Summary
Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.
Abstract
Intrazelluläre Ca 2 +-Signale sind allgemein mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe, und Mikroskopie-Techniken untersucht. Ist die quantitative Analyse von Ca 2 +-Bilddaten jedoch zeitaufwendig und je nach Vorspannung. Automatisierte Signalanalyse-Algorithmen basieren auf Region von Interesse (ROI) Detektion wurden für eindimensionale Zeilen Messungen durchgeführt worden, aber es gibt keine aktuelle Algorithmus optimiert die Identifizierung und Analyse von ROIs in zweidimensionale Bildsequenzen integriert. Hier wird ein Algorithmus für die schnelle Erfassung und Analyse von ROIs in Bildfolgen beschrieben. Es nutzt Ellipsen passen Rauschen gefilterten Signale, um eine optimale Platzierung ROI zu ermitteln, und berechnet Ca 2 +-Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung. Dieser Algorithmus wurde als frei verfügbare Software-Plugin für ImageJ (NIH) durchgeführt. Zusammen mit der Analyse Skripte für die Open-Source-Software R statistische Verarbeitung geschrieben,Dieser Ansatz bietet eine Hochleistungs-Pipeline für die Durchführung schnelle statistische Analyse der experimentellen ausgegeben. Die Autoren schlagen vor, dass die Verwendung dieser Analyseprotokoll wird zu einem vollständigen und unvoreingenommene Charakterisierung der physiologischen Ca 2 +-Signal führen.
Introduction
Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül second messenger und zytosolischen Ca 2 +-Spiegel sind stark reguliert. Die intrazelluläre Ca2 +-Signale sind komplex und umfassen isolierten Transienten, Schwingungen, Wellen-und Pflanzgut 1-4. Räumliche und zeitliche Steuerung von Ca 2 + wird gedacht, um physiologische Signal Spezifität zugrunde liegen und damit die Analyse von Ca 2 +-Signalmuster ist von großem Interesse für die Ermittler in mehreren Feldern fünf.
Ca 2 +-Indikator-Farbstoffe, wie Fluo-4 und Fura-2 werden üblicherweise verwendet, um intrazelluläre Ca 2 +-Signale mit Fluoreszenzmikroskopie 5-12 messen. 16 - typischerweise werden zeitliche Ca 2 +-Signale als zeitabhängige Änderung der mittleren Fluoreszenz innerhalb einer benutzerdefinierten Bereich oder Region von Interesse (ROI) 5,6,13 ausgewertet. Derzeit ist die manuelle ROI-Analyse sowohl zeitaufwendig und arbeits inSpannender, weil es erfordert, dass Benutzer viele ROIs identifizieren und sich wiederholende Berechnungen 17-19. Diese Techniken können auch mit erheblichen Benutzerfehler, einschließlich Einführung der künstlichen Signalarten und den Ausschluss von niedriger Amplitude oder diffuse Signale 18,20.
Automatisierte ROI Erkennungsalgorithmen sind zuvor unter Verwendung einer Vielzahl von statistischen Methoden, um eine optimale Platzierung ROI ermitteln implementiert worden, aber sie haben im Allgemeinen eine Analyse der Zeilen oder Pseudo-Zeilenbilder, die Analyse auf eine einzige räumliche Dimension in der Zeit 17 begrenzt begrenzt, 19-22. Darüber hinaus sind viele bestehende Algorithmen nicht aus, um die Vielfalt der Ca 2 +-Freisetzung aus Ereignissen, die periodisch, lokalisierten Transienten ausbreitende Wellen 23,24 Bereich umfassen. Umfassende Bewertung der physiologischen Ca2 +-Signale wird oft durch die Anwesenheit von signifikanten Bild Artif komplizierthandeln, dass verwechselt Signal-Rausch-Diskriminierung in vielen experimentellen Systemen.
