utilizzando un microscopio confocale invertito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. ROI significa intensità ravvicinamento basale. Seguendo intensità medio contro misure di tempo (linee continue) per ogni ROI, i valori di intensità prime vengono regolate per F/F0 utilizzando il seguente metodo di approssimazione basale. L'intensità del segnale medio (linea tratteggiata) durante il periodo di controllo viene calcolata dal controllo definito dall'utente e valori intervallo di trattamento (A). La curva intensità del segnale in funzione del tempo viene quindi troncato sopra l'intensità controllo medio all'intensità controllo medio per filtrare l'attività di ravvicinamento basale, e una regressione lineare viene eseguita sulla curva risultante (linee tratteggiate) (B). Infine, i valori di intensità grezzi vengono scalati alla linea di base lineare calcolata (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Risultati rappresentativi di analisi LC_Pro di basale e stimolata Ca 2 + dinamica. Fuso immagini lasso di una sequenza di immagini in ingresso di un intervallo di campionamento basale (A, pannello di sinistra) seguita da una P-stimolata intervallo di campionamento sostanza (A, pannello destro ) sono mostrate in scala di grigi. Time lapse sequenze di immagini di best fit per ellissi basale e stimolata intervalli (B) sono stati resi da LC_pro. Infine, dipendenti dal tempo scalati curve intensità di ogni regione posizionata automaticamente di interesse (ROI) sono mostrati (C).
Figura 6. Istogrammidistribuzioni di parametro da un esperimento rappresentativo (Figura 4). Istogrammi di parametri di ampiezza di picco (F/F0), durata di ½ max (sec), e la diffusione spaziale massima (micron 2) sia per il controllo (colonna di sinistra) e Sostanza P-stimolata (colonna di destra) eventi da un esperimento rappresentativo erano rendering utilizzando R per elaborare graficamente l'output di LC_pro. In particolare, la stimolazione Sostanza P ampliato il numero di eventi, e ha causato un significativo spostamento a destra in ampiezza e durata mediana da test di Mann-Whitney U (p <0.01).
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Discussion
Decodifica complessi Ca 2 + segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca 2 + fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca 2 + segnali all'interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di maiale, appuntato aperto per esporre l'endotelio, caricata con il Ca 2 + indicatore Fluo-04:00, sottoposto a confocale, e valutato con l'algoritmo personalizzato LC_Pro. Questo algoritmo è progettato per 1) rilevare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p <0.01) di rumore, 2) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e 3) analizzare intensità media di fluorescenza a ROI per determinare i parametri di eventi specifici. L'approcciosupera principali limitazioni della ricerca biologica segnalazione riducendo errore dell'utente e polarizzazione, riducendo notevolmente i tempi di analisi offline, e fornendo un indice completo di segnali attraverso un campo di discernere profili o modelli rappresentativi. Uscita da LC_Pro è ulteriormente elaborata attraverso script in R, fornendo report completi parametri per i singoli esperimenti, tra cui output grafico di alta qualità.
Diversi passaggi sono importanti per la corretta esecuzione della tecnica descritta. La procedura di dissezione (passo 1.1.1) deve essere eseguita con attenzione per evitare denudazione o danneggiamento dello strato di cellule endoteliali. Inoltre, sequenze di immagini devono essere in formato corretto (fase 2.1) per la regione automatizzata di algoritmo interesse per funzionare correttamente. Per esempio, se ci sono informazioni scala associata al file, regioni di interesse saranno posizionati correttamente secondo le posizioni dei pixel, piuttosto che le posizioni delle unità in scala. Inoltre, la scelta di un re adattoregione di diametro interesse è fondamentale per eseguire correttamente l'analisi automatizzata dell'attività fluorescente entro una sequenza di immagini. Un valore troppo piccolo diametro può provocare misurazioni ridondanti, mentre troppo grande diametro comporterà l'esclusione dei segnali sottili.
Potenziali insidie di questa tecnica si riferiscono principalmente alla sensibilità dell'analisi automatizzata per xy spostamenti di sequenze di immagini registrate e per segnalare la saturazione e / o sbiancamento, che può portare a risultati falsi positivi o falsi negativi. Derive o variazioni dimensionali possono essere indirizzate direttamente attraverso l'uso di software di registrazione stack e denominazione precisa degli intervalli in cui vengono introdotti perturbazioni. Livelli di grigio e parametri di diametro ROI possono essere ottimizzati per una determinata preparazione in anticipo della raccolta dei dati, al fine di uniformare i set di dati grezzi.
Perché serve come un approccio standard per qualsiasi segnale di fluorescenza dinamica, l'analisi descritto here è adatto per un corpo eterogeneo di applicazioni. Nel sistema vascolare, questo metodo è stato impiegato per definire fisiologica caratteristica e modalità di segnale fisiopatologici in più letti vascolari sotto condizioni basali e 25,26 stimolato. E 'anche essere applicata nel monitoraggio automatizzato di Ca 2 + onde. In definitiva, tale analisi automatizzata globale sarà un perno fondamentale nel decifrare spazialmente e temporalmente bio-segnali complessi e nella creazione di nuove cellule e modelli multi-cellulari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, e MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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