Zuvor eine automatisierte ROI-Erkennungsalgorithmus Lösung Ca 2 +-Signal Transientenerkennung, als Plugin für NIH ImageJ Software implementiert (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wurde entwickelt und validiert 25,26. Dieser Algorithmus, genannt LC_Pro, wurde entwickelt, um zu erkennen und zu analysieren ROIs umfassenden Ca 2 +-Signal-Transienten in zweidimensionalen Zeitraffer-Bildsequenzen. Hier eine praktische Versuchsprotokoll und repräsentative Demonstration einer Anwendung des Algorithmus in Schweineherzkranzarterie Endothel vorgesehen ist, mit zusätzlichen Postprocessing mit der Open-Source-Software R statistische Verarbeitung zu brauchbaren grafischen Ausgabe zu erzeugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fahrzeug Dissection und Imaging
- Ernte-Gewebe aus heimischen Jugend Schweine wie in Martens et al 27 beschrieben. Zeigen geerntet Schweine rechten Herzkammer in ein Polydimethylsiloxan (PDMS) unten Dissektion Schale mit HEPES-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PSS).
- Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sezieren und entfernen ein Segment des linken vorderen absteigenden Koronararterie (~ 8 mm Länge, 0,5 mm Durchmesser) vom umgebenden Gewebe mit einer Pinzette und Schere Frühjahr durch die Gefäßsegment Entfernen aus den umliegenden Herzgewebeschichten. HINWEIS: Achten Sie auf die Gefäßwand nicht durchstechen.
- Legen Sie ein PDMS-Block (1 x 0,5 x 0,5 cm) in die Dissektion Gericht, und verwenden Sie eine Nadel, um es auf den Boden zu fixieren. Schneiden Sie ein etwa 40 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht in zwölf ~ 0,3 cm lange Segmente bilden Mikropins, und diese in die Schüssel. Mit einer Pinzette, sichern eine Ende des Gefäßsegments zu dem Block mit einem micropin.
- Kleine Feder Schere vorsichtig in das Gefäßlumen und längs geschnitten auf einer Seite des Schiffes, um es vollständig zu öffnen. Richten Sie die geöffnet Gefäßsegment mit dem Endothel auf.
- Verwenden Sie die restlichen Mikropins, um die Grenzen des geöffneten Gefäßsegment zu sichern, um zu blockieren, so dass das Schiff bildet ein flaches Rechteck. HINWEIS: Mikropinlösung Spitzen sollten bis 90 ° gebogen und bündig mit der Blockoberfläche eingesetzt werden. Es sollte darauf geachtet werden, um das Schiff Zubereitung ohne Überdehnung strecken; endgültige Breite sollte ~ 1,5 Mal die Start ungedehnten Breite werden.
- Bereiten ein kleines Volumen (ca. 1 ml) von Fluo-4.00 Beladungslösung durch Mischen von Fluo-4 AM (10 &mgr; M), gelöst in DMSO mit Pluronic (0,03%) in einer HEPES-gepufferten PSS (enthaltend in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 Glucose) und stecken Sie den ganzen Block in die Ladelösung für etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit.
- Nach dem Laden, waschen Sie den Block in HEPES gepuffertPSS für 5-10 min.
- Montieren Sie den Block auf 50-100 um dicken Abstandshalter in einem Deckglas untere Kammer enthält HEPES gepuffert PSS. HINWEIS: Metallstifte können als Abstandhalter verwendet werden, und sicherzustellen, dass das Gefäßsegment nach unten und in die Abstandshalter nicht berühren.
- Setzen Sie die Kammer auf der Stufe eines inversen Mikroskops für die konfokale Bildgebung ausgestattet ist, und sich auf die endotheliale Zellschicht.
- Capture-Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen der basalen relativen Fluoreszenz für ~ 3 min bei 20-facher Vergrößerung und einer Bildrate von ~ 8 Bilder pro Sekunde mit der konfokalen Bildsequenzerfassung Software.
- Nach ca. 3 Min. Aufzeichnungs basale Fluoreszenz, ersetzen HEPES gepuffert PSS-Lösung mit dem gleichen Volumen (~ 1 ml) von Substanz P (100 pM) in HEPES gepuffert PSS und Rekord für eine addtional 3 min.
2. Automatisierte Analyse
- Render-Bild-Sequenz (en) von fluoreszierenden Kalzium-Aktivität aus konfokalen Erfassungssoftware als 8-Bit-, grayscale. "tif"-Format-Dateien ohne angelegte Informations.
- Offene ImageJ, klicken Sie auf "Öffnen" im Datei-Menü, und wählen Sie die entsprechende Bildsequenz in der Explorer-Fenster, um die Bildsequenz (en) in ImageJ anzuzeigen.
- Bestimmen Sie einen entsprechenden ROI Durchmesser mit Hilfe der rechteckige ROI-Tool, um die oberen und unteren Grenzen der räumlichen Ausbreitung der Aktivität innerhalb der Bildsequenz (en) zu schätzen. HINWEIS: Die mittlere rechteckige Durchmesser ist die richtige Wahl für ROI Durchmesser.
- Erstellen Sie einen neuen Ordner auf der Festplatte des Computers, und fügen Sie die Bildsequenz (en) in den Ordner-Verzeichnis.
- In ImageJ, klicken Sie auf das Fenster "Plugins", dann klicken Sie auf "LC_Pro ', um die Analyse zu starten.
- Geben Sie den Durchmesserwert ROI und wählen Sie den Filter Schwellenwert (entweder 0,05 oder 0,01).
- Klicken Sie auf die "Drogenbehandlung" Kästchen und unmittelbar vor und nach der Droge wurde hinzugefügt (in Sekunden) in die Zeitpunktwerte.
- Klicken Sie auf "OK", undgeben Sie die Bildsequenz-Verzeichnis in den Datei-Explorer-Fenster.
3. Grafische Ausgabe
- Laden R-Version 3.0.2 von http://www.r-project.org/ .
- Öffnen Sie die 32-Bit-Version von R.
- Klicken Sie auf "Datei", dann "Open Skript" und wählen Sie die 'traceplot.R "R-Skript zur Erzeugung grafischer Versuchsberichte.
- Installieren Sie die Kalibrierung, und gplots Pakete mit 'Pakete', 'Installieren von Paketen ", und die Auswahl der zweckdienlichen Pakete.
- Klicken Sie auf "Datei", dann "change directory"-Befehl, und verwenden Sie das Explorer-Fenster auf das Verzeichnis, das auf die Analyse LC_Pro Ausgang entspricht wählen.
- Klicken Sie auf das Skript-Fenster und dann die 'laufen alle "zu befehlen, das Skript auszuführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine benutzerdefinierte Algorithmus, LC_Pro, wurde entwickelt und umgesetzt, um die automatisierte Analyse von Ca 2 + durchführen Dynamik auf konfokalen Bildsequenzen. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, nutzt sequentielle Verarbeitungsmodule, die A) erkennen und von dynamischen Websites Spur Ca 2 + der Algorithmus ändern statistischen oben (p <0,01) Lärm, B) definieren Regionen von Interesse (ROI) automatisch am aktiven Zentrum Zentren und C) Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten bei ROIs auf bestimmte Ereignisparameter zu bestimmen. Eine grafische Übersicht des Algorithmus wird unter Verwendung computergenerierte Gauß-Impulsen mit bekannter Intensität und Lage (Fig. 2) gezeigt. Signalimpulse (2A und B) wurden umgewandelt zu Binär mit der z-Score für eine Standardnormalverteilung, und Best-Fit-Ellipsen wurden Pixel Loci über Signalschwelle (2C) zugeordnet. Eine Ellipse Sortieralgorithmus wurde Bestimmung verwendetne optimale Platzierung ROI (2D). ROI mittlere Intensität gegen die Zeit wurde dann gemessen und Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung berechnet wurden (Abbildung 2E). Diese Analyse-Ansatz wurde angewandt, um zelluläre Ca 2 +-Dynamik in intakten vaskulären Endothel beurteilen. Insbesondere wurde konfokale Bildgebung geöffnet Schweine Koronararterien wie in Fig. 3 beschrieben, durchgeführt, und der Algorithmus wurde verwendet, um verschiedene offline Ca 2 +-Parameter zu quantifizieren. Für diese Experimente wurden durchgehenden Aufnahmen vor und nach Zugabe der Endothelzellen Stimulus, Substanz P hergestellt (SP, 100 pM), und anschließend wurde LC_Pro Analyse durchgeführt. Für die Skalierung Signal in jeder ROI wurden Basislinien als lineare Regressionen der ROI Intensität über den Versuchszeitverlauf (Abbildung 4) abgeleitet. Bedeuten Signalintensitätswerte wurden für jede ROI (4A) berechnet wird, und Werte über dem Mittelwert waren trunc ATED dem Mittelwert und eine lineare Regression durchgeführt, um Grundliniensignal (4B) anzunähern. Schließlich wurden rohe Intensitätswerte durch den Wert der Regressionslinie, um Werte zu konvertieren Änderung über der Basislinie (Fig. 4C) zu falten unterteilt. Fig. 5 zeigt ein repräsentatives Experiment, einschließlich der Bilder von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz im Endothel (5A), akkumulieren binäre Masken der gesamten Ca 2 + in der Stichprobe Feld (5B) erfassten Signals, und Aufnahmen der durchschnittlichen Fluoreszenz bei jedem ROI (5C) vor und nach SP Behandlung. Anschließende Parameteranalyse wurde durchgeführt unter Verwendung von R-Software. Resultierende Histogramme zeigen den Verstärkungseffekt der SP auf Ereignis Amplitude, Dauer und räumliche Ausdehnung (Abbildung 6).
560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Abbildung 1. Signalflussdiagramme der Algorithmus Prozesse (diese Zahl wurde mit Genehmigung von Francis et al.) 24. Bildverarbeitung, Ereignisverarbeitung, und die Region of Interest (ROI)-Verarbeitung: Der Algorithmus wurde in drei Abschnitte gegliedert. Bildsequenzen werden in die Durchflusskette und Ereignisstatistiken werden als endgültige Ausgabe erzeugt. Die Bildverarbeitungs-(A)-Unterroutine des Algorithmus wandelt die Eingangsbildsequenz in eine Liste von Best-Fit-Ellipsen durch Schwellen, mit der z-Score für eine Standardnormalverteilung und Partikelanalyse ImageJ. Ereignisverarbeitung (B) ist ein Sortierunterprogramm verwendet werden, um die optimale Position ROI durch die Organisation von Ellipse Standorten in Event "Websites" von Zeit zu bestimmen. Nach bedeuten Intensitätsmessungen werden an jedem ROI genommen werden statistische Parameter für jede Veranstaltung und Ort durch den ROI Verarbeitungsprogramm (C <berechnet/ Strong>), um die endgültige Ausgabe zu erzeugen. BKGD, Hintergrund; AVG, Durchschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Demonstration automatisierter ROI Erfassung und Signalerfassung unter Verwendung eines computergenerierten Gauß-Impuls (diese Zahl wurde mit Genehmigung von Francis et al angepasst.) 24. Ein einzelner Computer-generierte Impulssignal (A) wurde in zufälliger Hintergrundrauschen eingebettet. Der Graubildfolge wurde filtriert, um statischen Hintergrund Pixelwerte (B) entfernen und umgewandelt zu Binär mit Schwellenpixelintensitätswerte von P <0,05 durch den Standard-Score (C) berechnet. ImageJ Partikelanalyse Algorithmusms wurden dann der Bildfolge angewendet, um am besten passenden Ellipse Pixelorte in jedem Rahmen zugeordnet werden. Ein neuartiger Algorithmus zur Gruppe Ellipsen in diskrete zeitliche "Events" verwendet, und bestimmen Sie die optimale Position für jede ROI auf Basis des Durchschnittsmittelpunktes (D). Ein ROI von Benutzer-definierten Radius wird dann an jeder Position (gestrichelter Kreis) gegeben. Mittlere Intensitätswerte innerhalb einer ROI für jeden Rahmen berechnet und skaliert unter Verwendung einer linearen Näherung Basis. Peak-Amplitude als lokale Maxima über P <0,05, die als mit dem Standardwert für einen entsprechenden ROI-Tracing (E) definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Porci ne koronare Herz Dissektion Protokoll. Ca. 0,5 mm Durchmesser x 8 mm Länge Zweige der linken vorderen absteigenden Koronararterie (1. Bild, gestrichelten Kreis) aus dem umgebenden Myokard seziert. Gefäßsegmente wurden von umliegenden Gewebe befreit Adventitia und schneiden Länge nach mit einer kleinen Schere (2. Bild). Anschließend wurden die Gefäße geöffnet flach zu einem PDMS-Block mit feinen Wolframdrähte (3. Bild) steckte. Montiert Gefäßsegmente wurden mit Fluo-4 Ca 2 +-Indikatorfarbstoff beladen, gewaschen und dann in einer Deckglasboden Imaging-Kammer gestellt. Die Bilder wurden bei 20facher Vergrößerung bei 8,0 Bildern pro Sekunde mit einem inversen konfokalen Mikroskop gesammelt (488 ex., 510 em.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Abbildung 4. ROI mittlere Intensität Basis Näherung. Nach der mittleren Intensität gegen die Zeitmessung (durchgezogene Linien) für jede ROI, werden die rohen Intensitätswerte F/F0 skaliert mit dem folgenden Grundlinie Näherungsverfahren. Die mittlere Signalintensität (gestrichelte Linie) während der Kontrollperiode vom Benutzer definierte Kontroll-und Behandlungsintervallwerte (A) berechnet. Die zeitabhängige Signalintensität-Kurve wird dann über dem mittleren Intensitätssteuerung zur mittleren Steuer Intensität abgeschnitten, um die Aktivität gegenüber dem Ausgangs Angleichung filtern, und eine lineare Regression wird auf der resultierenden Kurve (gepunktete Linien) (B) durchgeführt. Schließlich werden die Roh-Intensitätswerte der berechneten linearen Basislinie (C) skaliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Repräsentative Ergebnisse aus LC_Pro Analyse der basalen und stimulierten Ca 2 +-Dynamik. Zeitrafferbilder eines Eingangsbildsequenz einer basalen Abtastintervall (A, links), gefolgt von einem Substanz P-stimulierte Abtastintervall (A, rechte Tafel ) werden in Graustufen dargestellt. Zeitraffer-Bildsequenzen am besten geeignet Ellipsen für basale und stimulierte Intervalle (B) wurden durch LC_pro gerendert. Schließlich werden die zeitabhängigen skalierten Intensitätskurven von einander automatisch positioniert Region von Interesse (ROI), (C) gezeigt.
Abbildung 6. Histogrammeder Parameterverteilungen aus einem repräsentativen Experiment (Abbildung 4). Histogramme von Parametern der Spitzenamplitude (F/F0), P-stimulierte (rechte Spalte) Ereignisse von einem repräsentativen Experiment wurden Dauer bei ½ max (s), und die maximale räumliche Ausdehnung (&mgr; m 2) der beiden Steuer (linke Spalte) und Substanz gerendert mit R grafisch verarbeiten die Ausgabe von LC_pro. Insbesondere expandierte Substanz P Stimulation die Anzahl der Ereignisse, und verursachte eine signifikante Rechtsverschiebung in der Mittel Amplitude und Dauer von Mann-Whitney-U-Test (p <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Entschlüsselung komplexer Ca 2 +-Signale auf zellulärer Ebene und mehrzelligen strengen experimentellen und analytischen Ansätze erfordern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, bei dem zeitaufgelöste konfokale Bildsequenzen von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz an einer automatisierten Analyse identifiziert und quantifiziert statistisch relevanten Ca2 +-Signale in intakten Zellfelder Im speziellen Fall dargestellt unterworfen, wurde isoliert eine Arterie Segment aus Schweineherz, merken geöffnet, um das Endothel, mit dem Ca 2 +-Indikator Fluo-04.00 Uhr geladen, um konfokale Bildgebung unterzogen aussetzen, und mit der benutzerdefinierten Algorithmus LC_Pro ausgewertet. Dieser Algorithmus wird auf 1 entworfen) zu erfassen und verfolgen Websites von dynamischen Ca 2 + über statistische ändern (p <0,01) Lärm, 2) definieren Regionen von Interesse (ROI) automatisch am aktiven Zentrum Zentren, und 3) analysieren durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten bei ROIs Um bestimmte Parameter zu bestimmen. Der Ansatzwindet wesentliche Einschränkungen der biologischen Signalforschung, indem Benutzer Fehler und Verzerrungen, die Offline-Analyse der Zeit stark reduziert, und die Bereitstellung einer kompletten Index der Signale über ein Feld, um repräsentative Profile oder Muster zu erkennen. Die Ausgabe von LC_Pro wird weiter durch R-Skripts und bietet Full-Parameter Berichte für einzelne Experimente, darunter hochwertige grafische Ausgabe.
Mehrere Schritte sind für die ordnungsgemäße Erfüllung der beschriebenen Technik wichtig. Die Gewebedissektion Verfahren (Schritt 1.1.1) müssen sorgfältig um Entblößung oder Beschädigung des endothelialen Zellschicht zu vermeiden geführt werden. Zusätzlich müssen Bildsequenzen im richtigen Format (Schritt 2.1) für die automatisierte Region von Interesse Algorithmus korrekt arbeiten. Zum Beispiel, wenn es Stufeninformation mit der Datei verknüpft, Regionen von Interesse korrekt nach der Pixelpositionen gebracht werden, anstatt die Einheit skaliert Standorten. Auch die Wahl eines geeigneten WiederRegion von Interesse Durchmesser ist entscheidend für die korrekte Ausführung automatisierte Analyse des Fluoreszenzaktivität innerhalb einer Bildsequenz. Ein zu kleiner Durchmesser-Wert kann in redundanten Messungen führen, während eine zu große Durchmesser wird unter Ausschluss des subtilen Signale führen.
Mögliche Fallstricke dieser Technik in erster Linie, um die Empfindlichkeit der automatisierten Analyse von Verschiebungen in der aufgezeichneten Bildsequenzen xy und um zu signalisieren, Sättigung und / oder Bleich, was falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen kann, beziehen. Dimensional Drifts oder Verschiebungen können direkt durch den Einsatz von Software-Stack Anmeldung und genaue Bezeichnung der Intervalle, wo Störungen eingeführt werden, angesprochen werden. Graustufen-und ROI-Parameter Durchmesser kann auch für eine bestimmte Vorbereitung im Vorfeld der Datenerhebung, um Rohdatensätze zu standardisieren optimiert werden.
Weil es als Standard-Ansatz für jede dynamische Fluoreszenzsignal dient, beschrieben die Analyse here eignet sich für ein breites Einsatzkörpers. In dem Gefäß wird dieses Verfahren eingesetzt, um charakteristische physiologische und pathophysiologische Signal Modalitäten in mehreren Gefäßbetten unter basalen und stimulierten Bedingungen definieren 25,26. Es wird auch in der automatisierten Verfolgung von Ca 2 +-Wellen angewandt. Letztlich werden solche globalen automatisierte Analyse eine wichtige Stütze bei der Entschlüsselung zeitlich und räumlich komplexen bio-Signale und in den Aufbau neuer Zell-und Mehrzellen-Modelle sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Institutes of Health unterstützt Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 und MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H.
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al.
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P.
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al.
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
